一种基于丝网印刷碳电极的传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于丝网印刷碳电极的传感器的制备方法及应用，属于生物传感器技术领域。
【背景技术】
[0002]农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药对环境污染造成的损失是多方面的，包括对水环境的污染，对土壤的污染，对大气的污染，对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识，片面追求产量，造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在农药残留问题，其危害也日益引起公众的关注。我国是一个农业大国，随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药(约占70% )，其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂为70%左右，因此容易引起食物农药残留中毒。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，而农药残留检测的重点应该放在有机磷和氨基甲酸酯类农药。
[0003]目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、液相色谱仪、气质联用仪等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法(农残快速检测仪)，可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。电化学传感器的实际应用中，因为实际样品的复杂性，传感器存在着“电极中毒”的现象，使传感器的表面容易受到破坏，因此，近年来普遍研宄一次性传感器以消除检测过程对于电极本身的污染。
[0004]壳聚糖具有优良的官能性和相容性，可以作为固定大分子蛋白质的材料，用来制备稳定性和灵敏度高的电化学生物传感器。多壁碳纳米管是一种完美的碳纳米材料，具有特殊热性能和机械性能，并且具有高比表面积和优异的导电性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供了一种结构简单、操作方便、成本低且检测灵敏度高的丝网印刷电极生物传感器制备方法，采用的技术方案如下:
[0006]一种基于丝网印刷碳电极的传感器的制备方法，其特征在于:是将制备好的多壁碳纳米管(MWCNTs)-二氧化锡(Sn02)_壳聚糖(CHIT)复合物滴涂到经过清洗活化的丝网印刷碳电极(SPE)表面，获得修饰电极，再将乙酰胆碱酯酶(AChE)滴涂到修饰电极的表面，干燥清洗后获得基于丝网印刷碳电极的乙酰胆碱酯酶生物传感器(AChE/MWCNTs-Sn02-CHIT/SPE)。
[0007]所述方法步骤为:
[0008]I)制备多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖复合物；
[0009]2)清洗、活化丝网印刷碳电极，获得预处理丝网印刷碳电极；
[0010]3)将步骤I)制备的多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖溶液滴涂在步骤2)的预处理丝网印刷碳电极表面上，得到修饰碳电极；
[0011]4)将乙酰胆碱酯酶滴涂到步骤3)所得修饰电极的工作电极表面上，干燥清洗后获得基于丝网印刷碳电极的乙酰胆碱酯酶生物传感器。
[0012]步骤2)所述丝网印刷碳电极，包括印制电极的基片，印制于基片上的外部绝缘层和至少两根电极引线，基片印制有三个电极，分别为一个工作电极、一个对电极及一个参比电极，各电极对应连接有一电极引线。
[0013]步骤2)所述清洗、活化丝网印刷碳电极，过程是:首先，将丝网印刷碳电极置于NaOH溶液中超声，超纯水冲洗，N2吹干，其次，将电极置于HCl溶液中超声，超纯水冲洗，N2吹干，再次，用无水乙醇冲洗电极，N2吹干，最后，在磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线，之后扫描循环伏安曲线直至性能稳定。
[0014]步骤3)所述在预处理电极表面滴涂多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖溶液，是将5?10 μ L的多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖纳米复合物滴涂在预处理丝网印刷碳电极上，在空气中干燥，用超纯水冲洗表面，将未固定在电极表面的复合物冲洗掉，得到多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖修饰的丝网印刷碳电极。
[0015]步骤4)所述在工作电极上滴涂乙酰胆碱酯酶，是滴涂5?10 μ L的IU/ μ L乙酰胆碱酯酶溶液，并在4°C下干燥2h，之后用pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的酶，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器。
[0016]所述方法具体步骤如下:
[0017]I)在50mL 1.0%乙酸溶液中加入0.1g壳聚糖，配制成0.2%壳聚糖溶液，将3mg多壁碳纳米管和Img二氧化锡加入到4mL新配制的0.2%壳聚糖溶液中，通过超声处理直到均匀分散，将制备好的多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖纳米复合物在4°C下存储；
[0018]2)将丝网印刷碳电极置于ImM NaOH溶液中超声5min，超纯水冲洗，N2吹干，将电极置于ImM HCl溶液中超声5min，超纯水冲洗，N2吹干，用无水乙醇冲洗电极，N2吹干，在pH5.0磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线300s，扫描循环伏安曲线直至性能稳定，得到预处理丝网印刷碳电极；
[0019]所述丝网印刷碳电极，包括印制电极的基片，印制于基片上的外部绝缘层和至少两根电极引线，基片印制有三个电极，分别为一个工作电极、一个对电极及一个参比电极，各电极对应连接有一电极引线。
[0020]3)将5?10 μ L的步骤I)制备的多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖纳米复合物滴涂在步骤2)所得的预处理丝网印刷碳电极上，在空气中干燥，用超纯水冲洗表面，将未固定在电极表面的复合物冲洗掉，得到多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖修饰的丝网印刷碳电极；[0021 ] 4)滴涂5?10 μ L的IU/ μ L乙酰胆碱酯酶溶液到步骤3)所得修饰电极的工作电极表面上，并在4°C下干燥2h，用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的酶，获得乙酰胆碱酯酶生物传感器，在4°C干燥环境下保存备用。
[0022]本发明所述方法适用于检测有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，尤其适合用于检测毒死蜱的检测。
[0023]所述方法，其特征在于:多壁碳纳米管-二氧化锡-壳聚糖纳米复合物的合成，丝网印刷碳电极的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性以及乙酰胆碱酯酶传感器对样品回收率的测定。
[0024]所述制备方法，其特征在于:所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测毒死蜱的浓度范围为0.05?I X 15 μ g/L，检测限为0.05 μ g/Lo
[0025]所述方法制备原理为:由于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传