基因变异分析装置、基因变异分析系统以及基因变异分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因变异的分析方法以及基因变异的分析装置、分析系统、分析方法。特别涉及以下的分析装置、分析系统、分析方法，其对从目标基因的核酸样本得到的荧光强度波形数据进行分析来进行与核酸样本的碱基排列坐标位置的各碱基种类的存在有关的分析。
【背景技术】
[0002]作为解读DNA碱基排列的方法，广泛使用应用了桑格法的组合了核酸的片段化技术、核酸片段的荧光标记技术、高分辨率的电泳技术、以及高灵敏度的荧光检测技术的DNA序列法。
[0003]上述DNA序列法首先准备希望解读碱基排列的DNA (模板DNA)，使用具有与模板DNA的一部分排列互补的排列的引物来进行模板DNA的复制反应。这时，当在反应溶液中将双脱氧核苷酸作为锁定核苷酸按照预定的比例与脱氧核苷酸一起混合时，合成反应在双脱氧核苷酸的取入位置停止，因此生成各种碱基长度的核酸片段。在此，如果使用对于每种碱基不同的颜色的荧光色素对引物或双脱氧核苷酸进行标记，则各核酸片段被与其末端碱基对应的色素标记。通过使用毛细管电泳装置等使如此制成的核酸片段泳动，来分离为每个碱基长度。在泳动的终端向核酸片段照射激光，通过检测器测定从各片段的末端碱基产生的荧光。在电泳中越短的核酸片段移动越快，因此作为随时间的荧光测定数据，得到与碱基排列对应的荧光强度波形数据。
[0004]使用了上述DNA序列法的DNA序列器是通过对荧光强度波形数据的各峰值位置的4种荧光信号的强度进行比较来决定碱基排列的装置。
[0005]已知在人等的染色体组的碱基排列中，存在被称为单碱基多态性的基因变异。将具有从上代向下代遗传的性质的先天的基因变异称为生殖细胞系列变异。包含人在内的许多生物的染色体组由二倍体构成，因此关于生殖细胞系列变异，在个体内或细胞内，分别以50%的比例存在2种碱基。在通过上述DNA序列器分析存在这样的单碱基多态性的区域的情况下，在荧光强度波形数据的对应于单碱基多态性的位置，同时检测出相当于2种碱基的焚光信号峰值。
[0006]但是，在上述序列法中，偶尔得到难以判定上述多态性、难以决定碱基排列的荧光强度波形数据。作为其原因，可以考虑核酸样本的量少信号强度弱的情况、由于核酸片段的高次构造等产生多余的信号成分的情况、由于化学处理时、电泳时的条件信号产生失真的情况等。
[0007]在实际决定核酸样本的碱基排列时，如调查某特定基因的基因变异的情况那样，该核酸样本的碱基排列的至少一部分已知的情况并不少。在存在这样的已知的碱基排列的情况下，能够通过某种方法参照从已知的碱基排列得到的荧光强度波形数据的信息来对新取得的荧光强度波形数据进行解释。在存在这样的已知的碱基排列的情况下，如专利文献1、专利文献2公开的那样，能够通过某种方法参照从已知的碱基排列得到的荧光强度波形数据的信息来对新取得的荧光强度波形数据进行解释。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:日本特开2002-055080号公报
[0011]专利文献2:日本特开2005-031051号公报
【发明内容】
[0012]发明要解决的问题
[0013]由于近年来的染色体组分析技术的发展，搞清楚了人的各种疾病和基因变异的关联性，灵活运用基因信息来开发医药品。例如，关于癌，基因变异是其发病的主要原因，对于部分治疗药品的选择、处方量的决定，应用患者个人的基因检查已经成为保险项目。
[0014]相对于前面记载的生殖细胞系列变异，将由于癌等疾病造成的后天的基因变异称为体细胞系列变异。体细胞系列变异的特征是无法预测染色体组上的变异发生位置，另外无法预测个体内或组织内的变异存在比例。例如，在从癌症患者切除的癌组织试样中包含癌细胞和正常细胞，并且在癌细胞之间，基因变异也存在多样性，因此在某特定基因的某特定位置具有基因变异的细胞在试样中的存在比例有时非常低。因此，与生殖细胞系列变异相比，为了检测体细胞系列变异，需要更高灵敏度的检测方法。
[0015]在治疗方法、治疗药物的选择中，不只是目标基因在某特定位置的基因变异的有无，有时还将其存在比例作为指标。因此，除了基因变异的高灵敏度的检测以外，其存在比例的量化也是重要的。利用了桑格法的现有的DNA序列器以决定碱基排列为目的，因此存在以下的大问题，微量存在的体细胞系列基因变异的检测力不足，另外无法对其存在比例进行定量。
[0016]并且，作为不伴随基因排列的变异的基因表型变异之一，具有DNA甲基化修饰，已知由于细胞的发生分化、细胞癌化DNA甲基化修饰状态变化。因此，期待一种简便地检测甲基化修饰后的碱基排列的位置及其修饰比例的方法。
