包含弹性肽的生物分子的利记博彩app

专利名称：包含弹性肽的生物分子的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及已插入了弹性肽从而当该肽收缩或伸展时特征改变的生物分子，尤其是抗体。本发明还涉及编码这种生物分子的DNA以及使用这种生物分子的方法。
能够可逆收缩和伸展的弹性结构在自然界是众所周知的，在例如肌肉、动脉、肺、韧带和皮肤中均有发现。收缩和伸展由构成弹性结构的分子(如弹性蛋白)的二级结构的改变引起。已经进行了可观的工作以阐述这种改变的本质和发生转变的肽序列。例如，弹性蛋白包含重复的疏水性单体，典型的有(VPGVG)n，其中n在猪和鸡中为11-13。
Urry已经广泛地研究了合成的弹性蛋白聚合物，而且在“酶学方法”(Methods in Enzymology，1982，Sidney Colowick和Nathan Kaplan主编，学术出版社，p673-716)、生物物理学和分子生物学进展(Prog.Biophys.Molec.Biol.，57，p23-57)和Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1993，32，p819-841)中回顾了结果。由弹性蛋白五肽形成的合成性弹性蛋白聚合物在温度低于24℃时是可溶的(当n＝150时)，但是在更高的温度下沉淀形成凝聚层(稠密的粘弹性状态)。凝聚过程是容易逆转的。水分子与蛋白质疏水部分的结合是放热过程。因此，当热量增加超过特定的转变温度时，将导致结合的水分子释放以及分子内和分子间疏水相互作用增强。
在弹性蛋白的情况中，加热破坏了伸展的更无序的疏水性水合结构而且聚合物在分子内收缩。收缩如下产生首先折叠形成重复的II型β-转角，形成每圈含大约3个VPGVG五聚体的β-螺旋，然后形成分子间缠绕纤维。多肽随温度升高而有序性增加的这种现象叫做反向温度转变，而且对于特定的分子在特定的温度发生。然而，如果其它环境参数改变了，这个温度也会改变。
通过改变弹性聚合物本身或其环境从而改变其疏水性，可以控制转变温度(Tm)(Urry等人，1991，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，113，p4346-4348；Luan等人，1990，生物聚合物(Biopolymers)，29，p1699-1706)。因而，Tm可以通过以下方法改变，如磷酸化(Pattanaik等人，1991，生物化学及生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，178，p539-545)、辅基的电化学或化学还原(Urry等人，1992，生物化学及生物物理学研究通讯，188，p611-617；Urry等人，1995，生物化学及生物物理学研究通讯，210，p1031-1039；Urry等人，1994，生物化学及生物物理学研究通讯，204，p230-237)或光化学反应，通过改变压力(Urry等人，1993，化学物理学通信(Chemical Physics Letters)，201，p336-340)、pH(Urry等人，1988，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85，p3407-3411)、聚合物浓度或聚合物组成(Urry等人，1992，生物聚合物，32，p1243-1250；Urry等人，1986，生物化学及生物物理学研究通讯，141，p749-755)或者通过加入盐(Luan等人，1991，生物聚合物，31，p465-475)或有机溶质(Urry，1992，生物物理学及分子生物学进展，57，p23-57和Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。
由于Tm改变，特定系统的温度可以维持恒定，而由上述参数之一的改变引发在不同状态间的转变，从而转变温度低于(或高于)系统温度，发生收缩(或伸展)。因而，如pH或压力的变化可以用来引发或诱导弹性肽的收缩或伸展。
也已经鉴定了具有相似性质的非肽聚合物，可以利用环境参数(包括温度)，在转变温度以上诱导状态转变以形成不溶的聚集体。这也是由疏水相互作用引起的(Feil等人，1993，高分子(Macromolecules)，26，p2496-2500)。
特别地，聚N-异丙基丙烯酰胺(polyNIPAAm)聚合物已经用于多种用途，包括结合到多肽上以产生多肽-聚合物偶联物。这种偶联物被建议通过利用状态转变并因此导致的结合在多肽上的聚合物的不溶性而用来分离来自实验系统的多肽(如纯化中)，或者用来送递药物(Ding等人，1996，生物偶联物化学(Bioconjugate Chem.)，7，p121-125；Matsukata等人，1996，生物偶联物化学，7，p96-101；Chen和Hoffman，1995，高分子化学及物理学(Macromol.Chem.Phys.)，196，p1251-1259；Chen和Hoffman，1995，自然，373，p49-52；Chen和Hoffman，1993，生物偶联物化学，4，p509-514以及Park和Hoffman，1993，生物材料科学杂志聚合物版(J.Biomater.Sci.Polymer Edn.)，4(5)，p493-504)。Stayton等人(1995，自然，378，p472-474)已经将polyNIPAAm偶联到链霉亲和素上，当收缩时可以通过聚合物的折叠到达活性位点上，避免配基生物素进入，从而防止其结合到活性位点上。
当弹性肽收缩时，长度缩短50％以上。弹性蛋白聚合物可以提起超过它们干重1000倍的重量、进行工作和产生动作。一个单体VPGVG发生转变涉及的能量，据报道为2.0kcal/mol左右(Chang和Urry，1988，化学物理学通信，147，p395-400)。有人提出，弹性肽将热量/化学能转变成动作的能力使得它们具有实用性，例如在药物送递中用作弹性生物分子机器、用于生物分子的脱盐作用和用作机械化学引擎等(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841；Urry，1995，科学美国人(Scientific American)，272，p44-49)。然而这些分子的作用被限制于使用几乎完全由弹性多肽组成的合成材料，只涉及它们的弹性、能障、模板和修补性质的应用。
现已令人惊讶地发现，可以将弹性肽掺入到生物分子中，当肽在伸展和收缩状态之间转变时，生物分子的三级结构改变，因此影响生物分子的特征或性质。这可能是通过改变蛋白质有关区域的二级结构或通过改变生物分子内某些结构域相互之间的空间关系，或者两事件的组合而产生的。
因此，从一方面看，本发明提供了含有功能性部分和至少一个插入的氨基酸序列(包含在一个或多个环境参数适当变化时可收缩的弹性肽)的生物分子，其中当诱导插入序列收缩或伸展时，功能性部分的性质或特征改变。
或者可以这样看，本发明在这个方面提供了含有插入了至少一个氨基酸序列的第一部分的生物分子，所述氨基酸序列中包含当一个或多个环境参数适当变化时可收缩的弹性肽，其中当诱导该插入序列收缩或伸展时所述第一部分的性质或特征改变，或者可替代地，本发明提供因插入至少一个氨基酸序列而修饰的生物分子，所述氨基酸序列中包含当一个或多个环境参数适当变化时可收缩的弹性肽，其中当诱导该插入序列收缩或伸展时所述生物分子的性质或特征改变。
