专利名称：使用纯化的抗原特异性抗体检测军团菌属细菌的方法
技术领域：
本发明涉及从军团菌属(Legionella)细菌，特别是从侵肺军团菌(Legionellapneumophila)的血清型和/或菌株分离出的基本无蛋白的糖和多糖抗原，包括侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原，和用这些抗原亲和纯化对应军团菌属生物体的多价抗体。更具体的说，本发明包括将分离自军团菌的糖或多糖抗原与活化层析柱偶联，并用该柱亲和纯化针对同一菌种的，或军团菌属同样血清型菌种的多克隆抗体。本发明还包括用产生的亲和纯化的多价抗体在免疫化学试验中检测病人中军团菌导致的疾病，如军团病和庞蒂亚克热，并用于检测军团菌感染因子的环境来源。
背景军团病，一种由军团菌属的革兰氏阴性细菌导致的人肺炎样感染，实际上该病不可能仅依靠可靠的临床基础(涉及不用实验室检测评估病人)症状与肺炎和其它类似的肺部感染区分开来。由于该疾病可产生肺脓肿、身体其它器官感染或菌血症，而且耽误最初的适当治疗将显著增加其致死率，故需要快速和可靠的诊断试验，而这种需要迄今仅部分实现。Stout,J.E.和Yu,V.L.,“军团菌病”，337，新英格兰医学杂志，682-687(1997)。由于存在许多种军团菌，而且已知道至少一些具有许多不同的血清型，开发这样的试验的努力受到了阻碍。
在1976年夏首次认识到军团病，随着时间已开发了许多检测侵肺军团菌(“L”)的技术，现在已知该菌占病例的90％左右(Stout和Yu，见上)。总而言之，这些试验费时，且只能鉴定侵肺军团菌中迄今已知的15种血清型中的一种。然而应注意的是，如Stout和Yu，见上，报道的军团病病例中80％以上是由侵肺军团菌血清1型引起的--该事实使开发一种快速、可靠的免疫试验变得特别重要，并导致研究者优先致力于此项工作。
早期对鉴定军团病病原体的尝试主要依靠细菌培养5-6天并显微镜检测培养物。加速鉴定过程的戮力得到了许多敏感性和特异性不同的免疫化学试验，包括，尤其是，现在商品可得的EQUATETM放射性免疫试验(“RIA”)，和Binax酶免疫试验(“EIA”)，两者都以试剂盒形式由申请者的受让人Binax Inc.出售。如Hackman,B.A.等在“检测侵肺军团菌血清型Ⅰ抗原的Binax军团菌尿抗原EIA试剂盒和Binax RIA尿抗原试剂盒的比较”，34临床微生物学杂志，1579-1580(1996)所表明，发现这两种试验都对侵肺军团菌血清型Ⅰ抗原是特异性的。报道的EIA灵敏度为77％,RIA的灵敏度更高。该文章表明，各试验都可在“3小时内从头至尾”完成；在Binax自己的试验中各需要至少21/2小时来进行。更多的关于该EIA试验的信息见于Kazandjian,D等，“用Binax酶免疫试验检测尿抗原快速诊断侵肺军团菌血清型Ⅰ的感染”，35免疫生物学杂志，954-956(1997)。
发明简述可能本文所述的免疫层析试验的最显著优点是它能在15分钟内给出侵肺军团菌血清型Ⅰ(或其抗原)存在与否的试验结果，此结果是高特异性和高灵敏度的。该试验能以此速度可靠的进行，并得到高特异性和高灵敏度的结果据信是由于本发明制备的亲和纯化的抗体的强反应性。据信，这些抗体的优异反应性能是由于在亲和纯化中使用了新的、基本无蛋白的侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原，它也是本发明的一部分。
根据本发明，由于分离了一种侵肺军团菌血清5型的抗原(它是非蛋白质的糖类，是侵肺军团菌的多种血清型共同的)，从而可进行另一种ICT试验。科学文献中已提出这种共同抗原的存在，见例如，Nolte,F.S.等，“侵肺军团菌脂多糖的电泳和血清学特征分析”，52感染和免疫，676-681(1986)；Otten,S.等，“侵肺军团菌的血清特异性抗原”，167细菌学杂志，893-904(1986)；Barthe,C.等，“侵肺军团菌脂多糖上单克隆抗体识别的共同表位”，26临床微生物杂志，1016-1023(1988)；Knirel,Y.A.等，“侵肺军团菌血清型Ⅰ的O-特异性链结构”，227欧洲生物化学杂志，239-245(1994)。迄今在有用的广谱免疫化学试验开发中，尚没有分离得到任何一种这类抗原的明确报道。
