专利名称：无聚集和血清结合的水溶性荧光染料和相关产品及方法
介绍本发明主要涉及无聚集和血清结合的水溶性荧光染料和相关产品及方法。优选的染料包括连接到两个或更多增溶配体上的发光的基本上为平面的荧光团。
相关申请本申请要求Dandliker等于1998年11月25日申请的、标题为“无聚集和血清结合的水溶性荧光染料和相关产品及方法”的美国临时申请60/109,969的在先权益，在此将其完整地(包括附图)结合到本文中作为参考。
本发明背景将本文涉及的出版物和其他参考资料结合到本文中作为参考。以下对本发明背景的描述是为了帮助理解本发明，并不是对本发明的特征的描述或是以先有技术来构成本发明。
卟啉(porphyins)、酞菁和其他氮杂卟啉(azaporphyrin)和某些其他含氮的芳族大环化合物的近红外线吸收和发射有时使这些化合物作为用作荧光标记的具有吸引力的选择物。
酞菁，特别是由于它们较强的近红外线吸收(摩尔消光系数约200,000)、它们在有机溶剂中的高量子产额和众所周知的抵抗普通金属酞菁染料褪色的能力，使人们在利用它们作为荧光标记方面作出了许多尝试。但是，沿着这条思路的早期的尝试没有得到完全令人满意的产品，很大原因在于酞菁的非同寻常的强缔合趋势，特别是以面对面聚集体的方式进行堆积以及还很强地结合于各种其他分子表面(非特定结合(non-specific binding))。
分子内堆积的结果使未取代的酞菁在有机和水溶剂中都有极低的溶解度。正如现在所熟知的，堆积的趋势可以通过引入一种或多种带电基团(如磺酸根)得到显著降低。而具有这种取代的酞菁可以在水和电解质的水溶液中具有高溶解度，基本上保留了其非特定结合的趋势。
目前，大多数关于荧光标记的科学研究集中在涉及生物材料的应用领域，其中所述生物材料如组织切片、细胞、细胞碎片、蛋白质，包括糖蛋白和脂蛋白、肽寡-和多-糖，寡-和多-核苷酸和类脂。在涉及这些材料的荧光测定中的非特定结合的趋势可以通过部分掩蔽有关的特定相互作用来干扰。
非特定结合与堆积的趋势都可以通过将酞菁染料与一种或多种聚氧化烃基基团(polyoxyhydrocarbyl groups一般为甲氧基封端的聚(乙二醇)(PEG))偶联，将其减少到在治疗药物检测中可忽略的水平。同时，这种基团的附着保留了所需的吸收和发射特性。这种技术对于大量其他近红外线染料同样有效。参看Dandliker等人于1995年6月7日申请、标题为“用于荧光检测的聚氧化烃基相关产品和方法”的美国专利申请第08/476,544号，Lyon & Lyon Docket 211/167号(以及其中所指的在先申请)，将其完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
最近，在可发荧光的染料方面有了显著的发展。一方面，目前能够得到通过更长波长(如红光和红外光波长)的辐射激发的染料。这些染料在下述两个共同转让的专利申请中有描述。Arrhenius于1991年5月15日申请、标题为“荧光标记组分和荧光探针”的美国专利申请系列701,449号(这是1990年5月15日申请的美国专利申请523,601号的连续部分)，Dandliker和Hsu于1991年5月15日申请、标题为“无聚集和血清结合的荧光染料”的美国专利申请系列701,465号(这是1990年5月15日申请的美国专利申请系列524,212号的连续部分)。将这些申请完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
通过数据收集和分析技术在提高灵敏度方面有了更加显著的改进。如Dandliker等在标题为“荧光计”的美国专利第4,877,965号中所述(将其完整地结合到本文作为参考，包括所有附图)，将数据收集和分析技术与时间门控技术(time gating techniques)结合使用得到相对于背景改进的信号。通常，4,877,965号专利认为检测强度作为时间的函数，由来自不同来源的信号组成，包括所需的信号源和各种不需要的背景源。通过数据收集和分析技术能够实现所需信号的最佳化。
在免疫测定中对检测相关物质的能力方面也取得了显著的改进。例如，使用Dandliker等于1990年3月6日申请、标题为“过渡态(transient state)荧光测定”的美国专利申请系列490,770号(这是1989年6月13日申请的美国专利申请系列365,420号的继续部分)中所描述的技术，能够在均相测定中检测到物质的结合和游离形式，该专利被完整地结合到本文作为参考，包括所有的附图。通常，该技术要求对平行和垂直极化组分的强度随时间的衰变进行测量。通过测量不同极化状态的时间相关的衰变，在均相分析形式下能够确定物质(如半抗原、肽或小的蛋白质)的结合和游离形式。重要的是，这种技术不要求对结合和游离物质进行分离。
尽管在可发荧光的染料领域和在数据分析方面有了显著和大有希望的改进，在该技术领域仍旧需要具有这些和/或其他优势的另外的染料，并且这种染料也具有有利的化学反应性。
本发明概述本发明开发出了一种意想不到的结果即使是非常小的基团，如-OH，如果在平面分子上存在两个这样的基团，其中的一个在分子平面的任一面上，也能有效地阻止分子发生非特定结合和堆积。通过提高净负电荷增强了这些配体对许多生物体系的有利效果，这些生物体系中大多数“生物分子”自身携带有负的净电荷。
因此，本发明的一个方面在于只要染料上的净电荷足够大，通过用两个极小的轴向配体(axial ligands)(如-OH)代替将工程酞菁和其他荧光染料偶联到聚氧化烃基基团上，能够实现所需的效果。在大多数情况下，优选这种净电荷为负的，这是由于在生理学的pH范围内大多数生物物质包括蛋白质和DNA也会携带负的净电荷。因此，我们发现高度磺化的二羟基-硅-二羧基-酞菁具有几乎与PEG共扼的未磺化的染料同样低的对血清蛋白质的非特定结合。
此外，本发明的一个优势表现在不存在由PEG形成的分子团。PEG工程染料在染料浓度为10-4M和以上时，其表现非常类似于大分子，因此当其通过设计为防止约30K道尔顿或更高的分子通过的膜时受到了极大的阻碍。而且，在设计用来从小分子中分离大分子的凝胶渗透色谱法中，染料在色谱的空隙容积中移动。相反，经磺化的二羟基-二羧基-硅-酞菁(SDDSiPc)的表现正如对具有这种式量的分子所预期的那样。
至于通过改变荧光极化和强度所测得的非特定结合，当这些染料暴露于例如稀释的人体血清时，SDDSiPc的表现与PEG偶联染料(参见实施例6)大体相同。在这方面，鉴于未磺化的二羟基-二羧基-硅-酞菁(DDSiPc)表现出明显的非特定结合，很重要的一点是注意其本身的负电荷在降低非特定结合方面具有显著作用。羟基-铝-酞菁-三磺酸盐表现出对离子强度很强的敏感性，也具有很强的非特定结合。看来酞菁分子必须在其分子平面的两面上都具有轴向配体，但如果净电荷足够高时，-OH基团的是也要足够大以事实上消除非特定结合。
本发明的另一个优点在于即使被标记的分子(如蛋白质和寡核苷酸)自身带有负电荷，用-OH或其他小的增溶轴向配体与高电荷一起改造的染料似乎更具有化学活性(在标记反应中)。这表明尽管通常易于对半抗原和其他小分子进行标记，但PEG配体确实干扰了对分子的标记。
由于羟基-铝-酞菁-三磺酸盐具有很强的非特定结合，从这一点人们可推测带有较小负净电荷的二羟基-二羧基-硅-酞菁将会表现出比铝染料更强的非特定结合，因此本发明是非常出乎意料的。本发明的一部分正是基于这些表现出恰恰相反的发现上(参看
图1和2)。根据这里所报导的发现，期望其他小的轴向配体如-OCH3、-OCH2OH、-Cl、-Br和-F具有同样的效果。
许多其他含氮原子的大环可以被14族的原子金属化，而表现出相似的结果。这种大环包括卟啉、氮杂卟啉(azaporphyrin)、咕啉、sapphyrin、pentaphyrin、porphycene以及其他类似的具有广泛离域的π电子体系的大环的衍生物和结构变体。由于大环结合了许多所需性质的事实，特别优选的大环类型包括氮杂卟啉衍生物和结构变体。氮杂卟啉衍生物包括单-、二-和三氮杂卟啉和porphyrazine的衍生物。任何这些大环可以任选还含有稠合的芳环。这种氮杂卟啉衍生物和变体包括酞菁、苯并三氮杂卟啉和naphthalocyanine和它们的衍生物及它们的氧杂、硫杂或氮杂结构变体。
因此本发明涉及标记组分、荧光探针、寡核苷酸、杂交试样和使用这些产品的免疫测定和生产这些产品的方法。本发明提供了可检测的已标记的标记组分，该组分含有偶联到两个或多个通常为轴向的小增溶配体的荧光团部分，轴由中心金属原子形成的络合物的八面体几何学确定，优选这种组分可减少或消除溶剂敏感性和非特定结合的问题。