正如以前提到的，只有大的弹性聚合物被认为具有某些实用性，而且它们已经被用于这样的应用中，如药物送递或修补物质(例如血管修补)。这种明显的限制已经必然地限制了弹性聚合物被认为有用的应用。例如，生物分子诸如蛋白质中，可以插入弹性聚合物而不破坏蛋白质要求的二级和三级排列的区域有限。因此，以前认为不可能将弹性肽引入这些生物分子中而不会完全改变分子的结构和/或功能。
然而出乎意料地发现，具有少至单个弹性肽重复单位(或可收缩单位)的小寡聚体仍以与具有多个重复单位的大聚合物相似的方式应答外部刺激，进行伸展和收缩。例如，可以使用含有1-10个(如1-5个)“可收缩单位”的弹性肽，其中每个“可收缩单位”包含3-6个氨基酸。因此这些小的寡聚体可以插入到生物分子中而不显著影响生物分子的完整性，而且还将可诱导的转变机制引入到分子中。
“生物分子”意指任何分子或分子的集合，如展示生物功能并包含天然产生的组分或者它们的类似物或衍生物的复合物。此处定义的生物分子至少含有两个部分，第一部分如上文定义发挥生物功能，在此处称作“功能部分”。此功能性可能由一个或多个分子产生，如酶的亚基。第二部分是插入的弹性肽。这些功能包括酶促活性、结合、结构、活化和抑制作用。因此，本发明的生物分子的功能部分包括例如，酶、受体、抗体、辅因子、抑制剂、展示独特表位的抗原、调控蛋白及其肽(功能变体)或者具有这些功能的衍生物或类似物。
生物分子不限于多肽，还包括例如核酸分子，如插入了具有期望的弹性性质的肽的DNA模板序列或引物。生物分子可以具有一种以上功能，而且可以包含不同部分，如融合蛋白、或连接到多肽上的核酸序列、或连接到小化学成分(诸如半抗原)上的多肽。正如上文提到的，生物分子可以具有多于一种组成分子或成分。它们可以是也可以不是独立具有生物功能，例如包含一条以上多肽链的蛋白质。
天然组分的类似物和衍生物包括那些具有相似性质的，诸如使用非天然氨基酸衍生得到的多肽。
优选本发明生物分子的第一部分是天然分子，例如抗体。这些分子包括它们的功能部分、区域或结构域(功能变体)，诸如抗体的可变结构域或可变区，或者可以小如肽，例如抗原决定簇。这些天然产物的衍生物和类似物及其变体可以通过使用非天然组分、改变天然序列而产生，并且可以通过合成方法产生。天然序列可以通过取代一个或多个它们的组成成分(如氨基酸或核酸)，或通过改变不同结构域的相对排列(可选择地加入其它序列)而改变，如单链抗体的产生。本发明的功能部分和生物分子优选地包含一或多个多肽。
“插入的”，正如此处使用的，指包括氨基酸序列作为生物分子结构一部分。因此“插入的”氨基酸序列可以连接到分子(或构成生物分子的分子之一)的末端，与其一起形成生物分子；或者插入物可以连接到分子内。当生物分子内存在多于一个分子时，氨基酸插入物可以连接或不连接到提供功能部分的分子上。优选的连接是共价的。尤其优选地，氨基酸序列被插入到组成成分如氨基酸或核酸之间，形成至少是与剩余生物分子一部分成为连续链的一条链。
可以理解，在对生物分子结构破坏最低限度化的许多情况中，插入的氨基酸序列应当取代被插入分子的一部分，例如取代功能部分的一部分。这方面形成本发明优选的特征。例如，在多肽生物分子的情况中，插入的序列可以取代从宿主多肽中去掉的相同或相似数目的氨基酸残基，由此保持氨基酸数目大致相同，并且使得生物分子甚至在插入弹性肽之后仍有正常空间排列。这当然要求插入的位置是适当选择的，这将在下文中更详细的考虑。
用于插入的“氨基酸序列”，正如上文叙述的，包括弹性肽，但没有必要只由弹性肽组成。因此可以在肽的一侧或两侧使用侧翼区域，以便例如促进与待插入该序列的分子的结合，提供亲合目的的识别位点，提供切割易受攻击区域(如蛋白酶或酸/碱敏感)，模拟插入序列将取代的区域，或者为了方便。这些侧翼区域优选比较小，例如长度为1-100个氨基酸，尤其优选长度为1-20个氨基酸残基。尤其优选N末端的侧翼区域是GVG或GGVG。虽然不希望被理论束缚，但看来这种序列可能能够成核折叠β-转角。
正如此处使用的，“弹性肽”指展示可诱导的、由伸展状态到收缩状态的可逆收缩的肽，这种收缩通过减少每个可收缩单位的肽主链末端之间的距离实现，由温度、pH或压力的变化诱导，如升高温度时收缩。应当注意当“弹性肽”在生物分子内原位展示可逆收缩时，进行可逆收缩的自由度可能受限制，导致完全或部分不可逆性。优选收缩达到全长减小大于20％。尤其优选达到减少＞40％。每个可收缩单位(或重复单位)指当诱导时能够收缩的最小肽序列，如VPGVG，它可以与相同或不同序列连接。
可以被改变来诱导肽的收缩或伸展的“环境参数”，包括那些已经发现能引起合成的弹性蛋白聚合物发生状态转变的参数，诸如温度、压力、pH的变化、加入盐或有机溶质(如改变分析物浓度)、或者通过光化学反应或电化学或化学还原。环境，正如此处提及的，表示生物分子的局部环境，即溶液或它所处的其它载体的物理参数。这些参数可以提供局部环境的各种变化的指示剂，如由于分析物浓度的变化引起的电流或颜色的变化。
应当理解，引起诱导要求的特殊变化将依赖于其它环境参数的状态，因为它们在影响肽的疏水性相互作用中存在相互关系，而且将受本发明的生物分子中选择的弹性肽的影响。
当诱导插入的肽收缩或伸展时，功能部分的“性质或特征改变”包括功能部分的结构或几何学发生可逆的和不可逆的变化，以至于那个区域产生的生物活性受到影响。这包括活性的丧失、活性的升高或降低、或者活性的改变，以至于具有不同的特征，如对特殊的酶促或结合反应展示不同的动力学参数。
诱导收缩或伸展还可能引起功能部分的以前没有观察到的活性，其潜在的或受抑制的活性被引发或增强。这可能是由于功能部分各不同结构域(可能在一个或多个分开的分子上)之间相互作用的空间改变引起的，通过功能部分单个结构域的修饰而影响它与其它离散分子(如结合伙伴)的相互作用引起的，或通过改变功能部分与弹性肽的空间关系进行修饰引起的。
通过例如适当选择弹性肽，使得肽的诱导引入不能逆转成伸展状态的β-转角，可以引起不可逆变化。
适用于本发明的合适的弹性肽变化很大，而且只要求它们具有上述可诱导的可收缩特征，肽优选地具有序列(XP/G(X)m)n，其中XP/G(X)m代表可收缩单位，其中的P/G是脯氨酸或甘氨酸，每个X是任何氨基酸而且可以是相同的或不同的，m是1-10的整数，n是1-100的整数，序列中的每个单位可以是相同的或不同的。
优选地每个X选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸以及它们的衍生物，如β-丙氨酸，或其它疏水氨基酸残基，优选脂族疏水氨基酸残基。尤其优选地，X是甘氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。因此，在一个优选的方面中，该通式序列可以是(XPGXG)n(即(X)m＝GXG)或(XPGX)n(即(X)m＝GX)。尤其优选地，序列XP/G(X)m是序列VPGVG(即(X)m＝GVG)、VPGV或IPGVG。可以理解，既然使用的弹性肽应具有独特的收缩转变温度(取决于它的序列)，因此可以相应地修饰一个或多个X残基来达到期望的收缩温度，如使用更多的亲水氨基酸残基。