本发明包括从任何一种军团菌，尤其是侵肺军团菌任何一种血清型的细菌中抽提基本无蛋白质的多糖或糖抗原，制备该抗原与间隔臂蛋白的偶联物，将该偶联物与一亲和柱交联，用该柱纯化针对相应军团菌，如侵肺军团菌一血清型的细菌的多价抗体，和用如此纯化的抗体在ICT免疫试验中检测军团菌或其抗原，包括侵肺军团菌诸血清型的抗原或其相应细菌，如下文更详细描述的那样。
具体说，本发明包括分离侵肺军团菌血清1型特异性的、基本无蛋白的O-多糖抗原，及其在亲和纯化针对同一微生物的特异性多价抗体中的用途，该亲和纯化的抗体在为时15分钟的高特异性和高灵敏度ICT免疫试验中的用途。
在另一个实施例中，本发明包括从侵肺军团菌血清5型中分离得到基本无蛋白的糖抗原，其在亲和纯化抗侵肺军团菌血清5型抗原的特异性多克隆抗体(即从用所述抗原免疫的家兔获得的抗体)中的用途；该抗体显示与除血清5型抗原外的，与侵肺军团菌血清1、2和4型的抗原交叉反应的能力。
附图描述本文
图1及其相关的图1A、1B和1C显示了如本文实施例Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ所述的，适用于进行侵肺军团菌血清1型特异性试验的典型的ICT装置的结构。
本文图2显示了用侵肺军团菌血清5型蛋白质印迹分析侵肺军团菌血清1、2和4型的磷酸缓冲盐抽提物，尤其是对血清5型抗原特异性的基本无蛋白的糖抗原-亲和纯化的多克隆抗体的结果，本文实施例Ⅹ描述了该分析。
发明详述本领域先前的经验，包括以商标EQUATE出售的用于侵肺军团菌血清1型抗原的Binax RIA试验和用于相同抗原的Binax EIA试验获得的经验，显示军团菌菌种的抗原，包括各种侵肺军团菌血清型的抗原，在受军团菌属细菌感染的病人尿标本中比血、痰或其它体液标本中更经常被检测到。这部分是由于军团菌抗原常出现在病人感染后1-3日的尿中，而它们以可检测水平出现在血液中时间较晚，也是部分由于被军团病感染的病人一般不产生很多痰。构成本发明一部分的ICT试验，可用于对血液、痰或一些其它液体，如脑脊髓液，或环境水样进行检测。注意，尿通常是诊断病人的优选样品液，因为它的获得是非侵入性的而且容易，甚至在医生的办公室中，而且它不易被其它微生物如痰中的口腔菌群(它们是无害的，但可能影响获得的结果)污染。
概括说，可设计对侵肺军团菌血清1型抗原(是本发明一部分)的ICT试验，在本领域公开的任何一次性使用ICT装置中进行。该试验优选用Howard Chandler在美国申请号07/706,639申请中，或其后随申请之一中所公开类型的ICT装置，全部转让给Smith-Kline Diagnostics,Inc.，但仅在包括本诊断领域-即呼吸系统疾病的广泛应用中被授予Binax,Inc.。该装置中适当的注满了本文公开的亲和纯化的多价抗体，它们对侵肺军团菌血清1型抗原具有特异性。在合适标记的抗体与抗原反应后出现颜色，显示该试验的阳性结果。合适的标记可以是任何本领域已知的，当偶联的抗体与抗原反应时产生可见颜色的标记，包括细的金属粒子和各种其它标记材料。胶态金是优选的标记。
本发明考虑可以相似方法从各种军团菌属细菌中，包括从其它军团菌和侵肺军团菌的其它血清型细菌中分离出基本无蛋白的糖或多糖抗原，可以相似方法在亲和纯化针对相应军团菌菌种或血清型细菌及其抗原的多价抗体中，利用这些抗体，而且如同本文特别公开的采用亲和纯化的、针对侵肺军团菌血清1型的抗体那样，可在ICT和其它免疫试验中利用这些亲和纯化的抗体。
准备该装置之前，先获得抗体并实现其亲和纯化。在本发明中可使用的抗体是常规多价(也称为“多克隆”)抗体，用熟知的用军团菌属抗原，如已知血清型的侵肺军团菌抗原免疫家兔、山羊或其它动物，并在经过合适的时期后对动物取血，获得含有所需抗体的血清。见例如，Cherry,U.B.和McKinney,R.M.,91-104页，于Jones,G.L.和Herbert,G.A.(编)，“军团病”疾病、细菌和方法学，(Center ofDisease control,Atlanta,1979)。在该发明中，相对于本文公开的侵肺军团菌血清1型的ICT免疫试验，给家兔或其它动物接种侵肺军团菌血清1型抗原，而从其血液中回收的多价抗体是针对侵肺军团菌血清1型的抗体。
将本发明中使用的多价抗体进一步在特制的层析柱上进行亲和纯化，该柱使用同一细菌的基本无蛋白的糖或多糖抗原作为抗体的纯化剂，该抗体对其是反应性的。
在亲和纯化抗体之前，根据本发明，必须从所需菌种或血清型的已知军团菌培养物中制备基本无蛋白的、纯化的多糖或糖抗原。
下列实施例Ⅰ和Ⅱ解释了如何获得纯化的无蛋白多糖或糖抗原。