在免疫测定中使用这种可检测的标记或标记组分的优点在于在生物流体如血清存在和不存在时，这些标记的过渡态荧光发射的平行和垂直组分的强度基本上相同。因此，使用这些标记的测定方法能够检测出生物流体中低浓度的分析物、目标分析物或其类似物。术语“分析物”是指在测定中的化合物或被测量的化合物，可以是任何其受体是天然存在的或能够制备的化合物，其可以是单-或多表位(polyepitopic)、抗原的或半抗原的单一的或多个共享至少一个共同表位(epitopic site)或受体的化合物。术语“目标分析物”是指在测定中的化合物或被测量的化合物，可以是任何其受体是天然存在的或能够制备的化合物，其可以是单-或多表位、抗原的或半抗原的、单一的或多个共享至少一个共同表位或受体的化合物。目标分析物的“类似物”是指能够与目标分析物竞争结合到受体上的化合物或各种化合物。术语“受体”是指能够通过特定识别目标分析物或其类似物或被目标分析物或其类似物识别的分子或分子络合物。例如，抗体可以作为抗原的受体。
这些标记组分可以用作标记来标记分析物、抗原、抗体或其他分子。可以任选将这些标记组分功能化，使其包括连接臂，从而可将标记组分连接到分析物、抗原、抗体或其他分子上。对适合于该目的的连接臂在Kricka，J.J.的配体-结合物分析，标记和分析对策，第15-51页(纽约Marcel Dekker Inc.，NY(1985))中已有描述。使用常规技术将标记组分连接到分析物、抗原、抗体或其他分子上。
一方面，本发明提供了可检测的已标记的标记组分，其包括(1)含发光的基本上为平面分子结构的荧光团部分，优选具有至少约500nm的激发波长，和(2)偶联到(1)的荧光团部分上的两个或多个小的增溶轴向配体。优选的荧光团、小的增溶轴向配体和两者的连接的例子在本文中有详细描述。此外，提供了能证明标记组分在降低溶剂敏感性和非特定结合方面的具有有效性的证据。
在特别优选的实施方案中，本发明的标记组分能够用于制造探针，如主要在共同拥有的于1993年4月21日申请的美国申请系列08/051,446号中所描述，也可以用于免疫测定，如主要在共同拥有的1993年3月23日申请的美国申请系列08/035,633号中所述，将这两个专利的公开内容完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
本发明的标记组分可用作可检测的标记，如用作诊断试剂和测定(如荧光结合测定和其他免疫测定)中用作可检测的标记。本发明提供了可检测的已标记的标记组分，其具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的荧光团部分，在水溶液中存在血清组分时，标记组分的特征为过渡态荧光发射具有与没有血清时基本相同强度的平行和垂直组分。术语“轴向配体”是指取代基，它和大环配体一起与中心原子形成配位化合物。轴向配体垂直于由大环构成的平面。
我们认为这种分子组分在下述方法中也是有用的。由Walker等在Clinical Chemistry 421(1996)、Clinical Chemistry 399(1993)、美国专利5,593,867号和欧洲专利申请93117909.7中所述方法，将它们完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
令人惊讶的是，我们发现本发明的具有偶合了两个小的增溶轴向配体的大环多齿配体，其中一个轴向配体位于所述多齿配体平面的任一侧的标记组分表现出显著降低的对于血清组分的非特定结合，并表现出可忽略的溶剂敏感性。术语“溶剂敏感性”是指分子的荧光性能取决于所用的溶剂体系而改变，尤其是指与有机溶剂(如DMF)相比，在水溶液中的荧光性能方面的差异。许多在有机溶剂(如DMF)中表现出高荧光强度的荧光团在水溶液中表现出大为降低的荧光强度。荧光强度与试样浓度和激发辐射的强度有关。具体的染料的荧光强度可与其特征光吸收系数(消光系数)和荧光量子效率、以及环境因数有关。这些标记组分也表现出增强的衰变时间，该时间接近它们的辐射寿命或未猝灭寿命。我们使用的术语“衰变时间”通常是指将受激原子的浓度由其原始浓度降低到该值的1/e所必需消耗的时间。对于“寿命”一词的使用不同于，如Demos，J.N.，受激态寿命测量(Excited State Lifetime Measurements)，Academic Press，纽约，N.Y.(1983)，第10、35、44和158页。
这些标记组分可用作引入荧光探针中的荧光标记。术语“荧光探针”是指含荧光团部分的标记组分，其直接或通过连接臂结合到或配位到在测定(如荧光免疫测定)中使用的分析物、抗原、半抗原、抗体或其他分子上，以确定有关物质的存在和/或存在量。一些这种标记组分可用作磷光标记。本发明的组分可用作用于体内成像的试剂的标记，也可以用作体内肿瘤疗法中所用试剂的标记。
因此，通常来说，优选的荧光团为在波长为约200-约1000nm，优选约600-800nm范围的光的激发下能有效产生荧光的荧光团。适当的荧光团包括那些在不同于其他溶液组分(如存在于试样中的蛋白质)的激发和发射最大值的波长下吸收和/或发射，使背景荧光最小化的荧光团。
由于这些标记组分在使用生物流体的试样的测定中特别有用，优选用于那些用途的是具有至少约500nm的激发和/或发射波长的荧光团，其降低了来自其他试样组分的环境荧光的干扰。当使用小于500nm的激发波长时，一些试样，如血清会表现出相当大的来自黄素、黄素蛋白、NADH等的干扰背景荧光。
对某些应用领域如荧光极化免疫测定来说，优选的荧光团在结合形式下也可以表现出很高的荧光极化程度，优选比可观察到的极化作用的理论最大值高出大约10％。术语“结合”是指在分子和它的特定结合物之间形成相互结合的状态。对于某些应用领域如荧光过渡态测定来说，优选的荧光团的特征也在于测得的荧光衰变时间范围为约1纳秒-约50纳秒，优选范围为约5-约20纳秒。对于其他应用如磷光标记来说，可以使用具有更长衰变时间的荧光团。
因此，优选那些能有效产生荧光的荧光团，即这些荧光团的特征为在适当的波长下具有高吸收系数和具有高荧光量子产额。对于某些应用来说，优选的荧光团测得的荧光衰变时间为至少大约2纳秒，并表现出很高的荧光极化程度。
优选的小的增溶轴向配体包括-OH、-氧-叔丁基-、-OCH2OH、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH2CH2-O-CH2CH2OH、-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH、Cl、Br和F。对于任何通过-O-连接到中心原子的这些轴向配体来说，对水解的稳定性或许可以通过采用直接的碳与金属的键(如碳-硅)代替-O-连接得到改进。
在优选的实施方案中，荧光部分具有一个配位到中心原子的基本上为平面的多齿大环配体，所述中心原子能够与两个小的增溶轴向配体配位。就在荧光结合测定中作为标记组分来说，适当的中心原子为那些两个轴向配体可以配位到其上的原子，其原子序数不高，不会引起由于转化到三重线态而导致的大量的荧光猝灭。优选的作为中心原子的元素包括硅、锗和锡，特别优选硅和锗。
本发明也涉及通过使用荧光团部分作为目标分析物或受体的标记确定试样中目标分析物的存在或存在量的方法，该标记能够特定识别目标分析物，所述荧光团具有发光的基本上为平面的分子结构，其偶联到两个小的增溶轴向配体上，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
在免疫测定中使用这种可检测的标记或标记组分的优点在于在生物流体(如血清)存在和不存在时，这些标记的荧光发射的平行和垂直组分的强度基本相同。因此，使用这些标记的测定方法能够检测出生物流体中低浓度的目标分析物。
本发明的方法特别适合与改进的荧光检测系统一起使用，这种系统描述在1992年3月23日申请、标题为“荧光计检测体系”的共同转让的美国专利申请、Lyon & Lyon Docket 195/129号、系列号07/855,238中。相信标记组分和标记也可用于下述方法中，包括Walker等在Clinical Chemistry 421(1996)、Clinical Chemistry 399(1993)、美国专利5,593,867号和欧洲专利申请93117909.7中所述的方法，将所有这些完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