其它可用于本发明的合适的弹性肽具有序列(PEXK)n或(XKEXPEKX)n(分别衍生自可收缩的肌蛋白质tintin的序列和已知会发生冷变性并且当加热时形成α-螺旋的人造多肽)，其中P、E和K分别指脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸，而且每个X可以是相同的或不同的，n如上文说明的。优选在后一个序列中X是亮氨酸或缬氨酸。尤其优选序列PEXK是PEVK，序列XKEXPEKX是LKELPEKL。
优选m是1-6，尤其优选1-3。优选n＝1-10，尤其优选1-5。尤其优选弹性肽的长度是5-25个氨基酸，如5、15或25。特别优选使用长度为5-100个氨基酸、特别是8-20个氨基酸的氨基酸插入物。
本发明的生物分子可以通过化学合成产生，例如通过手工或自动合成适当多肽链或多肽/核酸分子而产生。合成可以在溶液中或在固相支持物上(使用本领域已知的合适固相)进行。合成或天然产生的完整分子的各个分立部分，可以通过化学反应共价连接起来。或者，当生物分子完全由一条多肽链组成时，则可以通过表达编码该生物分子的DNA序列产生。含有编码本发明生物分子的序列的核酸分子形成本发明的另一方面。含有这些核酸分子的载体DNA形成本发明的又一特征。这些载体可以用来表达本发明的生物分子。
本发明生物分子的应用极其多样，而且是建立在要求生物功能发生变化的任何应用基础之上的，这些应用形成本发明的又一方面。由于这种变化可以通过，例如，压力、温度或pH的变化诱导，所以可以将诱导型触发引入到甚至最敏感的系统中。这些应用中的大多数涉及引入弹性肽转换器到多肽中。这样，当肽收缩或伸展时，这些多肽的功能部分提供的生物活性可以被修饰(改变(如改变特异性)、增高或降低活性)。
正如前面提及的，优选将弹性肽插入到生物分子的分子(之一)中不影响该分子功能的位点处。因此，例如，当将插入物置于这些分子内并与它们形成连续链时，插入点通常是不会显著影响构成功能部分的结构域的三级结构的位点。在蛋白质中，这可以是表面环(Hawrani等人，1994，Tibtech，12，p207-211)，或在下文描述的单链抗体实例中是接头区。表面环长度通常为2-12个氨基酸，可以被相似大小的弹性肽取代。
正如此处实施例描述的，基于葡萄球菌蛋白A的IgG结合性结构域B的Fc结合性三螺旋束Z结构域(Nilsson等人，1987，蛋白质工程(ProteinEngng.)，1，p107-113)具有可以容易地被取代而不显著影响该分子表面几何性质或功能的表面区域。
被引入弹性肽的多肽可以是，例如，当收缩或伸展时转变成有活性或无活性的形式、或者活性更高/更低的形式、或改变对特殊底物、抑制剂、激活剂或辅助因子的特异性的酶。这可能是由酶或酶的相关结构域的二级或三级结构改变引起的，或者由影响酶内各结构域的相对排列或酶结构域的可接近程度引起的，由酶的其它部分或收缩的/伸展的弹性肽本身引起的。
有来自各种生物体的、具有明确活性的越来越多的酶可供利用，这使得这些催化剂在许多体外和体内系统中被广泛使用。值得注意地，分子生物学领域中的检测和分析方法要求使用至少一种涉及DNA/RNA复制、转录和/或翻译的酶。精确控制这些酶的活性通常由精确了解它们对pH、温度、离子强度和辅助因子的要求并考虑对它们的活性比较重要的其它标准来实现。不只是控制这些酶激活的能力是重要的，灭活这些酶的能力(通常是可逆的)也是重要的。开启和关闭酶活性的能力对特定分析或诊断实验的正确进行通常是至关重要的。
作为此处描述的发明的结果，酶反应的生物活性现在可以由转换器机制来控制，从而这些反应可以由改变插入肽的状态来开启或关闭。这避免了以某些其它方式除去酶或引入抑制剂或灭活酶(通常是不可逆的)。实例包括聚合酶在聚合酶链式反应(PCR)中的使用，和反应起始后只需要在反应已经达到某个温度时才显示它们的活性以降低非均质产物产量的相关技术。这通常通过使用热启动方法克服，其中聚合酶只在温度升高后被激活，这可以通过在达到该温度时向反应混合物中加入聚合酶或至关重要的组分而完成。本发明提供了另一种可供选择的热启动方法。
此外，存在几种由涉及铰链移动的构象变化调控的酶，如乳酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、甘油三酯脂肪酶、腺苷酸激酶(Gerstein，M.，等人，1993，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，229，p494-501，及其参考文献)。弹性肽可以用于取代环、铰链和连接处，此后它将对温度或其它环境改变产生应答。热稳定性和/或热不稳定性也可以通过将弹性肽引入到具有热敏感性的蛋白质中取代合适的区域而改善。
酶反应的持续时间也可以通过在最初的混合后使特定环境参数(如温度、压力或pH)在严格控制的一段时间内改变，从而诱导达到精确控制。这特别适用于参数可以容易地改变或作为该方法的结果而变化的方法中。这样，生物分子可以在某些温度诱导从而提供满意的活性，如酶活性，这种活性可以用于诸如温度具有变化的发酵等工艺中。
或者，如果功能部分提供结合功能，诸如在抗体(优选单链抗体)的情况中，则结合可以将按需要被开启或关闭，或者可逆地或不可逆地改变。许多应用就来自这种可能性。例如，可以通过将具有结合功能的生物分子结合在固体支持物上而制成亲和柱。然后将含有结合对中要提取的另一个成员的样品与固体相在结合可以发生的条件下接触。经过清洗或其它步骤之后，可以通过其中含有的弹性肽的收缩/伸展适当地改变生物分子的结合作用而释放结合的分析物。因此生物分子可以用于纯化和提取目的，从而提供结合对中的一个成员，如果需要的话它可以被固定化。
大量适用于这种目的的固相支持物在本领域是众所周知的而且在文献中有广泛描述，通常说来，固相支持物可以是在化学或生物化学方法中被广泛用于或建议用于固定、分离等的任何熟知的支持物或基质。因此例如，固相支持物可以具有颗粒、片层、凝胶、滤器、膜、微纤维束、管或板、纤维或毛细管的形式，由例如聚合物材料，如琼脂糖、纤维素、海藻酸盐、聚四氟乙烯、乳胶或聚苯乙烯制成。微粒物质，如小珠，通常是优选的。
固相支持物可以方便地包含磁性颗粒，从而可以通过磁性聚合容易地分离固定化的物质。这些磁性颗粒优选是超顺磁性的，以避免磁性的剩磁并由此成团，而且有利的是单分散的以提供均匀的动力学和分离。超顺磁单分散颗粒的制备由Sintef在EP-A-106873中描述。由DynalAS(Oslo，挪威)出售的商品名为DYNABEADS的单分散多聚超顺磁珠是市售磁性颗粒的例子，可以根据本发明使用或经修饰后使用。
其中功能部分具有结合功能的生物分子的实例是单链抗体，正如在Ladner等人的US 4946778和5260203；Creative Biomolecules Inc.的WO88/09344；和Enzon公司的WO93/11161和WO94/12520中描述的，其中抗体的轻链和重链可变区通过一个或多个接头区连接。在正常构象中，这些分子采取的排列方式使单链形成两个分离的结构域，由接头区连接，其中结构域一起相互作用以形成与天然抗体中相同的结合位点。
接头区优选长度为10-30个氨基酸，尤其优选12-15个残基可以被具有此处所述弹性肽的氨基酸序列至少部分地取代以形成本发明的生物分子。当诱导收缩时，接头的长度将变短，使任一末端的结构域被迫改变它的正常构象，导致结合位点改变，从而防止或改变抗原结合。