实施例Ⅰ从疾病控制和预防中心(Atlanta,GA)获得了侵肺军团菌血清1型(菌株Philadelphia-1)的细菌，并在从Northeast Laboratory(Waterville,ME)酵母活性炭抽提物琼脂平板上37℃培养72小时。用pH7.2、含有0.2％NaN3的磷酸缓冲盐水(“PBS”)收获细胞，8000rpm离心25分钟收集。将所得细胞沉淀储藏在-20℃直到使用。
将该沉淀的湿细胞每克悬浮在20毫升的0.1M NaOH中，室温搅拌45分钟。然后用浓醋酸将溶液pH调到3.0,8000rpm离心该溶液20分钟。然后用NaOH溶液中和来自该步骤的上清液，并用蒸馏水透析。
将得到的透析液在真空旋转蒸发器上浓缩10倍，然后在超声水浴中超声5分钟。
以每毫升0.2毫克浓缩产物加入蛋白酶K，以消化剩余蛋白质，40℃培育混合物过夜。下一步是在混合物中再加入浓度为每毫升0.1毫克的蛋白酶K，然后再次40℃过夜培育。该二次培育后，在旋转蒸发器上浓缩产物至小体积，用0.2％三乙胺将其pH调到10-11，将如此处理的混合物加到用0.02％三乙胺平衡的Pharmacia的Sephacryl S-200柱上。合并第一峰中洗脱的物质，用0.1NHCl调到大约中性pH，用蒸馏水透析18小时，然后冻干。
从16.5克侵肺军团菌血清1型菌株Philadelphia-1的湿细胞中获得O-多糖抗原产量是62毫克。
应注意的是，可使用任何广谱蛋白酶制备物替代蛋白酶K。在该过程中重要的是，在合理的时间可行性范围内尽最大可能从抗原中除去蛋白质。
实施例Ⅱ用侵肺军团菌血清5型菌株Dallas IE作为培养步骤中的细菌，重复实施例1。11.5克湿菌得到21毫克糖抗原。随后，再次重复该程序，这次使用侵肺军团菌血清5型(菌株U8W)作为培养步骤中的细菌。
如本文所述，对任何其它军团菌属细菌，特别是对其它侵肺军团菌的任何一种血清型，即对血清型2、3、4和6-15重复该培养和抽提步骤，以获得基本无蛋白物质的糖抗原，均在本发明的范围内。
为了将实施例Ⅰ的基本无蛋白的O-多糖产物或实施例Ⅱ的糖与层析柱偶联，用于亲和纯化多价抗体，这些抗体针对从中抽提出多糖-氯化物(polysac-chloride)或糖抗原的相应细菌，必须将抗原与合适制备的蛋白质间隔分子偶联，以确保间隔分子与多糖或糖抗原，以及与柱稳定结合，而且自身在亲和纯化步骤中保持惰性。选择了一种修饰的牛血清白蛋白(“BSA”)作为优选间隔分子，如实施例Ⅲ中那样制备实施例Ⅲ-蛋白间隔分子的制备制备了购自Aldrich Chemical Co.,Inc(Milwaukee,WI)的肼基二盐酸的0.5M水溶液，用无水NaOH将其pH调节到5.2。然后将该溶液与购自Sigma Chemical Co.的无水BSA混合，最终浓度为每毫升25毫克BSA。BSA完全溶解后，加入购自FlukaChemical Co.(St.Louis,MO)的N-(二甲基氨基丙基)-N1-盐酸乙基碳二亚胺，至最终浓度每毫升2.5毫克。在环境温度下搅拌混合物过夜，然后用蒸馏水4℃透析约5天，每日换水。
代替该修饰的BSA，可考虑使用其它合适的间隔分子。
如下进行了侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原和间隔分子的偶联实施例Ⅳ-O-多糖抗原与间隔分子的偶联将侵肺军团菌血清1型的基本无蛋白的O-多糖抗原以4-5mg/ml浓度溶于蒸馏水，并用1M HCl将pH调至5.0。如实施例Ⅲ制备修饰的BSA液，用1M HCl调pH至5.0，缓慢将该液与O-多糖抗原溶液以4∶1的比加入到多糖抗原溶液中。搅拌5分钟后，以1∶2重量比将含有实施例3中的N-(二甲基氨基丙基)-N1-盐酸乙基碳二亚胺的约100-200毫升蒸馏水加到O-多糖抗原/BSA溶液中。在环境温度下搅拌得到的混合物过夜。
为了将残存的未反应物质与O-多糖抗原和修饰的BSA的偶联物分开，在用0.1M NaH2PO4∶0.5M NaCl平衡的Sepharose CL-4B柱上层析该反应混合物。用上文所述的商品Binax EIA试验对所有层析组分测试抗原活性。合并所有在试验中显示抗原活性的组分，并用于实施例Ⅴ中所示的亲和柱制备。
