使用间变性淋巴瘤激酶(alk)作为标志物鉴定治疗响应性非小细胞肺癌的方法
【专利说明】使用间变性淋巴瘤激酶（ALK)作为标志物鉴定治疗响应性 非小细胞肺癌的方法
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月24日提交的美国临时申请No. 61/704,960的权益，通过 提及将其完整收入本文。 发明领域
[0003] 本申请涉及用于非小细胞肺癌预后的方法，特别是确定非小细胞肺癌是否预测为 响应间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase)抑制剂的方法的实施方案。
[0004] 发明背景
[0005] 间变性淋巴瘤激酶（ALK)蛋白是受体酪氨酸激酶胰岛素受体超家族的一个成员。 ALK是一种通常仅在神经系统中表达的I型膜糖蛋白。在非小细胞肺癌（NSCLC)细胞系和 存档的临床标本中发现了染色体2p内的倒位，其导致包含ALK基因和棘皮动物微管关联蛋 白样4 (EML4)基因的部分的融合基因产物的形成（Soda等，Nature 448:561-566,2007)。 现在公认ALK为NSCLC中的重要参与者，并且虽然EML4是主要的融合配偶体，但是已经鉴 定出其它融合配偶基因。ALK基因重排的发生率的范围表现为2-7%，转化成在美国的约 6, 000例ALK阳性患者/年和全世界的约40, 000例患者/年。重要地，ALK基因重排很少 与EGFR、HER2、或KRAS突变同时发生，证明了 ALK阳性是一种独特的疾病亚型。
[0006] 克唑替尼（crizotinib) (XALKORI，Pfizer)是一种抑制ALK的有力受体酪氨酸激 酶抑制剂。在两项临床试验中，用克唑替尼治疗的ALK阳性局部晚期或转移性NSCLC患者分 别展现出 50% (N = 136 ;95% CI:42%，59% )和 61% (N = 119 ;95% CI:52%，70% )的 总体响应率。如此，测定NSCLC患者中的ALK状态对于指导患者护理是至关重要的。然而， 仍然需要一种快速且精确鉴定最可能响应克唑替尼治疗的NSCLC患者的特异的、灵敏的且 标准化的ALK状态测定法。
[0007] 发明概述
[0008] 本文中公开了用于将受试者鉴定为具有预测为响应ALK抑制剂（例如克唑替 尼）治疗的NSCLC的方法的实施方案。所述实施方案包括使用本文中公开的免疫组织化 学（IHC)和评分方法将包含NSCLC肿瘤细胞的样品鉴定为ALK阳性或ALK阴性。若样品鉴 定为ALK阳性，则将受试者鉴定为具有可能响应ALK抑制剂治疗的NSCLC，且若样品鉴定为 ALK阴性，则将受试者鉴定为具有可能不响应ALK抑制剂治疗的NSCLC。在一些例子中，将 样品用抗ALK抗体标记，而且若样品中存在至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞， 则将样品鉴定为ALK阳性。
[0009] 所公开的方法的一些实施方案还包括选择具有ALK阳性NSCLC肿瘤的受试者用 ALK抑制剂治疗。所公开的方法的别的实施方案还包括治疗鉴定为具有预测为响应治疗的 NSCLC的受试者，诸如通过对具有ALK阳性NSCLC肿瘤的受试者单独或与其它已知或未来开 发的治疗组合施用ALK抑制剂（诸如克唑替尼）。
[0010] 公开内容的前述和其它特征从参考附图进行的以下详细描述看会变得更为显而 易见。
[0011] 附图简述
[0012] 图IA和IB是两种例示性ALK阳性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色 (左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色（右侧小图）上的同质ALK IHC表达。
[0013] 图2A-C是三种例示性ALK阳性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色（左 侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色（右侧小图）上的异质ALK IHC表达。抗 ALK染色样品中存在强细胞质染色，但是强度有所变化。
[0014] 图3是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中的腺上皮细胞中的 点状颗粒染色（左侧小图）。在匹配家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中看到不太明显的腺上 皮细胞染色（右侧小图）。腺上皮染色存在于正常组织成分而非癌细胞中，并且在载玻片解 读中排除。
[0015] 图4A是数字图像，其显示了用抗ALK (D5F3)抗体染色的样品中明显的神经元组织 成分的染色（左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中染色的缺乏（右侧小 图）。图4B是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中（左侧小图）及匹配 的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中（右侧小图）的神经组织的染色。在载玻片解读中排 除染色，因为它存在于正常的组织成分或细胞中。
[0016] 图5是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中的肺泡巨噬细胞中 存在的颗粒点刻（左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中染色的缺乏（右 侧小图）。在载玻片解读中排除此染色，因为它存在正常细胞，而非肿瘤细胞中。
[0017] 图6A是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中（左侧小图）及匹 配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中（右侧小图）的粘蛋白染色。正常组织和肿瘤细胞 中没有染色，因此此样品解读为ALK阴性。图6B是数字图像，其显示了用抗ALK (D5F3)抗 体染色的样品中（左侧小图）及匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中（右侧小图）的 粘蛋白染色。此样品解读为ALK阳性，因为正常组织是阴性，但是肿瘤细胞是染色的。