可替代地，接头可以被在伸展状态时相对更长的弹性肽取代，从而结构域仍不能适当地相互作用。当诱导收缩时，肽将缩短至合适的长度，使结构域接触，由此增加与抗原的亲合力。另外可替代的是，如果少于10个氨基酸的弹性肽被用于取代接头，则若这个区域足够短，接触将可以导致二聚体的形成，其中两条单链抗体变成二聚体，从而形成抗原结合位点。以这种方式可逆产生二聚体和由此形成的二聚体是本发明优选的方面。因此将看到，可以利用收缩和伸展以积极的或消极的方式影响功能，这依赖于选择的弹性肽的性质，如长度。
在进一步的实施例中，弹性肽可以插入到亮氨酸拉链结构中。可以选择合适的肽，使得收缩或伸展导致分离的结构域开始接触或不接触。
本发明的非多肽生物分子包括插入了氨基酸序列的核酸分子。
本发明的生物分子可以由弹性肽及它所连接的两个独立结构域(诸如配基受体、抑制剂酶或核酸模板阻遏子对)组成。可以利用诱导收缩或伸展使各对的适当结合区域开始接触或不接触，从而可以起始、终止或改变由相互作用产生的结果。
本发明的生物分子可以用作生物传感器，来检测或监控生物分子局部环境参数的变化，诸如温度或分析物浓度。对于这些目的，优选使用可逆诱导型生物分子。在这种情况下，当这样的参数变化时，弹性肽将适当地应答，选择它所插入的生物分子，使得可以检测出它的特征改变，如产生有色产物的酶活性的激活。
如果得到被修饰的抗体(或其它结合蛋白)，则可以通过诱导对确定的物理刺激发生反应而破坏活性位点，从而控制它们与抗原的结合。这些蛋白质在纯化和检测过程中有用处，如可用于ELISA或其它结合实验中。也可以应用于大量筛选中。这些实验方法和进行它们的试剂盒形成本发明的又一些方面。
此外，本发明的生物分子可以用来构建如表达随机肽的文库，诸如细菌噬菌体或RNA翻译衍生文库。因此该文库的每个成员将包含融合分子，其中弹性肽与用来表达的肽(或寡核苷酸)相连。因此，通过例如将特异性结合性质可逆地引入文库成员中，这些融合分子的性质可以通过弹性肽的收缩或伸展而改变，从而例如有助于筛选过程中的淘选。
具体地说，本发明的生物分子在诊断实验中的使用形成本发明的优选方面。
此外，本发明的生物分子可以用于治疗应用。因此，例如，可以修饰具有有益治疗性质的分子以产生本发明的生物分子，其中至少该生物分子的一部分可以通过它们所处环境的环境参数影响。
在这方面，可以使用具有一个以上功能的生物分子。可诱导的功能可以是期望的治疗活性或可以是生物分子中可以变化以协助治疗处理的一方面，如可以用来可诱导定位到特定区域，如用来将治疗活性定位或用来从身体部分或流体中除去生物分子。
例如，本发明的生物分子可以用于体液的体外处理，通过改变它们所处体液或者体液的状态，如压力或温度，可以使它们的活性升高、降低或适当地改变。作为进一步的实施例，本发明的生物分子可以局部地或系统地施用于人或动物体，使它们因身体的局部环境参数改变，如通过胃肠道过程的pH变化，或温度波动，如达到37℃，或在感染位点达到更高温度而发生功能变化。或者，可以改变生物分子局部环境的变化，从而引起生物分子中弹性肽收缩或伸展，并由此改变它的功能性。因此，例如，生物分子(例如具有在不收缩时不具备的酶活性)可以局部地或系统地应用，并例如通过表面或体内加热处理该位点以改变此处环境参数从而被激活。
应当理解，医疗用途的生物分子应当根据已知的技术和特异于生物分子的治疗功能性的服用方法给药。
因此，本发明还提供本发明作为药物使用的生物分子。或者，本发明提供使用有效量的本发明生物分子来治疗人或动物体疾病或紊乱的方法。
对本领域技术人员清楚的是，上文描述的发明的应用是相当多的，不受上文描述的少数实例所限制。
现在，本发明将参照下列非限制性实施例进行描述，其中

图1显示了H-GGVG(VPGVG)-OH(D肽)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7)中的CD波长扫描；图2显示了E肽(图中用空心方框表示，Ac-GVGVPGVG-NH2)、G肽(图中用圆圈表示，Ac-GGVGVPGVG-NH2)和H肽(图中用实心圆表示，Ac-GGVGVPGVG-OH)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的熔解曲线；图3显示了D肽(H-GGVGVPGVG-OH)在不同pH(图中的空心方框表示pH7.0，200nm；圆圈表示pH4，198nm；实心圆表示pH9.5，200nm)的熔解曲线；图4显示了J肽(图中用圆圈表示)和N肽(图中用实心圆表示)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的熔解曲线；图5显示了Ac-GVG(VPGVG)3IL-NH2(N肽)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的可逆性，其中显示了在20℃(图中用实线表示)或在70℃温育后转移到20℃(图中用虚线表示)时的结果；图6显示了L肽在15.5℃的浓度依赖性，插入的小图显示了MRE在199nm(图中用圆圈表示)和210nm(图中用实心圆表示)随浓度的变化；图7显示了L肽在62.5℃的浓度依赖性，插入的小图显示了MRE在199nm(图中用圆圈表示)和210nm(图中用实心圆表示)随浓度的变化；图8显示了SDS和TFE对E肽的影响；图9显示了SDS和TFE对L肽的影响；图10显示了TFE浓度升高对L肽的影响，a)在各种浓度下的影响；b)在198nm(图中用圆圈表示)、206nm(图中用实心圆表示)或213nm(图中用空心方框表示)测量的在不同TFE浓度下的影响；图11显示了温度和TFE在a)6.8℃或b)58.6℃对L肽的影响；图12显示了D肽和L肽于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中在不同温度下的CD波长扫描；(a)在1.1℃(图中用圆圈表示)、15.4℃(图中用实心圆表示)、25.0℃(图中用空心方框表示)、34.5℃(图中用实心方框表示)、43.8℃(图中用三角框表示)、53.0℃(图中用黑三角表示)、63.0℃(图中用倒三角框表示)和81.5℃(图中用黑倒三角表示)记录D肽(49.1μM)；(b)在1.3℃(图中用圆圈表示)、15.4℃(图中用实心圆表示)、34.0℃(图中用空心方框表示)、48.4℃(图中用实心方框表示)和76.6℃(图中用三角框表示)扫描L肽(20.7μM)；图13显示了八或九肽的C肽(37.1μM)、D肽(49.1μM)、E肽(38.5μM)、G肽(41.8μM)和H肽(31.3μM)以及更长的J肽(16.4μM)、L肽(20.7μM)和N肽(17.9μM)在10mM乙酸盐或硼酸盐缓冲液(图a)中，或者在10mM磷酸盐缓冲液(图b和c)中，在不同温度下从190-240/260nm扫描得到的熔解曲线，其中将位于或接近200nm的平均残基椭圆率(mean residualellipticity)对温度作图，图中还显示了范特霍夫拟合；(a)九肽C肽(图中用圆圈表示，201nm，pH4.0)、D肽(图中用实心圆表示，200nm，pH9.5)和G肽(图中用空心方框表示，201nm，pH9.5)的熔解；(b)八和九肽的H肽(图中用实心方框表示，202nm)、E肽(图中用三角框表示，199nm)和D肽(图中用黑三角表示，200nm)的熔解；(c)18-21肽的N肽(图中用倒三角框表示)、J肽(图中用黑倒三角表示)和L肽(图中用菱形框表示)在199nm的熔解；图14显示了在pH7.0的可逆性和浓度依赖性；(a)18肽L肽(91μM，于10mM磷酸盐缓冲液)在加热前于20.6℃的扫描(0.5mm比色杯，0.5nm间隔，，扫描4次，每次1sec整合时间)(图中用实线表示)，和在70℃温育30分钟后再迅速冷却到20.6℃的扫描(图中用虚线表示)。