实施例Ⅴ-偶联物和活化层析柱的交联用溴化氰常规活化Sepharose CL-4B制备了免疫吸附凝胶。用本领域已知的程序，如Hermanson,G.T.等，在固定亲和配体的技术，53-56(Academic Press,Inc.1992)中所述，将O-多糖抗原配体和实施例Ⅳ中制备的修饰BSA偶联。然后将凝胶填装在柱中，连续用5-10倍凝胶体积的pH7.2PBS、三倍强度的pH7.2PBS和0.2MpH2.5甘氨酸-HCl洗涤。如下所述，用得到的活化柱亲和纯化侵肺军团菌血清1型抗原的多价抗体。洗脱后，应将柱储藏在PBS或其它中性缓冲液中，直至使用。
除了溴化氰活化的Sepharose，还可在该步骤中使用sepherelose和各种可商品购得的活化柱。
实施例Ⅵ-抗体的亲和纯化用实施例Ⅴ中描述的活化柱，根据Harlow e.和Lane,D.在抗体实验手册，313-315(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)描述的方法，亲和层析针对侵肺军团菌血清1型抗原的家兔-抗侵肺军团菌血清1型多价抗体。用0.2MpH2.5甘氨酸-HCL缓冲液从柱上洗脱抗体。也可用其它洗脱液，如3M NaSCN或0.1M Et3N代替。
在侵肺军团菌血清1型特异性的ICT试验中如下列实施例所述使用这些亲和纯化的抗体。
实施例Ⅶ-ICT装置及其制备A．试验装置的制备如图1所示，制备了一试验装置，它含有一装有铰链的纸板箱，箱上有一窗口，可同时观察试验结果和对照结果。该装置有一凹槽，在槽中置有预制的塑料拭子孔，用于接受右侧沾有样品的拭子(在图中标为1)。然后将图1A中所示的外贴条贴在该装置的整个右侧。该外贴条上有两个孔-下方的孔(在图1A中标为B)中将插入饱和的拭子，而上方的(在图1A中标为B)孔可将被插入孔B的拭子推到该孔(A)中。外贴条和它的孔A和B的位置，和拭子孔共同操作，在试验过程中可将拭子固定在恰当位置，并促进吸附的液体从拭子上排出。
如下所述，将一预装配的测试条(图1中标为C)插入凹槽(图1中标为2)，并通过与凹槽底部粘合而固定。将图1B中所示的外贴条置于左手侧顶部。它上面有一个孔(图1B中标为D)，当该装置关闭进行试验时孔D和右侧的孔A相匹配。
将装配好的该装置置于密封的、装有干燥剂的袋中，直到使用。在密封和储藏前，将一条略带粘性的胶带置于该装置右半边的外缘上。
B．预装配测试条的构建和制备图1C显示了预装配条的构建。它由一块吸收材料纸垫构成，其中浸润了金颗粒和亲和纯化的家兔抗-侵肺军团菌血清1型抗体的偶联物。和该纸垫接触的是一块硝酸纤维素纸垫，它上面有一条与该偶联物反应的样品捕获线，它是通过嵌入如上所述制备的一条亲和纯化的家兔抗-侵肺军团菌血清1型抗体条建立的。硝酸纤维素纸垫还有一条下游对照线，通过用山羊抗-家兔免疫球蛋白(IgG)在板上划线建立。沿着硝酸纤维素纸垫，该条带终止于吸收纸垫，吸收垫起到液体贮器的作用。当准备搬运该装置时，所有这些纸垫背面都用黏胶带固定。
偶联物纸垫常用无纺聚酯或挤压乙酸纤维素酯制备。为了制备用于该试验的纸垫，将50纳米直径的金颗粒与如上所述制备的亲和纯化的家兔抗-侵肺军团菌血清1型抗体偶联。用已知的，如DeMay in Polak,J.M.和VanNorden,S.(编)，免疫化学现代方法和应用(Wright,bristol,England,1986)所述的方法实现了该偶联。将偶联金颗粒与干燥剂混合，该干燥剂由含有1.0％BSA、0.1％Triton X-100、2.0％Tween20、6.0％蔗糖和0.02％叠氮化钠的，pH8.0的5mM四硼酸钠水溶液构成。对纸垫充分加热，除去所有存在的液体，并储藏在低湿度环境中，直到装配测试条。这些纸垫及其处理是特别选定的，从而使纸垫能保持住干燥的偶联物，并仅在随后被样品浸湿时才释放它。
首先将一纸条亲和纯化的家兔抗-侵肺军团菌血清1型抗体(用磷酸缓冲盐水作载体溶液)嵌入硝酸纤维素纸垫的第一部分。这些抗体作为捕获线。在装配好的测试装置第一部分的下游，纸垫的第二部分中，用溶于同一载体溶液的山羊抗-家兔IgG在纸垫表面划线，建立对照线。然后18-25℃干燥硝酸纤维素纸垫，以促使蛋白质条被纸垫永久吸收。
所用的吸水纸垫是可商品购得的，以商品名Ahlstrom 939出售的纤维素材料。该纸垫不需要特殊处理。
C．试剂盒制备如商品所售，装配含有做好的测试条的该试验装置。在实施中，许多装置和同等数量的拭子包装在一起，这些拭子采用纤维状Dacron，以及一瓶“试剂A”，装试剂A的该瓶子有一适合滴加试剂A的瓶盖。“试剂A”是2.0％Tween20,0.05％叠氮化钠和0.5％十二烷基磺酸钠的0.05MpH6.5柠檬酸钠-磷酸钠缓冲液的溶液。在各试剂盒中还包括了阳性和阴性对照。