[0017]在前面记载的专利文献I中提示了在进行多态性的判定和决定碱基排列时，将在峰值位置具有最大的信号强度的碱基种类的信号强度作为标准化基准，来对荧光强度波形数据的各峰值位置的信号强度进行标准化处理的方法。在该标准化方法中，在该位置存在变异，并且其存在比例不恒定的情况下，无法保证各碱基种类的信号强度的定量性。
[0018]另外，在前面记载的专利文献2中，提示了将荧光强度波形数据中的全部峰值的平均强度作为标准化基准来对荧光强度波形数据的信号强度进行标准化处理的方法。但是，荧光强度波形数据中的峰值强度在波形数据整体中进行变动，另外其变动的情况在数据之间不同。因此，在将全部峰值的平均强度作为基准的标准化方法中，个别的峰值的信号强度的标准化精度不足。在专利文献2中，以决定主要的碱基排列为目的，因此标准化精度不是大的问题，但在以基因变异的检测、其存在比例的定量为目的的情况下，不足的标准化精度成为检测灵敏度降低、定量精度恶化的原因。
[0019]本发明鉴于这样的现有技术的问题点，其目的在于，针对微量存在的体细胞系列基因变异，也能高灵敏度、高精度地得到与基因变异有关的信息。
[0020]解决问题的方案
[0021]作为本发明用于解决上述课题中的至少一个课题的一个方式，使对每个碱基种类进行了标记的分析对象的核酸样本进行电泳，检测每个碱基种类的标记信号来生成检测强度的波形数据，对每个碱基种类的上述波形数据的各峰值位置选择其他的峰值位置，计算各峰值位置的信号强度相对于选择出的其他峰值位置的信号强度的相对信号强度，在各峰值位置将分析对象的核酸样本的相对信号强度和已知的核酸样本的相对信号强度进行比较，进行与核酸样本的碱基排列坐标位置的各碱基种类的存在相关的分析。
[0022]发明效果
[0023]根据本发明，实现高灵敏度、高精度地取得与目标的基因区域中存在的微量的基因变异有关的信息。
【附图说明】
[0024]图1是表示应用本发明的基因变异分析系统的结构例子的图。
[0025]图2是表示基因变异分析装置的测量部的例子的图。
[0026]图3是表示在决定碱基排列时对荧光强度波形数据进行的处理的图。
[0027]图4是表示荧光强度波形数据的例子的图。
[0028]图5是表示取得用于检测基因变异的相对信号强度信息的处理的一个例子的图。
[0029]图6是表示在已知信息数据库中保存的用于检测基因变异的相对信号强度信息的一个例子的图。
[0030]图7是表示本发明的基因变异的检测处理的一个例子的图。
[0031]图8是表示取得用于推定基因变异存在比例的相对信号强度信息的处理的一个例子的图。
[0032]图9是表示应用本发明的基因变异分析装置的结构例子的图。
[0033]图10是表示本发明的基因变异存在比例的推定处理的一个例子的图。
[0034]图11是表示在已知信息数据库中保存的用于推定基因变异存在比例的相对信号强度信息的一个例子的图。
[0035]图12是表不本发明的基因变异存在比例彳目息的显不例子的图。
【具体实施方式】
[0036]以下，参照【附图说明】本发明的实施方式。但是，本实施方式只不过是用于实现本发明的一个例子，并非限定本发明。
[0037]在图1中，表示本实施方式的基因变异分析系统的结构例子。该系统具备荧光强度波形数据测量部la、lf、控制部lb、lg、荧光强度波形数据分析部lc、已知信息数据库Id。
[0038]在图2中，表示荧光强度波形数据测量部la、lf的结构例子。荧光强度波形数据测量部la、If具备使通过荧光色素标记的核酸样本(2a)中的核酸片段进行电泳的流路(2b)、随着时间检测荧光强度的检测器(2c)。
[0039]荧光强度波形数据测量部la、lf通过进行了荧光标记的核酸片段在流路(2b)中的电泳，使用检测器(2c)取得荧光强度波形数据。这时，既可以对每个荧光色素分别进行电泳，由此单独取得各碱基种类的荧光强度波形数据，也可以混合4种荧光色素进行电泳，由此同时取得4个碱基种类的荧光强度波形数据。
[0040]在荧光强度波形数据分析部Ic中，对荧光强度波形数据进行信号处理来进行碱基排列的决定、变异的检测和定量。在荧光强度波形数据分析部Ic内，能够通过处理器解析并执行用于实现各个功能的存储在存储器中的程序，用软件来实现使用图3、图5、图7、图8、图10、图11等以后说明的荧光强度波形数据分析部Ic的各功能。另外，例如，也可以通过使用集成电路进行设计等，用硬件来实现荧光强度波形数据分析部Ic的各功能、处理部、处理单元等的一部分或全部。例如，也可以将实现各功能的程序、文件、数据库等信息放置在存储器、硬盘、SSD (固态驱动器)等记录装置、或IC卡、SD卡、DVD等记录介质中。
[0041]已知信息数据库Id存储与和碱基排列对应的荧光强度波形数据相关联的信息。控制部lb、lg进行各部间的数据转送的控制、荧光强度波形数据测量部la、lf