(b)和(c)显示了MRE的浓度依赖性。使用不同的石英比色杯(0.5mm、2mm和10mm)，L肽的浓度在4.6-264μM范围内变化(b)，并且相似地，8肽的E肽在45-855μM范围内变化(c)。显示了L肽在15.5℃或E肽在15.6℃(图中用圆圈表示在199nm，用实心圆表示在210nm)和L肽在62.5℃或E肽在48.3℃(图中用三角框表示在199nm，用空心方框表示在210nm)的平均残基椭圆率的变化；图15显示了B肽在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的熔解曲线的拟合；通过优化相关范特霍夫特征图的线性，将199nm处的CD数据(图中用空心方框表示)拟合宏观的可逆两相模型。通过使用来自最初模型(在图(a)中用虚线表示)的拟合转变终点[θ]F和[θ]U，构建相应的范特霍夫特征图(在图(b)中用圆圈、虚线表示)，其线性相关系数(r)为-0.91。固定[θ]F之后，范特霍夫特征图的相关系数提高到-0.98。图(b)和图(a)分别显示了相关线的数据(在图中用实心圆和实线表示)及其当[θ]F固定时MRE数据对温度的相应拟合(在图中用实线表示)；图16显示了8和9肽弹性蛋白肽热转变的平均熔解温度，其中大数字代表来自表6的8肽(A肽、B肽、E肽和F肽)和9肽(C肽、D肽、G肽和H肽)的平均TM值。“低TM”值是A肽和F肽(或9肽的C肽和H肽)在pH4.0或pH9.5以及E肽(9肽为G肽)在pH4和9.5的最低熔解温度的平均值——形成不带电荷分子的pH值。相似地，“高TM”值代表A肽和F肽(C肽和H肽)，以及B肽(9肽为D肽)在pH4和pH9.5的高TM的平均值——形成带电荷分子的pH值。斜体的小数字代表平均TM值间的差异；图17显示了SDS和TFE对E肽和L肽的影响，其中在水中(图中用圆圈表示)、在2mM SDS中(图中用实线表示)、在25mM SDS中(图中用等长虚线表示)和在87％(v/v)TFE中(图中用不等长虚线表示)，于20.5℃下，用0.5mm石英比色杯扫描(扫描4次，0.5nm间隔，1sec整合时间)(a)E肽(218μM)和(b)L肽(91μM)。(c)也在不同浓度TFE中，于15.7℃，在2mm比色杯中，测试了L肽(20.7μM)，图中显示了在198nm(图中用实心圆表示)、在206nm(图中用空心方框表示)和在213nm(图中用实心方框表示)处平均残基椭圆率随TEE浓度的变化；图18显示了1-4号肽在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的圆二色性波长扫描，其中在10mM缓冲液中，在6.4℃，用0.2cm密闭比色杯，对肽进行一次扫描(5sec整合时间，0.5nm步长，2.0nm狭缝)。浓度分别为1号肽21.4μM、2号肽26.9μM、3号肽29.7μM和4号肽21.1μM；图19显示了三氟乙醇(TFE)浓度对肽的影响，其中显示了磷酸盐缓冲液中TFE浓度增加对1号肽(a)和2号肽(b)的影响。在6.4℃对肽进行一次扫描，其中实验条件和肽浓度与图18中所述相同。图(c)显示了对1号肽(图中用圆圈表示)、2号肽(图中用实心圆表示)、3号肽(图中用空心方框表示)和4号肽(图中用实心方框表示)在222nm处的平均残基椭圆率的影响；图20显示了在缓冲液和三氟乙醇(TFE)中温度对肽的影响，其中图(a)显示了1号肽在不同温度下的CD波长扫描(实验条件如图18所述)。插图是1号肽在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的扫描，而大图显示了肽在30％(v/v)TFE的磷酸盐缓冲液中的扫描。使用三次独立扫描(整合时间5sec，在0.2cm比色杯中，2.0狭缝)的平均值，追踪肽在222nm的熔解。图(b)显示了在不同溶剂中，温度对1号肽的影响。分别为含20％(v/v)TFE(图中用圆圈表示)、60％TFE(图中用实心圆表示)和25mMSDS(图中用实心方框表示)的磷酸盐缓冲液和只有磷酸盐缓冲液(图中用空心方框表示)。图(c)显示了1号肽(图中用三角框表示)、2号肽(图中用黑三角表示)、3号肽(图中用倒三角框表示)和4号肽(图中用黑倒三角表示)在60％(v/v)TFE中的熔解。将图(b)和图(c)中的数据拟合具有固定转变前终点的两相转变(详见方法部分)。测试了熔解的可逆性，如图(a)所示(图中用虚线表示)；图21显示了结合动力学拟合表面等离子体振子共振(surfaceplasmon resonance)结合数据以构建适当的动力学模型，其中各小图分别显示了1号肽(0.32μM)在15℃的结合动力学数据拟合单组分(A+B＝AB)模型(a)或双组分(A+B1+B2＝AB1+AB2)模型(b)。粗线是对原始数据(图中用圆圈表示)和用于拟合的相关残基(图中用实心圆表示)的拟合；图22显示了1号肽和2号肽在19.9℃结合Fc-IgG2a的动力学参数的测定，其中1号肽结合Fc-IgG2a的结合速率通过将ks1(图中用圆圈表示)和ks2(图中用实心圆表示)对所测最低浓度绘图得到，图(a)(III)，2.5μM；(IV)1.25μM；(V)0.63μM；(VI)0.31μM(详见插图)。结合速率由上述数据线性拟合的斜率得到。只有ks2对肽浓度的拟合得到显著的结合速率，ks2＝148，396M-1s-1(线性相关系数(r)＝-0.98)。用最高浓度(I)25μM或(II)5μM，也测定解离速率200秒钟左右(大图)。在这种情况下，5μM给出了最高解离速率，分别为koff1＝2.4×10-3s-1和kOff1＝0.237 s-1。相似地，通过将ks1(图中用圆圈表示)和ks2(图中用实心圆表示)对分析物的各自浓度绘图，得到2号肽的结合速率(图b的插图)[(II)，773.6μM；(III)，386.8μM；(IV)200.8μM；(V)193.4μM；(VI)150.63μM；(VII)，100.5μM；(VIII)，96.7μM]。kon1为74M-1s-1，相关系数(r)＝0.3；kon2为502M-1s-1，相关系数(r)＝0.98。1.547mM解离相(I)200秒钟左右得到解离速率为0.367s-1和8.9×10-6s-1；图23显示了1号肽和2号肽快速动力学常数的温度依赖性，其中1号肽(图中用圆圈表示)和2号肽(图中用实心圆表示)各自的动力学常数显示于图a、图b和图c。图a)显示了快速解离速率，图b)显示了快速结合速率，而图c)显示了在不同温度下它们各自的快速解离常数(＝koff/kon)。使用BIAevaluation2.1拟合解离速率，使用BIAevaluation2.1和GRAFIT(Leatherbarrow，1989，Grafit3.01版，Erithacus软件有限公司)拟合结合速率。结合速率和解离速率都显示它们的拟合标准误差。解离常数的标准误差根据kon和koff的SE人工计算；图24显示了2号肽相对于1号肽的结合自由能(ΔΔG)的温度依赖性，其中如方法部分中所述计算不同温度的结合自由能，显示了相对不同温度的ΔΔG(ΔΔG＝+RTXln[KD(2号肽于TX)/KD(1号肽于TX)])。