在下面的实施例Ⅷ中说明用做好的试验装置鉴定侵肺军团菌血清1型抗原实施例Ⅷ-对侵肺军团菌血清1型抗原进行ICT试验在实施中，将各装置配备的拭子浸入液体样品中，完全浸没拭子头。拭子的用途是作为液体生物学样品，如尿、血液、淋巴液等，和环境学液体样品中存在的未溶解固体、半固体和胶体的过滤器，在Norman Moore和Vincent Sy,1998年3月19日提交的待批申请号09/044,677(随后被转让给Binax,Inc.)的内容中有所描述。将拭子插入该装置底部的孔(图1A的孔B)，并轻轻向上推，使拭子尖端在顶部孔(图1A的孔A)中可见。将试剂A小管垂直导致于孔B上方，缓慢滴加两滴试剂A。然后立即剥离该装置右侧的粘性带，关闭该装置，安全密封，从而将拭子孔中的拭子推入正对金偶联物纸垫的拭子孔。15分钟后，可在该装置窗口读到结果。阴性样品-即不含侵肺军团菌血清1型抗原的样品-将仅在窗口上半部显示对照线。含有靶抗原的阳性样品将显示两条线，下面的一条是病人(或样品)线；甚至一条微弱的样品线也表明样品中存在的靶抗原。如果15分钟后在窗口中还未出现任何线条，或仅在窗口下半部出现样品线，试验是无效的，必须重做。
使用上述程序，在前述ICT程序中以实施例Ⅶ中所述制备的装置对300个病人尿样测试，其中100个病人先前已被诊断为具有侵肺军团菌血清1型抗原。
在进行实验的人不知道先前诊断的条件下进行了本发明的这些ICT试验，总的说，98％的ICT试验与先前阳性诊断相符。总的说，98％先前诊断为侵肺军团菌血清1型抗原阴性的尿样得到的结果，和用本文所述的ICT程序，使用实施例Ⅶ所述的ICT装置测试的结果相符。
实施例Ⅸ-用ICT测试环境样品如下还调查了该同样试验对怀疑含有侵肺军团菌血清1型的环境样品的实用性用从商品来源获得的侵肺军团菌血清1型细菌接种水。将混合物滤过0.22微米滤膜浓缩。将浸渍过样品的拭子用于该装置，关闭装置，进行试验。在15分钟内观察到了阳性结果。
实施例Ⅹ-用于检测侵肺军团菌血清1、2、4和5型的交叉反应糖抗原的蛋白质印迹免疫试验为了用购自Bio-Rad Laboratorie的试剂盒进行蛋白质印迹免疫分析，如实施例Ⅱ中那样培养了侵肺军团菌血清5型细胞。将这些细胞的悬液在100℃下用1％十二烷基磺酸钠，在10mM巯基乙醇的存在下溶液化5分钟。用蛋白酶K处理溶解的细胞，然后按Bio-Rad提供的标准程序进行电泳，分离蛋白质。
将侵肺军团菌血清5型的糖抗原与本文实施例Ⅲ中所述的间隔分子，以实施例Ⅳ中所述的方法偶联，并加到如实施例Ⅴ所述的活化的Sepharose柱上。然后用该柱，使用实施例Ⅵ的程序，亲和纯化侵肺军团菌血清5型糖抗原的特异性多价家兔抗体(从先前用含有侵肺军团菌血清5型蛋白质注射的家兔血清中常规获得)。
用Bio-Rad的试剂盒，并按制造商的指示进行蛋白质免疫印迹分析。简单说，对侵肺军团菌抗原1、2、4和5细胞的PBS抽提物在用1％BSA封闭的12％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE，用PBS转移到硝酸纤维素膜上。在该步骤后，将该膜与抗侵肺军团菌血清5型糖特异性亲和纯化抗体一起培育。按厂商推荐进行洗涤，并与Bio-Rad提供的山羊-抗-兔抗体偶联的辣根过氧化物酶一起培育。洗涤后，用0.022M4-氯-1萘酚和0.0012MN,N-二甲基-p-苯二胺一盐酸的0.1MpH6.9的柠檬酸钠缓冲液(含有2.9mM过氧化氢)的底物系统对该膜进行显色。本文图2显示，与预先着色的SDS-PAGE标准(第5泳道)比较，亲和纯化的侵肺军团菌血清5型的抗体对于含有侵肺军团菌抗原的PBS抽提物的蛋白质印迹分析结果，如下泳道1和7-侵肺军团菌血清2型(菌株Togus-1)泳道2和8-侵肺军团菌血清4型(菌株Los Angels-1)泳道3和6-侵肺军团菌血清1型(菌株Philadelphia-1)泳道4和9-侵肺军团菌血清5型(菌株U8W)指出泳道1-4的亲和纯化的抗体是在结合了侵肺军团菌血清5型(菌株U8W)的糖抗原的柱上亲和纯化的，而泳道6-9的那些是以相同方法在结合了侵肺军团菌血清5型(菌株Dallas IE)的糖抗原的柱上亲和纯化的。
图2清楚证明了，如本文所述侵肺军团菌血清5型的亲和纯化的抗体除了和血清型5的抗原反应外，还和侵肺军团菌血清1、2和4型的抗原反应。
考虑如上所述的ICT试验，其中侵肺军团菌血清5型的亲和纯化的抗体可用侵肺军团菌血清1型的亲和纯化的抗体代替。