一方面，本发明涉及利用特殊标记的竞争性抑制测定方法。在这方面，本发明涉及确定目标分析物的存在或存在量的方法，该方法为使推测含有目标分析物的试样与已知量的加入的连接到荧光探针上的目标分析物或其类似物接触，荧光探针包括由荧光团部分形成的可检测到的已标记的标记组分，荧光团部分包括发光的基本上为平面的分子结构，其偶联到两个小的增溶轴向配体上，其中一个配体位于所述平面分子结构的任一侧；使试样与能够特定识别所述目标配体的受体接触；和确定结合到受体的荧光探针或游离的荧光探针的量。未知试样中结合的或游离的荧光探针的量可以与空白试样和含已知量的目标分析物的试样进行比较。
在优选的实施方案中，将所得的试样的混合物、荧光探针和受体在测量结合的和/或游离的荧光探针数量之前迅速稀释。稀释步骤使测定具有更高的灵敏度。特别优选是2-100倍，优选约7-约50倍，更优选约35倍的稀释。
一方面，本发明使用用于目标分析物(或其类似物)或受体的标记改进了免疫测定方法。这种改进使用了荧光团部分，其具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。使用这类标记进行测定的优点在于它们不存在血清结合和聚集，因此特别适用于检测生物流体如血清、血浆、全血和尿。
另一方面，本发明提供了一种进行“夹心(sandwich)”或“两位点(two-site)”免疫测定的方法，包括以下步骤(a)使推测含有目标分析物的试样与能够特定识别所述目标分析物的第一受体接触，以形成所述目标分析物和第一受体的络合物，用荧光探针对第一受体进行标记，荧光探针具有一个荧光团部分，其具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧；(b)使所述络合物与能够特定识别所述目标分析物或第一受体的第二受体(结合在固体载体上)接触，以形成第一标记受体、目标分析物和结合到固体载体的第二受体的络合物；和(c)测量与固体载体结合的标记的第一受体的量或未反应的标记的第一受体的量。
夹心型测定可以是多相测定或均相测定。如果是多相测定，可以引入从未反应的标记第一受体中分离出固体载体的附加步骤。通常优选均相测定，原因是它们速更快。
在另一个实施方案中，测定可以引入将在未知试样中测得的标记第一受体的量与在不含目标分析物的对照试样中测得的标记第一受体的量、或与在含已知量目标分析物的试样中测得的标记第一受体的量进行关联的附加步骤。
另一方面，本发明提供了同时进行夹心型测定的方法，用于确定试样中目标分析物的存在或存在量，包括以下步骤(a)同时使推测含有目标分析物的试样与能够特定识别所述目标分析物的第一和第二受体接触，以形成所述第一受体、目标分析物和第二受体的络合物，所述第一受体采用荧光探针进行标记，所述荧光探针具有荧光团部分，其具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于平面分子结构的任一侧，第二受体被结合到固体载体之上；(b)测量结合到固体载体上的标记第一受体的量或未反应的标记第一受体的量。
另一方面，本发明提供了同时进行夹心型测定的方法，进一步包括下述步骤将测得的标记第一受体的量与在不含上述目标分析物的对照试样中测得的标记第一受体的量进行关联，或将测得的标记第一受体的量与在含已知量目标分析物的试样中测得的标记第一受体的量进行关联。
另一方面，本发明提供了一种用于测定目标分析物的夹心型荧光免疫测定方法，该目标分析物能够独立识别两种不同的受体而不互相干扰。这种方法利用两种受体，每种受体用不同的染料标记。例如，一种受体用吸收和发射最大值分别为680nm和690nm的第一染料标记，另一种受体用吸收和发射最大值分别为695nm和705nm的第二染料标记。使用稳态或过渡态测量法可以对分析物进行检测和量化。在任一种情况下，对于实施例中所给出的，都在680nm下激发和在705nm下检测。这类测定的基础是能量传递，优点在于它是均相的。
在优选的实施方案中，本发明涉及生物流体，包括血清、血浆、全血和尿的免疫测定。优选在测定全血试样之前，将全血中的红细胞溶解。优选的溶解红细胞的方法包括加入硬脂酰溶血卵磷脂、十六酰溶血卵磷脂和肉豆蔻酰溶血卵磷脂。
根据所用免疫测定的类型，目标分析物可以是抗原、半抗原或抗体，受体可以是抗原或抗体。抗体可以是多克隆的或单克隆的。优选抗体为单克隆抗体。本发明中使用的单克隆抗体可以通过自然(Nature)256第495-497页(1975)所报导的Kohler & Milstein方法得到，或者可以通过科学(Science)246第1275-1281页(1989)的重组方法制备。
在一个实施方案中，目标分析物为药物或药物的代谢物。药物可以是类固醇、激素、抗生素、免疫抑制剂、止喘药、抗瘤剂、抗心律不齐药、抗惊厥药、抗关节炎药、抗抑郁药或强心甙。这些药物的例子包括地高辛、洋地黄毒苷、茶碱、苯巴比妥、甲状腺素、N-乙酰基普鲁卡因胺、普奈米东、阿米卡星、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、卡马西平、乙琥胺、丙戊酸、丙吡胺、利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、甲氨蝶呤、阿米替林、mortriptyline、丙米嗪、地昔帕明、万古霉素和环孢霉素。在优选的实施方案中，药物为地高辛。
在另一个实施方案中，目标分析物为肽，例如肽类激素如黄体生成素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、血管紧张肽I、血管紧张肽II、促乳素或胰岛素。肽也可以是肿瘤标记，如癌胚抗原。或者，肽也可以是病毒或病毒的一部分，例如风疹病毒或它的一部分。
本发明的方法提供了测量浓度为约1×10-5M/L-约1×10-13M，特别是浓度范围为约1×10-9M/L-约1×10-12M/L的目标分析物的方法。对于药物和它们的代谢物的测量来说，本发明的方法能够测量的范围为约5×10-9M/L-约5×10-12M/L，特别是约1×10-10M/L-约5×10-10M/L的浓度。对于肽的测量来说，本发明的方法能够测量的范围为约1×10-11M/L-约1×10-12M/L。
对荧光探针(结合的或游离的或两者)的量的测量可以通过测量稳态荧光或通过测量过渡态荧光来确定。在优选的实施方案中，测量光的波长大于约500nm，优选大于约650nm，更优选大于约680nm或690nm。由于过渡态检测体系采用了激光二极管，染料必须具有与二极管输出波长匹配的激发最大值。我们使染料能够与输出波长为680、690、720、750或780 nm的其他商品激光二极管相匹配。因此，测量光的波长可以大于约680nm、690nm、720nm、750nm或780nm。滤长越向光谱的红色区域移进，即，波长更大，背景上的信号就越密集(enrichment)。
在优选的实施方案中，用过渡态测量方法来进行检测和量化。由于优化了吸收和发射波长，以及由于优化了第一和第二染料的衰变时间，因此过渡态能量传递提供了改进的测量方法。这种优化消除了瑞利(Rayleigh)和喇曼(Raman)散射，并最大程度地提高了传递效率，和最大程度地减少了通过第一染料使第二染料的直接激发。
因此，本发明的主要目的是提供具有极大增强的敏感性的改进的各种FIA。本发明的另一个目的是提供能够快速(通常在几分钟内)而准确测量的FIA方法。本发明的一个目的是提供能够测量极低浓度的可发荧光的物质的FIA方法。本发明的一个目的是提供用于临床调整(Clinical Setting)的FIA方法，该方法快速而准确，成本相对较低，并且能够使用未修饰的生物试样，如全血。
本发明的另一个目的是提供FIA方法，特别适合于利用改进的荧光检测体系，该体系在上述引用的1992年3月22日申请、标题为“荧光计检测体系”、系列号为07/855,238的美国专利申请中描述。本发明的又一个目的是提供均相“混合和阅读(mix and read)”治疗药物测定方法，这种方法可用于确定在血清、血浆或全血中的地高辛水平。本发明的还一个目的是提供用于肽，例如风疹病毒或它的一部分的测定方法。本发明也提供了用于免疫测定的特殊荧光标记和探针，如本文所述。