[0018] 图7A和B是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中一些淋巴细胞 的染色（左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中不太明显的（图7A)或阴 性（图7B)染色（右侧小图）。在载玻片解读中排除此染色，因为它存在于正常细胞中。
[0019] 图8A和B是两种例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了在抗ALK (D5F3)染色 (左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色（右侧小图）上肿瘤细胞中ALK IHC表 达缺乏。
[0020] 图9A和B是例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了抗ALK (D5F3)染色（左侧 小图）和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色（右侧小图）两者上的弱颗粒细胞质染色。
[0021] 图10A-D是例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了抗ALK (D5F3)染色上的细 胞质染色（左侧小图），其比在匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色（右侧小图）上更明显。 该病例由于缺乏强细胞质染色而被解读为ALK阴性。
[0022] 图11是用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品（左侧小图）和匹配的家兔单克隆阴性 对照Ig载玻片（右侧小图）中的膜/细胞质染色的数字图像。虽然染色在用抗ALK抗体 比用阴性对照染色的载玻片上更普遍，但是由于其不是强颗粒细胞质染色，结果解读为ALK 阴性。
[0023] 发明详述
[0024] I.缩写
[0025] ALK 间变性淋巴瘤激酶
[0026] DAB 3, 3' -二氨基联苯胺四氢氯化物
[0027] FISH 荧光原位杂交
[0028] H&E 苏木精和曙红
[0029] HQ 3-羟基喹喔啉-2-羧酸
[0030] HRP 辣根过氧化物酶
[0031] IHC 免疫组织化学
[0032] NSCLC 非小细胞肺癌
[0033] II.术语
[0034] 提供术语和方法的以下解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人 员实施本公开内容。单数形式"一个"、"一种"和"所述/该"指一个/种或超过一个/种， 除非上下文另有明确指示。例如，术语"包含抗体"包括单数或复数种抗体，并且认为等同 于短语"包含至少一种抗体"。术语"或"指陈述的备选成分的单一成分或两种或更多种成 分的组合，除非上下文另有明确指示。如本文中使用的，"包含"意指"包括"。如此，"包含 A或B"意指"包括A、B、或A和B"，而不排除别的成分。本文中提及的GenBank登录号的日 期是至少早在2012年9月24日可得到的序列。
[0035] 除非另有解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通 技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法 和材料可以在本公开内容的实践或测试中使用，但是下文描述了合适的方法和材料。材料、 方法和例子仅是例示性的而并不意图为限制性的。
[0036] 为了促进公开内容的各个实施方案的审阅，提供了具体术语的以下解释：
[0037] 间变性淋巴瘤激酶（ALK):受体酪氨酸激酶的胰岛素受体超家族的成员。ALK包 含胞外域、单次跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。在几种肿瘤类型，包括间变性大细胞淋巴瘤、 成神经细胞瘤、和非小细胞肺癌中找到导致ALK融合基因的染色体重排。ALK/EML4是最常 见的 ALK 基因融合；别的 ALK 融合包括 ALK/RANBP2、ALK/ATIC、ALK/TFG、ALK/NPM1、ALK/ SQSTMl、ALK/KIF5B、ALK/CLTC、ALK/TPM4、和 ALK/MSN。
[0038] ALK序列公开可获自例如GenBank?序列数据库（例如登录号NP_004295(蛋白 质），和NM_004304(核酸））。本领域普通技术人员可以鉴定别的ALK核酸和蛋白质序列， 包括ALK变体和/或ALK基因融合。
[0039] ALK抑制剂是一种抑制或降低ALK活性，诸如ALK酪氨酸激酶活性的分子。在一些 例子中，ALK抑制剂可以是小分子、蛋白质（诸如抗体）、或核酸（诸如反义分子）。ALK抑 制剂可以抑制或降低配体（诸如多效蛋白）对ALK的结合，并且如此降低ALK酪氨酸激酶 活性。ALK抑制剂也可以直接抑制或降低ALK酪氨酸激酶活性，例如ATP竞争性抑制剂（诸 如克唑替尼）。降低或抑制ALK表达的分子，诸如反义分子也是ALK抑制剂。在一些例子 中，ALK抑制剂抑制或降低经遗传改变的ALK，诸如ALK基因融合（包括但不限于ALK/EML4 基因融合）的活性。ALK抑制剂可以特异性抑制ALK酪氨酸激酶活性或者在抑制ALK酪氨 酸激酶活性外可以抑制其它受体酪氨酸激酶活性（诸如c-Met/HGFR活性）。
[0040] 抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，也就是说，含有特异 性结合抗原（诸如ALK)(与其起免疫反应）的抗原结合位点的分子。例示性的抗体包括单 克隆、多克隆、和人源化抗体。
[0041] 天然存在的抗体（诸如IgG、IgM、IgD)包括四条多肽链，即通过二硫键互相连 接的两条重（H)链和两条轻（L)链。如本文中使用的，术语抗体还包括通过在细胞中表 达编码一条或多条抗体链的核酸生成的重组抗体（例如参见美国专利No. 4, 745, 055 ;美 国专利 No. 4, 444, 487 ;W0 88/03565 ;EP 256, 654 ;EP 120, 694 ;EP 125, 023 ;Faoulkner 等，Nature 298:286, 1982 ;Morrison, J