一般免疫化学领域中的技术人员，尤其是从事免疫试验的技术人员将认识到，可轻易的用其它材料和成分，以及有时可用其它程序步骤代替本文中特别推荐的那些。大量专利或非专利的文献讨论了可取代本文中描述和推荐的优选ICT装置的可靠、一次性使用、可置换的免疫分析试验装置。本发明将不限于可替换的试验装置、材料、成分或加工步骤，除了由权利要求限制的那些。
权利要求
1．一种从已知军团菌属菌种，或菌种血清型的细菌中获得基本无蛋白的糖或多糖抗原的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)培养所述细菌一段必需时间，以获得所需大小的样品，并以湿细胞沉淀的形式从所述样品中收集细菌细胞；(b)将所述湿细胞沉淀悬浮在碱性溶液中，并混合；(c)用强酸将pH调节到酸性pH并离心；(d)分离步骤(d)的上清液，并将所述上清液的pH调节到近似中性；(e)用广谱蛋白酶制备物消化该产物，以破坏剩余蛋白质；(f)用弱碱水溶液将pH调节到碱性一侧；(g)在用弱碱溶液平衡的大小排阻柱上分离出基本无蛋白的糖或多糖抗原；和(h)合并第一峰中洗脱下来的材料，并将所述材料的pH调节至近似中性。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是侵肺军团菌血清1型，而所述收集到的基本无蛋白的抗原是基本无蛋白的侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是侵肺军团菌血清5型，而所述收集到的B抗原是基本无蛋白的侵肺军团菌血清5型的糖抗原。
4．一种根据权利要求1所述的方法从侵肺军团菌的菌种或菌种血清型获得的基本无蛋白的细菌糖或多糖抗原。
5．用权利要求2所述的方法获得的基本无蛋白的侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原。
6．用权利要求3所述的方法获得的基本无蛋白的侵肺军团菌血清5型的抗原。
7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的碱溶液含有每克湿细胞沉淀约20毫升0.1M氢氧化钠水溶液。
8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中pH被调节至约3.0。
9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(f)中pH被调节至约10-11之间。
10．如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(h)后，进行冻干步骤。
11．一种纯化军团菌属菌种或菌种血清型的粗制抗体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)从军团菌属的同一菌种，或菌种的血清型细菌中分离出基本无蛋白的糖或多糖抗原；(b)将所述抗原和一两端间隔分子的一端偶联，形成带有间隔分子的所述基本无蛋白抗原的偶联物；(c)将所述偶联物与活化的层析柱交联；(d)在步骤(c)的柱上亲和层析所述粗制抗体，以获得纯化的抗原特异性抗体；(e)从所述柱上洗脱纯化的抗原特异性抗体。
12．如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粗制抗体是侵肺军团菌血清1型抗原的抗体，而基本无蛋白的糖或多糖抗原是如权利要求5所述的基本无蛋白的O-多糖抗原。
13．如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粗制抗体是侵肺军团菌血清5型抗原的抗体，而基本无蛋白的糖或多糖抗原是如权利要求6所述的基本无蛋白的糖抗原。
14．侵肺军团菌血清1型的纯化的抗原特异性抗体及其抗原，其特征在于，该抗体和抗原是由权利要求12所述的方法产生的。
15．侵肺军团菌血清5型的纯化的抗原特异性抗体及其抗原，其特征在于，该抗体和抗原是由权利要求13所述的方法产生的。
16．用于亲和纯化军团菌属菌种，或菌种血清型细菌的粗制抗体的层析柱，其特征在于，该柱具有通过一间隔分子偶联于其上的所述间隔分子和基本无蛋白的同一军团菌属菌种，或菌种血清型细菌的糖或多糖抗原的偶联物，抗体可与所述偶联物反应。
17．如权利要求16所述的层析柱，其特征在于，所述基本无蛋白的多糖或糖抗原是基本无蛋白的侵肺军团菌血清1型的O-多糖抗原。