本发明也提供了一种通过使荧光团部分与增溶轴向配体的活化形式反应合成标记组分的方法。本发明的特征还在于具有本发明的标记组分的荧光探针，它连接到特定结合对的一个成员或目标分析物或类似物上。术语“特定结合对”是指两个不同分子(或组合物)，其中一个分子在表面上或在腔中具有一定的面积，这个分子特定识别并结合到其他分子或包括其他分子的分子络合物的特定空间和极性组织上。
本发明也提供了合成荧光探针的方法，包括将本发明的标记组分连接到两个或多个增溶轴向配体的步骤。本发明也提供了在检测推测含有目标分析物的试样中的目标分析物时有用的工具(kit)，包括本发明的标记组分或探针。
本发明也涉及新型的染料寡核苷酸共扼体、合成它们的方法及使用它们的方法。使用这些共扼体或探针的方法包括核酸杂交方法、核酸扩增法和核酸测序法。染料-寡核苷酸共扼体的染料部分是一种可检测的已标记的标记组分，其具有荧光团部分，该荧光团部分具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
因此，一方面，本发明涉及具有连接到可检测的已标记的标记组分上的低寡核苷酸的组合物，该标记组分具有荧光团部分，其具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
术语“寡核苷酸”是指核苷酸残基的链。一般在本发明中有用的寡核苷酸长度为5-50个核苷酸。本发明的方法中使用的寡核苷酸探针包括DNA、RNA或可杂交为核酸序列的任何其他序列种类的多核苷酸。将会理解到这种核酸序列除了天然存在的碱基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶外，还可以包括碱基类似物。这种碱基类似物包括次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和8-氮鸟嘌呤。探针可以是双链或单链的形式，但优选单链形式。探针可以通过直接合成、聚合酶中介的延伸反应或通过克隆或其他常规方法制备。术语“连接”是指通过连接到两个部分的中间体分子的化学结合。
在一个优选方面，本发明涉及具有连接到可检测的已标记的标记组分上的寡核苷酸的组合物，标记组分具有荧光团部分，其具有配位在中心原子上的基本上为平面的多齿大环配体，所述中心原子能与两个轴向配体配位，这两个轴向配体在所述大环配体任一侧与中心原子配位。
优选可检测的已标记的标记组分的衰变时间范围为约1纳秒-约50纳秒，更优选衰变时间范围为约5纳秒-约20纳秒。
特别优选的是笼形二羧基硅酞菁。笼形二羧基硅酞菁染料可具有各种可用于偶联的官能团。这些基团包括游离羧基、游离氨基和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)。
优选所要求保护的组合物的寡核苷酸长度为约5-约50个碱基。
寡核苷酸或多核苷酸与标记之间的连接可以使用缩合反应导致形成例如酰胺、酯、腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、脲和硫脲得到实现。例如，连接体可以以氨基，优选伯氨基终止。其他连接体可以以羧基终止。
另一方面，本发明提供了制备某些与染料共扼的寡核苷酸的方法。在一个实施方案中，这种方法包括以下步骤(a)使具有氨基末端的附着连接体的寡核苷酸与N-羟基丁二酰亚胺酯、或可检测的已标记的标记组分的imidazolide反应以形成共扼体，所述标记组分含有荧光团部分，所述荧光团部分含有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧；和从未反应的寡核苷酸或多核苷酸以及从未反应的染料中分离出在步骤(a)中形成的共扼体。通过使用二胺和氨基醇可以实现连接体对寡核苷酸的附着。优选可检测的已标记的标记组分含笼形二羧基硅酞菁染料。
或者，与染料共扼的寡核苷酸的制备可以通过下述步骤实现在羟基苯并三唑及寡核苷酸或多核苷酸的存在下，使可检测的已标记的标记组分与碳化二亚胺反应形成共扼体，所述标记组分具有荧光团部分，所述荧光团部分具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧；从反应混合物的其他组分中分离出产生的共扼体。优选可检测的已标记的标记组分含笼形二羧基硅酞菁染料。
另一方面，本发明涉及确定试样中目标核酸序列的方法，包含以下步骤使试样核酸与寡核苷酸标记的标记组分接触，优选标记组分为能在均相溶液中与上述目标核酸序列杂交的寡核苷酸笼形二羧基硅酞菁染料共扼体；通过过渡态极化荧光检测这种杂交的存在和数量。
再一方面，本发明涉及检测试样中目标核酸序列的方法，包括以下步骤使推测含有目标核酸序列的试样与能够和上述目标序列杂交的互补寡核苷酸接触；使上述试样与寡核苷酸标记的标记组分接触，优选标记组分为能够与上述互补寡核苷酸杂交的寡核苷酸笼形二羧基硅酞菁染料共扼体；检测上述共扼体与上述互补寡核苷酸杂交的存在和数量。
另一方面，本发明涉及检测或量化目标核酸的方法，其中目标核酸为核酸扩增的产物。核酸扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自动维持序列扩增(3SR)和基于转录的扩增系统(TAS)，本文将对这些方法进行讨论。
另一方面，本发明涉及使用荧光探针作为标记改进核酸杂交方法或核酸扩增方法。荧光探针具有含荧光团部分的可检测的已标记的标记组分，所述荧光团部分含偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
当与时间相关的过渡态检测体系一起使用时，本发明的方法特别有用，如在共同转让的Studholme等于1992年3月23日申请、标题为“荧光计检测体系”、系列号为07/855,238的美国专利申请中所述。该体系的特征在于过渡态检测允许直接读出试样的时间相关的极化。该体系使用的激光二极管可以在非常高的频率如10MHz速率下调谐，并表现出高输出功率。一般激光“存在(ON)”时间约为2-3纳秒。来自溶液的光子使用在单光子计数模式下操作的光电倍增管(PMT)进行检测。与激光脉冲时间相比，光子事件与光子事件的相对时间是确定的。通过存储单独的光子事件时间，可以得到作为时间函数的光子频率的直方图。
另一方面，本发明提供了监测核酸扩增过程的动力学的方法和/或量化目标试样中核酸的方法。例如，在PCR扩增过程中，由寡核苷酸组成的探针被“盖上(capped)”，并用含连接到可检测的已标记的标记组分的寡核苷酸或多核苷酸的组合物标记，所述标记组分具有荧光团部分，所述荧光团部分具有偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。这种探针可以被直接加入到PCR反应中。术语“盖上”是指3′末端已进行双脱氧核苷酸反应。
与扩增产品的杂交可以在每种冷却相中按动力学(kinetically)进行。随着扩增产品浓度的增加，探针与扩增产品的结合速率也增加，并可对扩增产品的浓度进行量化。该信息与周期数一起对扩增前试样中原始DNA的数量进行量化。
在序列测定中的应用。本发明的另一方面是在DNA测序中的应用，其中将可检测的已标记的标记组分通过化学或酶的方式引入DNADNA在许多点发生断裂，用凝胶电泳法分析收集的片段。如果需要，可以使用不同的标记组分进行标记，其中一种有助于各种碱基的分析。本发明的另一方面是关于荧光计的各种设计、变化或修改的较大范围的应用。这种广泛的应用将在下文特定类型的设备的实施例中有详细描述。在非吸收性介质中，如果入射角大于临界角，当光波穿越被折射率较低的第二介质B包围的介质A时，在介质A的边界发生全内反射。但总的反射光的电磁场穿透边界很短一段距离，能够产生物理效应，如能激发靠近A和B的分界面的荧光团分子。
这种效应使均相、基于荧光的测定成为可能，在该测定中与固定在介质A表面的分子发生特定反应，因此在界面(是仅有的位置)能够发生荧光的激发。普通玻璃或塑料板不仅作为入射光的光学波导，而且也作为预先沉积在表面的已知位置的特定受体的载体。这种方法论被称为“瞬逝光荧光免疫测定法(evanescent lightfluoroimmunoassay”(Herron等，美国专利第5,512,492号)。
有利的是，本发明将非常大的Stokes移位(Stokes′s shifts)的特征与在光谱近红外区的发射结合，Stokes移位利用通常具有近UV激发区的基于含N大环(分类列于下文)的荧光染料。这类染料适用于以稳态或过渡态模式进行的免疫/受体测定。激发源包括汞弧、氮激光器和氮激光抽运的染料激光器(nitrogen laser pumped dye laser)。或者，这些相同的染料可以在近红外中被二极管激光器激发，得到极好的脉冲激发和过渡态检测结果。激发源的选择取决于上述具体的染料的吸光带的位置、优选的激发和检测模式(无论是稳态还是过渡态)以及空间要求。