使用GRAFIT(Leatherbarrow，1989，见上文)的数据线性拟合得到线性相关系数(r)为-0.99，斜率为-0.0570±0.007kcal·mol-1·K-1(截距20.2±2.0)；图25显示了2号肽和4号肽在缓冲液中的温度CD波长扫描，其中对2号肽(163.4μM)溶于加入了0.005％(v/v)表面活性剂P20的Hepes缓冲盐溶液(HBS)中的溶液，在不同温度下，从198nm到260nm扫描一次(0.05cm石英比色杯，5s整合时间，2.0nm狭缝，0.5nm步长)，如图a)所示。相似地，在不同温度下，于10mM磷酸盐缓冲液(pH7)中，用0.2cm比色杯对2号肽(31.8μM)和4号肽(24.1μM)进行扫描，2号肽显示于图b)，4号肽显示于图c)。粗虚线显示了加热到60-80℃后在25℃左右再次扫描的扫描可逆性；图26显示了2-4号肽在磷酸盐缓冲液和HBS中的熔解，其中通过在不同温度下测量222nm/260nm的CD椭圆率(0.2cm比色杯，2.0nm狭缝)，平均三次的独立扫描(整合时间5s)，由此追踪不同肽的熔解。图a)显示了2号肽(图中用圆圈表示，31.8μM)、3号肽(图中用实心圆表示，32.7μM)和4号肽(图中用三角框表示，24.1μM)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的熔解。同样地，图b)是2号肽(图中用实心方框表示，27.0μM)和4号肽(图中用空心方框表示，24.1μM)在含有0.005％表面活性剂P20的Hepes缓冲盐溶液(pH7.4)中的熔解曲线；图27图(a)显示了pDAP2质粒的结构，图(b)显示了pUC119His6mycXba的结构；图28显示了3D6基因接头区的序列；图29显示了3D6基因和质粒中相关引物的结构和位置。RBS是核糖体结合位点的缩写，ALK.PHOSPHAT是碱性磷酸酶的缩写；图30显示了接头区(I)的装配；图31显示了接头区(II)的装配；图32显示了接头区(III)的装配；图33显示了接头区(I)和(III)的结构；图34显示了在本发明中使用的各种寡核苷酸的序列；图35显示了用固相肽合成法合成的5号肽和6号肽的序列；图36显示了6号肽在不同溶剂中的CD扫描。在0.01mm石英比色杯中，25℃，10秒整合时间，0.5nm间隔，对1.5mM肽进行扫描；图37显示了通过在不同温度下结合到固定化Fc-561(3400RU)上，而在BIAcore2000上分析5号肽(1μM)(图A)。流速含0.005％P20的HBS30μl/min。图B显示了同样的500nM 6号肽与Fc-561的结合；以及图38显示了5号肽和6号肽在不同温度下的快速结合和解离速率(以及解离常数)(如实施例3所述进行分析)。
实施例1短弹性肽的设计合成短弹性蛋白肽(5-25肽，具有3-6个氨基酸的侧翼序列)，并用圆二色性法(Circular Dichroism，CD)进行分析。通过监测在197-200nm和205-212nm处CD振幅的减小，测定这些肽折叠的转变温度(Tm)。缩写CD，圆二色性法；ESP/MS，正电喷雾质谱法；Fmoc，Nα-9-芴甲氧基羰基；Fmoc-PAL，5-[4-(9-芴甲氧基羰基)-氨甲基-3，5-二甲氧基苯氧基]戊酸；HOBT，1-羟基苯并三唑水合物；HPLC，高效液相色谱法；PEG，聚乙二醇；PS，聚苯乙烯；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；SDS，十二烷基硫酸钠；[θ]M，MRE，平均残基椭圆率。材料和方法材料肽合成试剂等级的Fmoc氨基酸和Fmoc-PAL-PEG-PS树脂购自Perspective Biosystems GmbH公司(汉堡，德国)。反式雄甾酮和二噁烷购自Fluka。乙酸酐和甲醇为肽合成等级购自Applied Biosystems公司(现为Perkin Elmer公司Applied Biosystems部)。
肽的合成和纯化A-O肽(详见表1)在Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(得到酰胺化C末端的肽)或在Fmoc-Gly-PEG-PS树脂(Millipore公司，Watford，英国；得到游离C末端)上，使用MilliGen/Biosearch 9050肽合成仪(Millipore公司，Bedford，MA)，用固相Fmoc化学法，在0.1mmol水平进行合成。使用标准化学法(Fmoc/HOBT活化)和步骤，但是由于其偶联动力学较慢，因此第一个氨基酸(Gly)要求多于12小时偶联到Fmoc-PAL-PEG-PS上。其它氨基酸用标准化学法和供应商提供的方案偶联，通常每一个氨基酸需要89分钟的周期。偶联效率通过使用Acid Violet 17染料颜色记录544nm的吸收值进行连续跟踪，结果产量超过95％。在DMF中用乙酸酐将树脂乙酰化(用于N末端受保护的肽)后，依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚清洗树脂，然后用N2干燥。
从树脂上切下肽，并用含5％茴香硫醚、3％1，2-乙二硫醇和2％苯甲醚的TFA作为清除剂处理(于20℃处理4-6小时)进行去保护。切下的肽加入10倍过量的汽油醚清洗，然后在过量乙醚中沉淀。将固体肽溶于去离子水并冻干。
将从TFA切下的粗品肽加到分析用的HPLC(LKB公司，Bromma，瑞典)上。用含乙腈梯度4.5-54％的0.1％TFA，于20℃，经91分钟，在C18柱(Vydac，250×5mm，10μm孔)上，对它们进行分析。在214nm检测到A-O肽并分别洗脱(0.7ml/min)A-H18-20.5％乙腈；I33％；J32％；K31％；L29％；M31％；N33％；以及O36％乙腈。大量纯化使用WatersHPLC(Water公司，英国)，于20℃，用范围较窄的梯度进行洗脱，如对于A-H肽，使用含乙腈梯度13.5-22.5％的0.1％TFA经90分钟洗脱。以10ml/min流速使用制备性240×24mm Vydac C18柱(10μm孔)对肽进行层析，并在214nm检测，然后冻干。
将经纯化的肽以10ng/μl的浓度溶于含1.0％乙酸的1∶1水/甲醇，并在ESP/MS(配备了VG Ahalytical Electrospray的VG Autospec，Fison公司，英国)上分析纯度和均一性。对样品进行定量和定性的氨基酸分析(将样品在N2气下在HCl中于110℃水解24小时，然后冻干，溶于pH2.2的柠檬酸盐缓冲液，并在Pharmacia AlphaPlus II氨基酸分析仪上进行分析)。
圆二色性研究用异雄甾酮(ISO)的二噁烷溶液(1.25mg/ml)或(+)-10-樟脑磺酸(CSA)的水溶液校准Jobin-Yvon CD6型二色谱仪(Instruments S.A.英国有限公司，Stanmore，英国)，记录CD光谱(Johnson，1990，蛋白质结构，功能，遗传学(ProteinsStruct.，Funct.，Genet.)，7，p205-214)。ISO校准根据供应商的说明书在304nm进行(使用1.0cm石英比色杯得到强度142.5ΔA)。