18．如权利要求16所述的层析柱，其特征在于，所述基本无蛋白的多糖或糖抗原是基本无蛋白的侵肺军团菌血清5型的糖抗原。
19．通过如权利要求11所述的方法获得的，针对侵肺军团菌的至少一种菌种，或菌种血清型细菌的纯化的抗原特异性抗体。
20．一种检测液体中军团菌属细菌或它们的抗原组分存在的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)从已知的军团菌属菌种，或菌种血清型培养物中抽提出基本无蛋白的多糖或糖抗原，(b)将所述基本无蛋白的抗原与一间隔分子交联，形成偶联物，(c)将步骤(b)的偶联物与层析亲和柱偶联，(d)用步骤(c)的亲和层析柱纯化所述已知军团菌属细菌的粗制抗原，以产生纯化的抗原特异性抗体；和(e)用步骤(d)的纯化的抗体检测液体中相应军团菌属细菌或其抗原的存在与否。
21．如权利要求20所述的方法，其特征在于，步骤(b)的间隔分子是蛋白分子。
22．如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的已知军团菌属细菌是侵肺军团菌血清型之一的细菌。
23．如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的已知军团菌属细菌是侵肺军团菌血清1型的细菌，所述步骤(a)中获得的抗原是所述细菌的基本无蛋白的O-多糖抗原，而在步骤(e)中使用步骤(d)中获得的针对侵肺军团菌血清1型细菌的纯化的抗体，以检测液体中侵肺军团菌血清1型细菌或其抗原的存在与否。
24．如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)的液体是水。
25．如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)的液体是哺乳动物来源的天然液体。
26．如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述液体是人尿。
27．如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述液体获自有肺炎型疾病临床表征的病人。
28．如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)是免疫试验过程。
29．如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)是免疫层析分析过程。
30．如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)的纯化的抗原特异性抗体的一部分与标记试剂偶联，当所述抗体与相应抗原反应时，已知所述标记试剂可显示可见的颜色。
31．如权利要求30所述的过程，其特征在于，所述标记试剂是极细的金颗粒。
32．如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述已知军团菌属细菌是侵肺军团菌血清5型的细菌，所述步骤(a)中获得的抗原是所述细菌的基本无蛋白的糖抗原，而步骤(d)中获得的纯化的抗体能检测液体中侵肺军团菌血清1、2、4和5型细菌或它们的抗原性成分。
33．如权利要求32所述的方法，其特征在于，利用所述侵肺军团菌血清5型的纯化的多价抗体检测任一或所有侵肺军团菌血清1、2、4和5型细菌或其抗原在液体中的存在。
34．如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述液体是水。
35．如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)是免疫试验程序。
36．如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)是免疫层析试验过程。
37．如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)的纯化的抗原特异性抗体的一部分与标记试剂偶联，当所述抗体与相应抗原反应时，已知所述标记试剂可显示可见的颜色。
38．如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述标记试剂是极细的金颗粒。