所总结的化学和设计用在“瞬逝光荧光免疫测定”中的设备的这些特征应当引起极低的背景和很高的信号水平，由此有利于高的测定灵敏度。
上述对本发明的概述是非限定性的，从下文对优选实施方案的描述和从权利要求书中，本发明的其他特征与优点将变得显而易见。
附图简述图1表示非特定结合和溶剂对荧光强度的影响，该图显示出与Al相比，Si的保护效果，这大概是由于Si具有两个轴向配体，而Al只有一个配体。缩写Al trisulf＝羟基三磺酸铝、Si dicarb＝双-羟基(2，3-二羧基酞菁)硅IV、Si dicarb sulf＝磺化的双-羟基(2，3-二羧基酞菁)硅IV、BBKCl＝硼酸盐缓冲的KCl(参看实施例6中材料)、NHS＝混合的正常人体血清、Cts＝在FAST1过渡态荧光计的一个测量周期得到的读数。Cts与荧光强度成比例。
图2表示硅和铝酞菁衍生物在溶剂效应和非特定结合方面的比较。结果表明作为中心原子，Si(具有两个轴向配体)的存在比Al具有显著的更佳性能。这一点由二羟基二羧基硅酞菁(Si dicarb)与三磺酸铝(Al trisulf)相比，其在极化中具有极小的相对变化得到证明。通过磺化得到进一步提高，如二羟基二羧基硅酞菁磺酸盐(Si dicarb，sulf)所示，该磺酸盐可能具有两个或三个磺酸盐基团。如果用染料作为标记，则在甘油中的极化值指示的大约是电位极限。极化单位为毫极化(millipolarization)(mP)。进一步的缩写信息参看图1的说明。本领域技术人员将会认识到本发明的染料可以在可见光谱的较宽的范围内在大量的荧光应用中使用。
从下文对本发明优选实施方案的描述和从权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图没有必要按比例。本发明的某些特征可以按比例扩大，或为了清晰和简洁以示意的形式绘出。
本发明详述本发明主要涉及改进的荧光标记组分和相关的产品和方法，所述组分具有连接到两个或更多小的轴向配体上的基本上为平面的发光部分。优选的荧光团包含有小的增溶轴向配体和荧光特性，下文描述了它的合成和应用方法。以下描述包括实施本发明的优选模式，其主要目的是用于说明本发明的主要原理，而并非在任何意义对本发明作出限定。
I.优选的标记组分下面是对在本发明的荧光免疫测定中使用的优选标记组分的概述。更加完整的讨论可以在共同转让的美国专利申请系列701,449号和201,465号中找到，如上所述，已将它们结合到本文作为参考。
A.优选的荧光团部分适当的荧光团部分含发光的基本上为平面的分子结构。优选的荧光团部分中发光的基本上为平面的分子结构具有基本上为平面的大环多齿配体，该配体络合到中心原子上，中心原子可与两个轴向配体络合，其中一个轴向配体位于所述大环配体的任一侧(即具有反式取向)。
优选的中心原子为能形成八面体配位化合物的元素，该络合物含两个具有反式或轴向取向、位于平面大环配体的任一侧且垂直于所述平面大环配体的配体。在某些应用中作为荧光标记组分使用时，中心原子不应具有太高的原子序数(约30或更小)，这样在通过与中心原子的轨道互相偶合时荧光不会减弱。
优选的多齿配体包括含氮的大环，其具有与π电子的共扼环体系。这些大环可任选被取代，包括在桥连碳原子或氮原子上的取代。适合的大环包括卟啉、氮杂卟啉、咕啉、sapphyrin、pentaphyrin和porphycene的衍生物结构变体和其他含广泛离域的电子的类似的大环。这些大环可以任选具有包含或不含杂原子如N、O或S的稠合芳环。由于它们包括有许多上述性质的事实，特别优选的一类大环包括卟啉衍生物和氮杂卟啉衍生物(其中至少一个桥连碳原子被氮原子置换的卟啉衍生物)。氮杂卟啉衍生物包括单-、双-和三氮杂卟啉以及porphyrazine的衍生物。这些大环可任选具有包含或不含杂原子如O、N或S的稠合芳环。这些氮杂卟啉衍生物包括酞菁、苯并三氮杂卟啉和naphthalocyanine和它们的衍生物。许多这类化合物的制备方法和荧光质量为已知的，并且一些这类化合物是商业可得的。参看美国专利申请系列201,465号和该文中所引用的参考文献，特别是在该申请中的参考文献2-5。
对某些应用如荧光极化检测来说，优选在结合形式下表现出高的极化度的氮杂卟啉衍生物，即那些能发射强极化光的衍生物。对于这些应用来说，优选的是具有低对称性程度的大环，优选具有低于D4h的对称性程度的大环。优选的一组包括具有至少一个稠合芳环的大环。因此，优选的大环包括在能降低对称性的位置上具有稠合芳环的氮杂卟啉衍生物。优选的氮杂卟啉衍生物的种类包括具有低于D4h的对称性程度的单氮杂卟啉、二氮杂卟啉和三氮杂卟啉。其他优选的荧光染料在1995年6月6日申请、标题为“用于荧光测定的聚氧化烃基相关产品和方法”的美国专利申请08/476,544号，Lyon &Lyon Docket 211/167号中描述，将它们完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。
B优选的小增溶轴向配体优选的小增溶轴向配体包括-OH、-氧-叔丁基、-OCH2OH、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH2CH2O-CH2CH2OH、-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH、Cl、Br和F。
C优选的标记组分的吸光率和极化性能含有偶合到两个小的增溶轴向配体上的中心原子(如硅)的这些标记组分可通过过渡态荧光测量来表征。在这种测量中，对平行或垂直于激发脉冲的极化方向的两种极化组分的强度进行监测，监测时间约为标记组分的衰变时间的3倍。这种曲线反映了消光系数、量子产额、衰变时间和极化状态，并在标记组分的化学和物理状态方面提供了敏感性指示。例如，如果激发态被钝化或被转化为三重线态，总的强度将会降低，并且衰变时间将会缩短。如果通过增加粘度或通过结合到大分子上而改变分子的旋转布朗运动，平行组分与垂直组分的强度的比例将会增加。
在约5％的实验误差下，本发明的某些标记组分在DMF(有机溶剂)中与在SAP(含盐叠氮化合物的磷酸盐，一种中性含水缓冲液)中表现出相同的强度、衰变时间和极化。在某种程度上，在其他标记组分的制备中也具有这些特性。本发明的标记组分的区别性和重要的性质在于对血清中组分的不敏感性(和不与其结合)，这一点已经通过血清在荧光极化组分的强度、衰变时间或相对数量方面不具有任何显著的测量效果得到证明。对于在如使用生物材料的测定应用中使用的标记组分来说，这一点是至关重要的。
II优选的标记组分的制备根据制备本发明的优选标记组分的一个方法，在配体交换反应中以羟基或卤素基团作为轴向配体的适当的荧光团部分与活化形式的增溶部分反应，该反应按常规反应路线进行其中Mcl表示大环配体，CA为中心原子，X为被替换的配体，SM为增溶部分。该反应可以在净相中(neat)进行，或者根据需要也可以在溶剂中进行。适合的溶剂包括喹啉、THF、DMF、咪唑(当其自身溶解在一种其他上述溶剂中时)等。适合的反应温度可以根据大环原料和增溶基团的性质而变化。反应通常在约2分钟-约24小时内完成。反应混合物可以在回流条件下或在例如沙浴的方式下方便地进行加热。为了方便起见，反应可以在环境压力下进行。
我们认为该反应以两步进行，每次以一种共扼聚氧化烃基基团作为轴向配体进行络合。
当在荧光免疫测定中作为荧光标记时，这些标记组分可以连接到特定结合对的一个成员(“标记的结合配偶体”)或该成员的类似物上。术语“结合配偶体”是指分子或分子络合物，它能够特定识别特定分子或分子络合物或被特定分子或分子络合物识别。标记组分可以直接附着或共扼在结合对上或经连接臂附着或共扼在结合对上。
III利用本发明的标记组分可以用作用于荧光探针的荧光标记，可以用于荧光结合测定，也可以在体内成像和体内肿瘤治疗中作为标记。
这些标记组分在常规的荧光结合测定中，包括在荧光极化免疫测定中可以有利地作为荧光标记。当如此使用时，这些标记组分可以连接到特定结合对的一个成员(“标记的结合配偶体”)或该成员的类似物上。标记组分可以直接附着或共扼在结合对上或经连接臂附着或共扼在结合对上。
这些标记结合配偶体在具有各种形式的测定中是很有用的，例如涉及分析物或分析物结合配偶体(如果使用标记分析物或分析物的类似物)的竞争的测定，也可以在均相或多相测定中使用。