使用购自Hellma的石英比色杯(0.5-2mm，带帽)，并且在分析过程中用水浴对CD仪进行温度控制并用N2持续净化。将样品冷却至1℃然后逐步提高温度，使样品平衡于1-85℃范围内的每个温度达5分钟，从而进行温度CD扫描。用Fluke 51 K/J数字温度计测量比色杯的温度。
收集190-260nm扫描结果(间隔0.5或1.0nm，带宽2.0nm，整合时间1秒)，完成扫描。在电脑上处理扫描结果，使用1.1版DichrographSoftware(Jobin-Yvon/Instruments S.A.，法国)中的Sabitzky Golay算法修正4-15次扫描的平均值。用0.22mm滤器过滤缓冲液(10mM)并以13000rpm离心除去尘土和空气。所有光谱用240/260nm的椭圆率对缓冲液和离轴偏移(off-axis drift)进行基线校正。将经纯化的肽溶于去离子水，然后在10mM缓冲液中稀释44倍，确保比色杯中肽的浓度始终低于80μM(以使样品在所有光谱区域中的吸收值低于1.0)。
使用定量氨基酸分析法测定肽母液的浓度。将每个波长的数据除以肽的残基数，从而将肽摩尔椭圆率转换成平均残基摩尔椭圆率([θ]，度·Gm2/dmol)。
将波长扫描(190-240/260nm)的单个波长对不同温度作图。使用观察得到的CD数据([θ]obs)、温度(T)和转变的固定终点(高温折叠形式[θ]F和低温未折叠形式[θ]U)，将在较高温度下转变成折叠形式所需的自由能拟合成宏观的、可逆的两相模型(1)。
ΔGU-F＝-RT ln[([θ]obs-[θ]U)/([θ]F-[θ]obs)](1)由于肽的分子量低，将热容量设为零，由此用方程(2)和(3)、或对于18-28肽使用(2)和(4)，将所有数据拟合成范特霍夫图。对于折叠前和折叠后基线具有斜率的转变，方程(4)考虑了斜率的影响(m)和离轴调整(off)。
ΔGU-F＝ΔHU-F-TΔSU-F(2)[θ]obs＝([θ]U+[θ]F×exp-(ΔGU-F/RT))/(1+exp-(ΔGU-F/RT)) (3)[θ]obs＝([θ]U+[θ]F×exp-(ΔGU-F/RT))/(1+exp-(ΔGU-F/RT))+m×T+off (4)用Grafit软件(Leatherbarrow，1989，见上文)，采用最小二乘拟合(least squares fitting)对数据进行分析，并且使用CD的数据[θ]obs以及前面拟合的转变终点[θ]U和[θ]F，绘制范特霍夫图(lnK对1/T作图，其中K＝([θ]obs-[θ]U/([θ]F-[θ]obs)。在最初的自由拟合使范特霍夫图的线性相关系数较低(r＜|-0.90--0.93|)的某些情况下，使用最初拟合的值作为终点和起点并固定[θ]U和[θ]F中的一个或者两个，将数据重新拟合。这使得相关系数更接近-1。通过固定来自最好的范特霍夫图的[θ]U和[θ]F，由方程(2)-(4)得到新的ΔH和ΔS的拟合。使用关系式Tm＝ΔH/ΔS计算所有肽的转变温度Tm。
肽的电脑模拟通过从分子动力学模拟中求出φ(phi)和
(psi)角，建立类弹性蛋白肽高温和低温形式的模型(Wasserman和Salemme，1990，生物聚合物(Biopolymer)，29，p1613-1631)。所有的模拟都是在Silicon GraphicsIndy上使用Insight 95和Discover 2.6.0(分子模拟有限公司(MolecularSimulations Inc.))进行的。结果弹性蛋白短肽的设计Urry及其同事有许多报道，描述化学或物理诱导的弹性蛋白聚合物的结构转变(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。然而，描述的所有这些转变模型中，没有一个对弹性蛋白较短肽进行过检验。还发现弹性蛋白肽中N和C末端帽子结构的长度和存在影响聚集的转变温度(McPherson等人，1992，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)，8，p347-352)。CD光谱和热弹性数据之间的相关性也有报道(UDrry等人，1985，生物化学及生物物理学研究通讯，130(1)，p50-57；Urry等人，1986，国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Prot.Res.)，28，p649-660)。
在本研究中，设计了弹性蛋白短肽以测试序列变化对观察到的构象转变的影响。特别感兴趣的是N和C末端乙酰化和酰胺化的影响，以及加在8肽(表1，A-H肽)N末端的额外甘氨酸的影响。此外，推论N末端的甘氨酸与N和C末端的电荷一起将提高肽的灵活性和溶解性(Haxpaz等人，1994，美国国家科学院进展，91，p311-315)。为了测试在弹性单位(-VPGVG-)数和结构折叠的转变温度之间是否存在相关性，我们还合成了18肽(3个VPGVV单位)和28肽(5个VPGVG单位)(表1，E肽、L肽和O肽)。为了测量疏水序列对类弹性蛋白18肽折叠的转变温度的影响，在C末端逐步引入了额外的亮氨酸和异亮氨酸残基(表1，L-N肽)。
人们还认为这些位于C末端亮氨酸和异亮氨酸残基附近的额外甘氨酸可能影响这个疏水片段的灵活性(表1，I肽)。我们也研究了邻近弹性序列或位于其中的带电荷残基的影响。在一个设计中，将一个额外巯水残基放置在N末端带电荷的赖氨酸附近(表1，J肽)，将一个谷氨酸残基放置在弹性蛋白序列的中部(表1，K肽)。在不同温度下用CD研究所有上述肽设计，而且，如果可行，还获得热力学数据。
肽的纯化和分析合成表1显示的15种弹性蛋白短肽序列，并在HPLC上用窄梯度条件纯化。这些肽在反相分析HPLC上以单个峰洗脱，说明它们是纯的，每种肽的类型、纯度和浓度用ESP/MS和氨基酸分析测定并证实(表2)。
肽的CD分析短肽和较长肽在缓冲液中不同温度下的CD光谱显示相似的曲线(图1显示了由D肽得到的结果)。全局最小值(global minimum)在一定程度上取决于缓冲液(表3)，但是通常在198-200nm范围内——发现更杂乱的肽也如此(Woody，1995，酶学方法，246，p34-71)。然而，与理想无规线团的-40,000deg cm2dmol-1相比较，这些短肽在1℃的最小平均残基椭圆率为-7,000--10,000deg cm2dmol-1。这在Urry等人就较长弹性蛋白聚合物观察到的范围内(Urry等人，1986，见上文；Urry等人，1985，见上文)，据报道(VPGG)n和(VPGVG)n聚合物为-5,000--16,000deg cm2dmol-1。较长的I-O肽的相应值在-17,000--19,000范围内。这有些令人惊讶地说明，在低温下较短肽比较长肽具有更有序的结构。这些数值是那些无规线团和II类β转角的等摩尔混合物预期具有的(Perczel等人，1993，国际肽和蛋白质研究杂志，41，p223-236)。而且，弹性蛋白五肽聚合体能量最小化的结构模型也含有部分折叠结构作为伸展的低温形式(Chang和Urry，1988，见上文；Wasserman和Salemme，1990，见上文)。对于所有的肽，195-205nm左右的CD振幅随温度升高而降低，而206-212nm的振幅降低较小。这个区域中的正峰是II类β转角的特征(Urry等人，1986，见上文；Urry等人，1985，见上文；Woody，1995，见上文)。