39．一种检测军团菌属细菌的至少一种菌种，或菌种血清型或其抗原在液体介质中存在的方法，其特征在于，检测试剂含有在亲和层析柱上纯化粗制抗-军团菌抗体获得的抗原特异性军团菌抗体，在所述层析柱上交联了从已知军团菌获得的基本无蛋白的糖或多糖偶联物。
40．如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述抗原特异性军团菌抗体是侵肺军团菌血清型的抗体，而所述偶联物是从侵肺军团菌的同一血清型细菌获得的基本无蛋白的糖或多糖抗原的偶联物。
41．如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述侵肺军团菌的血清型是血清型1。
42．如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述侵肺军团菌的血清型是血清型5。
43．一种根据权利要求39所述的免疫试验方法。
44．一种根据权利要求40所述的免疫试验方法。
45．一种根据权利要求41所述的免疫试验方法。
46．一种根据权利要求42所述的免疫试验方法。
47．一种根据权利要求43所述的免疫层析试验方法。
48．一种根据权利要求44所述的免疫层析试验方法。
49．一种根据权利要求45所述的免疫层析试验方法。
50．一种根据权利要求46所述的免疫层析试验方法。
51．一种检测军团菌的至少一菌种或菌种血清型，或所述细菌抗原的免疫层析试验方法，其特征在于，该方法包括(a)使怀疑含有所述细菌或它们的抗原的液体样品和含有一条滤纸材料的免疫层析试验装置接触，该纸条具有(ⅰ)一个区带，该区带中充满了以下二种物质的偶联物(1)一种标记试剂，它在抗体和它们相应的抗原性结合伙伴反应后，显示可见的颜色变化，和(2)待检测的军团菌菌种或菌种血清型的纯化的抗原特异性抗体，所述抗体已通过一亲和层析柱纯化，所述亲和层析柱上偶联有待检测的军团菌属菌种、或菌种血清型的基本无蛋白的糖或多糖抗原；和(ⅱ)一个第二区带，它结合有同样纯化的，非偶联形式的抗原特异性抗体，该区带配有一窗口，用于观察颜色变化。(b)使所述样品从侧面流过所述测试条，到第一区带，(c)使所述样品和所述亲和纯化的抗体与标记的偶联物，从侧面沿所述测试条流到所述第二区带，和(d)从步骤(a)开始在大约15分钟内，通过所述窗口观察是否在所述第二区带出现一条色带，从而表明在样品中存在要检测的军团菌属菌种或菌种血清型的细菌。
52．如权利要求51所述的方法，其特征在于，怀疑含有至少一种军团菌属菌种，或菌种血清型的液体是水。
53．如权利要求51所述的方法，其特征在于，怀疑含有至少一种军团菌属菌种，或菌种血清型的液体是哺乳动物来源的天然液体。
54．如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物来源的天然液体是人尿。
55．如权利要求54所述的方法，其特征在于，在抗体与它们的相应抗原性结合伙伴反应后，显示可见的颜色变化的所述标记试剂是极细的金属。
56．如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述标记试剂是极细的金颗粒。
57．如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述待检测的细菌或其抗原是侵肺军团菌血清1型，所述纯化的抗原特异性抗体是抗侵肺军团菌血清1型的抗体，而在纯化抗体时所用的与层析柱偶联的基本无蛋白的抗原，是侵肺军团菌1型的基本无蛋白的O-多糖抗原。
58．如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述纯化的抗原特异性抗体是侵肺军团菌血清5型的抗体，而在纯化抗体时所用的与层析柱偶联的基本无蛋白的抗原，是侵肺军团菌血清5型的基本无蛋白的糖抗原。
全文摘要
从军团菌属菌种或菌种血清型细菌分离得到基本无蛋白的O－糖或O－多糖抗原,并与活化层析柱偶联。用如此制备的层析柱纯化针对军团菌属的同一菌种或菌种血清型的未加工抗体。用得到的抗原特异性抗体在免疫化学试验中检测人中军团病、庞蒂亚克热和其它军团菌导致的疾病,并用于检测环境样品中的军团菌属细菌。本发明详细描述了一种在免疫层析试验装置中进行的快速、高特异性和灵敏的侵肺军团菌血清1型的免疫试验。
文档编号G01N33/531GK1313771SQ99810035
公开日2001年9月19日 申请日期1999年8月25日 优先权日1998年8月25日
发明者V·A·库奇纳, E·V·莫洛科夫, N·J·穆尔 申请人:比南股份有限公司