由于标记组分在水溶液不发生聚集，不具有溶剂敏感性(表明未检测到聚集)以及对血清组分和其他生物大分子无特定结合，这些标记特别适合在检测含生物液体(如血清)的试样中的分析物的测定中使用。因此，这些标记组分可以作为荧光探针的标记用来检测溶液中的分析物，其中由血清组分引起的非特定结合将严重地损害测定的灵敏度，影响其准确性和精确度。
或者，这些标记组分可以用作体内成像中的试剂。当作为成像剂使用时，这些标记组分与特定结合对的一个成员共扼成为一个标记的结合配偶体。将这种标记结合配偶体引入到动物体内。如果存在特定结合对的其他成员，所述标记的结合配偶体将结合到其他成员上，并且可以测量由标记组分产生的信号，识别其位置。
这些标记组分也可以用在体内肿瘤治疗中。例如，光动力学疗法(photodynamic therapy)涉及将标记组分用作光敏剂。标记组分(荧光标记)共扼到结合配偶体上，结合配偶体可以特殊识别并结合到癌细胞组分上。
本发明提供了核酸探针与制造和使用这种探针的方法。使用这种新型核酸探针的方法包括目前已知或以后开发的各种核酸杂交排序技术，目前已知或以后开发的各种核酸扩增技术。本发明的探针(本文也指共扼体)和方法能够在均相杂交测定中实现1飞摩尔(fmole)的灵敏度。正如本文所说明的，该灵敏度与由目前的多相杂交测量技术实现的灵敏度相当。但是，如上所述，目前的多相测定具有几个缺点，这些缺点是由测量中包括多个步骤产生的，包括增加了污染的风险，增加了进行测定所需的时间。通过阅读本文所提供的实施例，本发明的组合物和方法的其他优点对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
实施例为了帮助理解本发明，本文包括了以下实施例，用于描述一系列实验的结果。当然，以下关于本发明的实施例不应当被解释为是对本发明的特别的限定并且在本领域技术人员的范围之内的目前已知或以后开发的本发明的变体，都认为是在本文所描述的发明和以下所要求保护的范围内。
实施例1从1，2，4，5-四氰基苯(TCNB)合成四(二亚氨基)1，2，4，5-苯四酸二酰亚胺将1L的3-颈烧瓶中的20.0g(0.112mol)TCNB在真空中干燥约1小时。烧瓶配备有缓慢、高扭矩、Teflon叶片的搅拌器，用于在氨水中鼓泡或加入液体时所用的入口以及水冷凝器。将整个设备用氮气冲洗后，加入400ml的甲醇，在室温下开始搅拌并缓慢地对氨水鼓泡。
氨水的吸收非常有效，在几分钟后悬浮液变为透明淡绿色溶液。几分钟后(在氨水的恒定加入下)溶液变为混浊，并且温度稍有升高。从开始加入氨水起40分钟后，反应混合物变得难以搅拌，在继续搅拌和加入氨水下再加入200ml甲醇。此时，氨水的吸收仍然非常有效，这一点可以通过无泡沫从悬浮液表面冒出得到证明。100分钟后，有必要再加入175ml甲醇以使搅拌能够进行。在125分钟后，在冷凝器的出口出现大量的氨水，将反应混合物放入45℃的水浴中，再继续搅拌、加热和加入氨水240分钟。冷却后，将反应混合物在4℃下储存24小时。随后将固体通过在Whatman#42滤纸上抽吸过滤，并在真空下干燥。产率23.2g(0.109mol)。
实施例2双-氯(2，3-二羧基酞菁)硅(IV)的合成将二亚氨基异二氢吲哚(30.0g，0.207mol)和四亚氨基1，2，4，5-苯四酸二酰亚胺(10.5g，0.050mol)一起磨碎，并在1升的3颈烧瓶中在真空下干燥过夜。烧瓶配备Teflon叶片混合器、隔片、温度计和带有硅胶干燥管的回流冷凝器。将装有搅拌的反应物的设备用干燥氮气冲洗，在氮气条件下加入600ml的喹啉并在氮气流下搅拌30分钟。得到均匀、流动的悬浮液。此后，在5分钟内通过隔片缓慢地加入60ml四氯化硅。溶液变黑，在不加热条件下继续搅拌15分钟。
然后，在持续搅拌下，将预先加热到195℃的油浴升高到浸没烧瓶内物质的位置。5分钟后，油浴温度降到175℃，再经15分钟后油浴稳定在185-190℃，将其再维持60分钟。然后将油浴降低，使反应混合物冷却约15分钟。然后开始通入氮气流以除去未反应的四氯化硅，其可以在冷凝器出口处用湿的pH试纸检测到。在约45分钟的通风后，将现为100℃的油浴恢复到原处，继续缓慢加热到约130℃以有利于除去四氯化硅，再经过70分钟后经上述测试，当仅有明显的喹啉烟雾时四氯化硅已完全除去。
然后除去油浴，当反应混合物冷却至约80℃时，在混合下加入424ml水和424ml浓盐酸的混合物。继续加热，最终混合物为酸性。将反应产物在室温下保持过夜。第二天在混合下，再加入424ml水和424ml浓盐酸，将混合物在室温下放置一整夜。
然后将反应混合物在瓷漏斗(24cm滤纸)上过滤，用水洗涤，在通风橱中风干一整夜。将湿滤饼在1升的丙酮中搅拌并过滤。将洗涤后的物质在通风橱中干燥2天，干燥后的物质(50g)在有丙酮的研钵中磨碎，将混合物搅拌、过滤并在真空下干燥，剩下47.9g的黑色细碎的固体。
实施例3双-氯(2，3-二羧基酞菁)硅(IV)(二羧基二氯染料)的水解用长颈漏斗将浓硫酸(98ml)装入250ml的圆底烧瓶中，以避免沾湿烧瓶颈。在磁性搅拌下将16.3g的二羧基二氯染料分成小部分通过短颈漏斗加入。加入过程持续约1小时，以便在加入更多固体之前使染料块分散。将干燥管与烧瓶连接，将混合物在油浴中加热，并在50℃下保持24小时。
将反应烧瓶从油浴中移出，在冰中冷却。在无冷却条件下小心地将水(75ml)分成小部分加入，在搅拌条件下将混合物在80℃的油浴中加热20小时。冷却之后，将混合物倒入在1升的烧杯中的冰中，并进行搅拌。
将混合物在室温下在2000xg下离心分离30分钟。沉积物悬浮在水中(约250ml)，再次对其进行离心分离。重复该洗涤过程，收集沉积物，并将其悬浮在300ml 1M的K2CO3中。将混合物在用表面皿覆盖的烧杯中在搅拌条件下加热。10分钟内温度达到90℃，在约93℃继续加热50分钟。在仍旧热的情况下将混合物用浓HCl酸化，使其冷却并在室温下保持2天。
然后将固体收集在11cm的瓷漏斗(使用Whatman#42滤纸)上进行过滤，过滤大约需要1小时。将固体在漏斗上用3×100ml的水分次洗涤，然后在通风橱中风干。然后将固体打碎，在真空下用P2O5和KOH干燥。收率13.3g(87％)。
实施例4用二氧化硅色谱吸附作用提纯双-羟基(2，3-二羧基酞菁)硅IV(二羧基染料)将在实施例3中制得的3.0g粗二羧基染料装入250ml的瓶中，向其中加入100ml含2％(体积)乙基二异丙基胺(DIEA)的MeOH，将混合物搅拌30分钟。之后，加入43g二氧化硅(EM Science)，用手对混合物进行振荡以形成黑色糊状物。20分钟后，再加入100ml含2％DIEA的MeOH，将瓶子倒置几分钟，并将内容物搅拌20分钟。除MeOH和DIEA外通过加入EtOH以调整溶剂的性质，这种调整改变了经过萃取的染料的组成，使单组分的萃取成为可能。然后将固体在减压下在烧结玻璃板漏斗(微孔性，直径6.5cm)上过滤。为了防止MeOH过大的损失，通过连接到部分真空罐(partially evacuatadtank)来维持减压状态。经一整夜过滤后，将残余物用2×50ml的MeOH+DIEA分次洗涤约30小时。将滤液(230ml)在旋转式汽化器中浓缩至接近干燥。将残余物溶解在14ml MeOH+DIEA中，将溶液分成等分并装入两个40ml的锥形离心管中。
将各个管所含的物质用200μl浓HCl酸化，然后加入水使离心管接近充满。通过倒置和振荡几次来混合管中物质，在约650xg下离心分离30分钟。然后弃去褐色的上层液体，沉积物用0.01 MHCl洗涤3次。将沉积物转移到100ml圆底烧瓶中，通过旋转汽化将混合物干燥，然后在真空下用H2SO4和KOH干燥。干重为304mg(纯的二羧基染料)。
实施例5用氯磺酸磺化纯的二羧基染料称量161mg纯的二羧基染料(实施例4)并装入带有磁性混合器的50ml长颈圆底烧瓶中。在室温下在N2下加入3.4ml的ClSO3H。装上带有N2球形瓶的小的空气冷凝器，将烧瓶和内容物在110℃的油浴中加热约3.7小时。此时，取出50ml试样用于测试。在110℃再继续加热3.3小时，随之停止加热取出第二个试样。向两个试样中加入冰，将每个试样都用水稀释至重量为390mg。然后向各个试样中加入2ml 1M的NaHCO3，通过用2ml的中性缓冲液稀释10μl的稀释试样进行测量，测出每个试样的吸光率。两个样品的Amax都出现在690nm，在3.7小时的试样读数为0.650，在7小时的试样读数为0.490，这表明在最后3.3小时的加热期间，染料约有25％被破坏。
将主要的反应混合物分成小部分加入在烧杯中的冰中，然后将冷的混合物在约700xg下离心分离30分钟。弃去极轻微着色的上层液体。将沉积物悬浮在30ml的冰冷的水中，将其与水一起转移到250ml的锥形瓶中，用约40ml 1M的KHCO3使其成为碱性，并在室温下搅拌一整夜。将反应混合物转移到烧杯中，用浓HCl酸化，在室温下搅拌6小时，并在室温下保存48小时。
将反应混合物在约700xg下进行离心分离，保留着色的上层液体，将沉积物溶解在1M的NaHCO3中并搅拌2小时。将深绿色的溶液通过Sep Pak(2g大小，Rainin)，将经酸化后的滤液与从离心中得到的上层液体合并。总体积约400ml。将深蓝色酸性溶液在Sep Pak上吸收，在柱上用3N HCl洗涤，用MeOH洗脱。并用MeOH和3NHCl洗涤后的Sep Pak可以反复使用。通过旋转汽化和在真空下用H2SO4与KOH对含染料的MeOH洗脱物进行干燥。产率158mg。
实施例6非特定结合的测量和硅和铝酞菁的溶液性质的表征材料1)硼酸盐缓冲的KCl(BBKCl)该缓冲液通过混合下述物质制备33.1ml的0.70M硼酸、4.0ml的0.50M K2B4O7、75ml的4.0MKCl、H2O(使溶液达到1升)，pH约8.1。
2)将磺化二羧基硅酞菁(实施例5)、二羧基硅酞菁(实施例4)和三磺酸铝、钠盐(卟啉产物)溶解在BBKCl中。这些溶液的浓度如下确定在含5％(体积)的乙基二异丙基胺的甲醇中的每种试样的稀释液的NIR最大值(约680nm)下测量吸光率，并假定所有试样的摩尔消光系数的值为2×105L/mol。然后在BBKCl中制备稀释液，以得到浓度为5×10-8M的每种染料的溶液。
荧光测量。在过渡态极化荧光计(FAST1，Hyperion，Inc.Miami，FL)中对极化和强度进行测量，在每种情况下，都通过用1ml BBKCl、BBKCl+1％(体积)的混合正常人体血清(L3833，10/18/84)或甘油稀释10微升的浓度为5×10-8M的染料(第2项的材料)溶液进行测量。
结果如图1和图2所示，如通过荧光强度和极化测量评估一样，对三种染料的非特定结合和溶剂敏感性进行表征。关于强度，所需的性质稳定地取决于溶剂组成和高荧光输出。另一方面，在低粘度的介质中理想地极化应当仍旧较低，在粘性溶剂如甘油中应当尽可能地较高。
图1表示来自铝酞菁三磺酸盐的荧光强度是对溶剂非常敏感的。对比之下，二羟基二羧基硅酞菁磺酸盐表现出了显著的改进的性能，在缓冲液、缓冲液加血清或单独的甘油中具有几乎相同的荧光输出。与二羟基二羧基硅酞菁(无磺酸盐基团)相比，可看出部分这种改进效果是由于对其进行的磺化，二羟基二羧基硅酞菁本身比铝化合物对于血清和溶剂具有较小的敏感性。
图2更有力地表明当与铝作为中心原子进行对比时，仅中心硅原子的存在也会导致对环境的敏感度降低。这种差异最可能是由于以下事实Si具有两个轴向配体，因此由于“保护基团”存在于分子平面的每一侧，从而可“保护”染料的平面结构不受溶剂的作用。在铝的情况下，仅存在一个轴向配体，因此分子平面的一侧可以无拘束地受到溶剂作用。在图2中，明显可以看出这种相互作用的结果使Al染料的极化出现非常大的增长，接近通过将染料放入甘油(表明如果旋转运动接近停止，极化的近似极限)可得到的最大值。
结论当然，以上关于本发明的实施例应用不应当被认为用来限定本发明的范围。在本领域技术人员的范围内，目前已知的或以后开发的本发明的这些变体都被认为是在下文所要求保护的本发明的范围之内。
本说明书中提及的所有专利和出版物指示了本发明所属领域技术人员的水平。就像每种单独的出版物被特别和独立指出结合入本文作为参考一样，所有专利和出版物都在相同程度上结合入本文作为参考。
这里示例性描述的本发明可以在不存在任何一种或多种元素、本文中没有特别公开的一种或多种限定的情况下进行适当地实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任何一个可以被其他两个术语中的任一个代替。文中使用的术语和表述是作为描述性的，而不是限定性的，并且在使用这种术语和表述时没有任何倾向排除其显示和描述的或其一部分的性质的等价物，但认识到在本发明所要求保护的范围内各种修改都是可能的。因此，应当理解尽管本发明通过优选实施方案和任选特性进行特别公开，但本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和改变，并且认为这种修改和变形是在由附加的权利要求书所定义的本发明的范围之内。
其他实施方案在以下的权利要求书中。
权利要求
1.一种可检测的已标记的标记组分，所述标记组分包含发光的基本上为平面的荧光团部分，所述荧光团部分偶联到两个或更多小的增溶轴向配体(axialligand)上，其中一个轴向配体位于所述荧光团部分的任一侧。
2.权利要求1的标记组分，其中所述荧光团部分含配位到中心原子上的大环多齿配体，所述增溶轴向配体独立选自羟基、氯、溴、氟、OCH3和O-CH2OH。
3.权利要求2的标记组分，其中所述标记包含两个增溶羟基部分，一个增溶羟基部分在所述大环配体的任一侧连接到所述中心原子上。
4.权利要求3的标记组分，其中所述两个羟基部分包含配位到所述中心原子上的轴向配体。
5.权利要求4的标记组分，其中所述中心原子能够形成八面体配位化合物。
6.权利要求5的标记组分，其中所述大环配体具有共扼π电子体系。
7.权利要求6的标记组分，其中所述大环配体包含含氮大环。
8.权利要求7的标记组分，其中所述大环配体选自卟啉衍生物、或具有一个或多个桥连碳原子被氮原子置换的卟啉衍生物、咕啉衍生物、sapphyrin衍生物或porphycene衍生物。
9.权利要求8的标记组分，其中所述中心原子选自硅、锗、磷和锡。
10.权利要求9的标记组分，其中所述大环配体具有低的对称性程度，因此增强了平行于吸收极化的发射极化。
11.权利要求10的标记组分，其中所述中心原子为硅或锗。
12.权利要求11的标记组分，其中所述大环配体具有比D4h低对称性的对称性程度。
13.权利要求12的标记组分，其中所述大环配体具有至少一个稠合芳环。
14.权利要求9的标记组分，其中所述大环包含卟啉衍生物，其中所述卟啉衍生物中1-4的桥连碳原子被氮原子置换。
15.权利要求14的标记组分，其中所述大环包含四苯并三氮杂卟啉(tetrabenzotriazaporphyrin)衍生物。
16.权利要求15的标记组分，其中所述大环选自四苯并三氮杂卟啉、27-苯基四苯并三氮杂卟啉和27-(对-甲基苯基)四苯并三氮杂卟啉。
17.权利要求16的标记组分，其中所述中心原子为硅。
18.权利要求13的标记组分，其中所述大环配体包含酞菁衍生物。
19.权利要求1的标记组分，其中所述荧光团部分为naphthalocyanine或naphthalocyanine衍生物。
20.权利要求1的可检测的已标记的标记组分，其中所述偶联到两个或更多小的增溶轴向配体上的荧光团部分的特征在于在水溶液中在血清组分存在时的过渡态(transient state)荧光发射具有与不存在血清时基本相同强度的平行和垂直组分。
21.权利要求1的可检测的已标记的标记组分，其中所述发光的基本上为平面的分子结构具有至少约500nm的激发波长，当与不偶联到两个或更多羟基部分的裸露的荧光团部分相比时，所述标记组分降低了对血清组分的非特定结合。
22.权利要求21的标记组分，其中所述荧光团部分的激发波长为约600-800nm。
23.权利要求22的标记组分，其中所述荧光团部分的激发波长至少为650nm。
24.权利要求21的标记组分，其中所述标记组分在存在和不存在血清时，具有基本上相同的极化组分的强度、衰变时间和相对数量。
25.权利要求21的标记组分，其中所述荧光团部分单独具有至少比完全标记组分(complete marker component)的结合常数大60倍的结合常数。
26.权利要求21的标记组分，其中所述荧光团选自(1)末端为芳基的聚甲炔染料；(2)醌型染料；(3)阴丹士林染料；(4)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二羧酰亚胺；(5)四氨基蒽醌；(6)吖嗪染料；(7)吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料和(8)萘醌甲基化物。
27.一种合成权利要求1-26中任一项的标记组分的方法，包括使所述荧光团部分与所述增溶轴向配体的活化形式反应的步骤。
28.一种在推测含有目标分析物的试样中检测所述目标分析物的方法，该方法包括以下步骤(a)使权利要求1-26中任一项的标记组分与目标分析物或其类似物连接；(b)使所述推测含有所述目标分析物的试样与连接到目标分析物或其类似物的已知量的标记组分接触；(c)使所述推测含有所述目标分析物的试样与特定结合到所述目标分析物的受体接触；(d)测定所述连接到结合于所述受体的目标分析物或其类似物的标记组分的量，或未结合的目标分析物或其类似物的量。
29.一种荧光探针，所述荧光探针包含权利要求1-26中任一项的标记组分，连接到特定结合对的一个成员或目标分析物或类似物上。
30.权利要求29的探针，其中所述受体目标分析物或其类似物直接附着在所述荧光团部分上。
31.权利要求29的探针，其中所述受体目标分析物或其类似物经连接臂共轭到所述荧光团部分上。
32.权利要求29的探针，其中所述受体目标分析物或其类似物选自地高辛、洋地黄毒苷、茶碱、苯巴比妥、乙酰基普鲁卡因胺、普奈米东、苯妥英、风疹抗体和每种物质的衍生物。
33.权利要求29的荧光探针，其中所述特定结合对的成员具有至少一个空间耐受(sterically tolerant)标记组分附着点，它可使所述探针形成特定结合对。
34.一种合成荧光探针的方法，包括使权利要求1-26的任一项的标记组分连接到两个或更多增溶轴向配体上的步骤。
35.一种在推测含有目标分析物的试样中检测所述目标分析物的方法，该方法包括以下步骤(a)使推测含有所述目标分析物的试样与能够特定结合到所述目标分析物的第一受体接触，以形成所述目标分析物与所述第一受体的络合物，所述第一受体用含权利要求1-26中任一项的标记组分的荧光探针标记；(b)使所述络合物与能够特定结合到所述目标分析物的第二受体接触，所述第二受体被结合于固体载体上，以形成所述第一标记受体、所述目标分析物和结合于所述固体载体的所述第二受体的络合物；和(c)测量结合到所述固体载体的标记第一受体的量或未结合的标记第一受体的量。
36.权利要求35的方法，进一步包括下述步骤将在所述推测含有所述目标分析物的试样中测得的用荧光探针标记的所述第一受体的量与在不含目标分析物的对照试样中测得的用荧光探针标记的所述第一受体的量进行关联，或与在含已知量的所述目标分析物的试样中测得的用荧光探针标记的第一受体的量进行关联。
37.权利要求35的方法，进一步包括从所述未结合的标记第一受体中分离出所述固体载体的步骤。
38.一种测定在推测含有目标分析物的试样中目标分析物的存在或存在量的方法，包括以下步骤(a)同时使所述推测含有目标分析物的试样与能够特定识别所述目标分析物的第一和第二受体接触，以形成所述第一受体、所述目标分析物和所述第二受体的络合物，所述第一受体用包含权利要求1-26中任一项的标记组分的荧光探针标记，所述第二受体被结合于固体载体上；和(b)测量与所述固体载体结合的所述标记第一受体的量或未反应的标记第一受体的量。
39.权利要求38的方法，进一步包括下述步骤将在推测含有目标分析物的试样中测得的标记第一受体的量与在不含目标分析物的对照试样中测得的标记第一受体的量进行关联，或与在含已知量的所述目标分析物的试样中测得的标记第一受体的量进行关联。
40.一种在推测含有目标分析物的试样中测量所述能够结合到两种不同受体的目标分析物的方法，包括以下步骤(a)使所述推测含有所述目标分析物的试样与能够特定结合到所述目标分析物的第一受体接触，以形成所述目标分析物与所述第一受体的络合物，所述第一受体用含权利要求1-26的任一项的标记组分的荧光探针标记；和(b)使所述络合物与能够特定结合到所述目标分析物的第二受体接触，所述第二受体的吸收和发射的最大值与所述第一受体的值不同。
41.一套用于在推测含有目标分析物的试样中检测所述目标分析物的工具(kit)，所述工具包括权利要求1-26中任一项的标记组分。
42.一套用于在推测含有所述目标分析物的试样中检测所述目标分析物的工具，所述工具包括权利要求27-31中任一项的荧光探针。
43.一种含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸连接到权利要求1-26中任一项的可检测的已标记的标记组分上。
44.权利要求43的组合物，其中所述可检测的已标记的标记组分的衰变时间范围为约1纳秒-约50纳秒。
45.权利要求44的组合物，其中所述衰变时间在约5纳秒-约20纳秒的范围内。
46.权利要求43的组合物，其中所述寡核苷酸具有5-50个碱基的长度。
47.权利要求43的组合物，其中所述键包含(CH2)6O。
48.权利要求43的组合物，其中所述键包含(CH2)2NH。
49.一种制备标记组分共扼寡核苷酸的方法，包括以下步骤(a)使末端为氨基的附着连接体的寡核苷酸与N-羟基-丁二酰亚胺酯反应，或与标记组分的imidazolide反应以形成共扼体，所述标记组分为含连接到可检测的已标记的标记组分上的寡核苷酸的组合物，所述已标记的标记组分含荧光团部分，所述荧光团部分含偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧；和(b)从未反应的寡核苷酸和从未反应的标记组分中分离出步骤(a)中形成的共扼体。
50.权利要求49的方法，进一步包括在步骤(a)之前进行下述步骤将末端为氨基的连接体附着在寡核苷酸上。
51.一种制备标记组分共扼的寡核苷酸的方法，包含以下步骤(a)使标记组分在hydrobenzotriole和寡核苷酸的存在下与碳化二亚胺反应形成共扼体，所述标记组分为含连接到可检测的已标记的标记组分上的寡核苷酸的组合物，所述已标记的标记组分含荧光团部分，所述荧光团部分含偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧；和(b)从所述反应混合物的其他组分中分离出在步骤(a)中形成的共扼体。
52.一种测定试样中目标核酸序列的存在和数量的方法，包括以下步骤(a)使试样核酸与权利要求43的组合物接触，其中所述组合物能够在均相溶液中与所述目标核酸序列杂交；和(b)通过过渡态极化荧光检测这种杂交的存在和数量。
53.一种检测试样中目标核酸序列的方法，包括以下步骤(a)使推测含有目标核酸序列的试样与能够与所述目标序列杂交的互补寡核苷酸接触；(b)使所述试样与权利要求1的组合物接触，其中所述组合物能杂交为所述互补寡核苷酸或多核苷酸；和(c)检测所述共扼体与所述互补寡核苷酸或多核苷酸的杂交的存在或测量杂交的数量。
54.权利要求51-53中任一项的方法，其中所述目标核酸序列选自核酸扩增的产物、DNA和RNA。
55.权利要求54的方法，其中所述核酸扩增通过选自下述的方法进行聚合酶链反应(PCR)、配体链反应(LCR)、自动维持序列扩增(3SR)和基于转录的扩增系统(TAS)。
56.在一种核酸扩增方法中，所述改进包括使用荧光探针作为标记，该探针含可检测的已标记的标记组分，所述标记组分含荧光团部分，所述荧光团部分含偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
57.在一种核酸扩增杂交方法中，所述改进包括使用荧光探针作为标记，该探针含可检测的标记标记组分，所述标记组分含荧光团部分，所述荧光团部分含偶联到两个小的增溶轴向配体上的发光的基本上为平面的分子结构，其中一个轴向配体位于所述平面分子结构的任一侧。
58.权利要求43的组合物，其中所述组合物具有热稳定性。
59.权利要求58的组合物，其中所述组合物在90℃下暴露1小时后是稳定的。
60.权利要求59的组合物，其中所述组合物在100℃下暴露10分钟后是稳定的。
61.一套工具，所述工具包括权利要求43的组合物和标记、包装或用法说明。
62.一种使用权利要求62的工具的方法，包括按照所述标记、包装或用法说明使用所述组合物。
63.一种制造权利要求61的工具的方法，包括使所述组合物与所述标记、包装或用法说明结合的步骤。
全文摘要
本发明涉及标记组分、荧光探针、寡核苷酸、杂交试样和使用这些产品的免疫测定以及制备这些产品的方法。本发明提供了一种可检测的已标记的标记组分,该组分含偶联到两个或更多小的增溶轴向配体上的荧光团部分,[定义]优选这种组分可减少或消除溶剂敏感性和非特定结合的问题。
文档编号G01N33/533GK1344293SQ99815809
公开日2002年4月10日 申请日期1999年11月12日 优先权日1998年11月25日
发明者W·B·丹德里克, M·L·许 申请人:海珀里昂有限公司