对于具有最不均匀组成的K肽(表1)，在210-230nm的CD振幅有升高，而在222nm有局部最小值(在208nm有近似的同二色性点(isodichroicpoint))。N末端具有GGYG序列的一些短肽在更高温度下也发现了这些现象。详见表1C肽和G肽于pH7以及D肽于pH4。这些光谱类似与螺旋或I/III型β转角结构相关的C类光谱。C类光谱具有激发子(II-II*)，分为位于195nm(通常由于溶解而蓝移至180nm)的正波段和位于208nm的负波段。在220-224nm左右也有强的负n-II*转变。只有波段的强度和比例与α螺旋的CD光谱不同，因而通常难以将α螺旋和I型β转角区分开(Baldwin等人，1994，国际肽和蛋白质研究杂志，43，p180-183；Perczel等人，1993，见上文；Woody，1995，见上文)。
不同肽的熔解曲线(图2-4)也令人惊讶地具有与较长弹性蛋白聚合物的曲线相似的曲线(Urry等人，1985，见上文)。对于四肽聚合物(VPGG)n，在本研究中A-H肽的转变范围是3-5,000MRE单位，较长的I-O肽增加到5-10,000(此处数据没有显示)。这比五肽聚合物(VPGVG)n中较变有16000MRE单位的变化要小。
将CD数据拟合范特霍夫方程后，有可能得到较小肽折叠的ΔS和ΔH的数据(表3)。对于一些较大肽，转变前和转变后的斜率是足够大的，以至于全套热力学分析在统计上比较困难。对于这些，只报道了转变中点(表4)。不可能测定K肽和O肽的Tm。然而所有其它肽具有正的ΔH和ΔS，暗示是熵驱动过程。8肽、9肽和21肽(表3和表4)相似的ΔH和ΔS值也说明重复区的每个残基是作为独立单位发生作用。另一方面，如表5所示，较短肽相比于21肽和弹性蛋白聚合物，每个残基的ΔH和ΔS要大许多。
8肽和9肽的Tm没有明显差异(表3)。然而，对于8肽和9肽，α-氨基的乙酰化和α-羧基的酰胺化相比于游离N和C末端(E肽和G肽与B肽和D肽比较)使转变温度降低了8-10℃。未受保护的B肽和D肽在不同pH值的Tm没有差异，说明这样或那样的电荷的存在对于短肽的结构转变具有相似的影响。支持这种意见的现象有，当一个末端被酰胺化或乙酰化而受保护时，离子形式的Tm上升(表3中，F肽与H肽比较，A肽与C肽比较)。将肽的长度由8肽增加到18肽而不改变组成，没有使Tm改变超过3℃(表4；E肽32℃与L肽35℃比较)。
将相似氨基酸残基相互紧密地置于肽的某一端，对转变温度没有影响。在N末端有两个甘氨酸的较短的8/9肽与具有一个甘氨酸的肽具有相同Tm，18/20肽C末端有亮氨酸/异亮氨酸对也如此。然而，C末端附近疏水残基的加入使肽的转变温度降低了17-21℃。对于一些肽，由于没有转变的终点，即使在200nm左右的CD振幅有相似降低，也不可能检测到明确的转变温度。这包括具有更复杂组成的长K肽以及28肽的VPG型O肽。对于K肽，实验揭示由于在1.4℃的MRE值(-20,000deg cm2dmol-1左右)较低，这种肽在较低温度可能比其它肽更无序。然而，在N和C末端有三个插入残基的J肽的转变温度为18℃。J肽中插入赖氨酸的影响被更多疏水残基所对抗，得到相对低Tm。
选择一些短肽和较长肽(C肽、E肽、L肽和N肽)，于70℃温育30分钟，然后迅速冷却至20℃测试可逆性。发现所有肽都是完全可逆的(图5)。同样地，在两个不同温度，15.5℃和62.5℃，分析L肽的浓度依赖性(图6和图7)。由肽浓度范围5-304.5μM内的波长扫描，将199nm和210nm处的椭圆率绘图。在低温下，发现它们不依赖肽浓度(图6)。在高温(图7)下，浓度低于100μM时，210nm左右的椭圆率有更显著的变化。
胶粒和非胶粒SDS的影响检验去污剂SDS对短肽(表1，B肽、E肽和G肽)和较长肽(表1，K肽、L肽、N肽和O肽)的影响。对于8肽和9肽，胶粒SDS(25mM)诱导两类肽在210nm处MRE的增加，而且对于8肽，在非胶粒SDS(2mM)中也观察到此现象(图8)。这是转变成II型β-转角的特征，在206-210nm显示正的峰，在较长聚合物中也观察到此现象(Urry等人，1986，见上文；Urry等人，1985，见上文；Woody，1995，见上文)。然而令人惊讶地，除K肽外，非胶粒SDS对较长的18-28肽(L肽、N肽和O肽)没有影响，正如在图9中就L肽图示的。对于SDS的两种浓度，K肽在206-240nm的椭圆率显示降低。这种相似的转变成222nm左右的局部最小值，也在胶粒SDS中对L肽、N肽和O肽观察到。200nm左右MRE的增加和206-212nm左右的缓慢增加，说明所有肽在SDS存在时都变得更有序。
三氟乙醇的影响对于8、9、18和28肽，II型β-转角的诱导在87-9296(v/v)TFE中比在SDS中更明显(图8和图9)。对于L肽，TFE的浓度在0-97％范围内变化，在40％ TFE中，198nm、206nm和213nm处MRE的变化速度显著变化，说明存在结构转变(图10)。还研究了温度和TFE浓度升高对L肽的影响(图11)。在6.8℃和58.6℃之间，II型β-转角的比例在高TFE浓度时降低，或在低TFE浓度时不变。在低TFE浓度时，200nm处的椭圆率在高温下升高，说明转变成更有序结构。
肽的电脑模型构建了基于φ和
扭转角(取自较长弹性蛋白肽的MD模拟)的较短肽的模型。它们显示在较高温度下由无规线团/Z-结构向β-螺旋的转变，不仅由沿着螺旋轴的收缩显示，而且还有单体内横跨轴的膨胀，得到具有比28残基肽更大直径和更小长度的螺旋。实施例2用实施例1中描述的肽和方法学进行进一步的实验。结果CD分析图12a显示了D肽9肽在不同温度的CD光谱。为了比较，图12b显示了L肽18肽的光谱。所有的其它短肽和较长肽显示相似的CD曲线(此处没有显示数据)。
对于所有的肽，在195-205nm处的CD振幅随温度升高而降低，在206-212nm处的振幅降低较小。在这后一区域中的正峰是II型β-转角的特征(Perczel等人，1993，见上文；Urry等人，1985，见上文；Woody，1995，见上文)。在报道的转变中，发现短肽在218nm左右有近似的同二色性点。这在诱导II型β-转角的TFE浓度增加的影响(此处没有显示数据)和图12a和b描述的温度的影响中也观察到。Urry及其同事在220nm左右检测到较大的弹性蛋白聚合物熔解的近同二色性点(1988a，蛋白质化学杂志(J.Protein Chem.)，7(1)，1-34)。然而，当温度变化时，一些肽的最小值/最大值位置变化很小，而且其中光谱的变化不如强度的变化大。
图13a-c显示了短的D肽、E肽和H肽在磷酸盐缓冲液中，C肽、D肽和G肽在不同缓冲液中以及较长的J肽、L肽和N肽在pH7的转变曲线。最初为每条熔解曲线拟合了转变的起点，虽然对大多数肽都得到明确确定的转变。
热力学分析如实施例1所述测试可逆性。
发现所有肽都是完全可逆的(图14a)。还对L肽(18肽)和最疏水的短E肽(8肽)于两个不同温度下测试浓度依赖性(图14b、c)。在所有情况中，发现在此温度范围内椭圆率不依赖于肽的浓度(在实验误差限度内)。这个发现表明，温度诱导β-转角的形成是由于分子内相互作用而非分子间联系。此处报道的熔解曲线是在肽浓度比显示于图14c的最大浓度低10-20倍(较长肽为18μM左右，较短肽为50μM以下)时得到的。
将数据拟合范特霍夫图，它们是线性的。当CD测量中的低信噪比导致数据更分散时，通过固定转变的一个终点或两个都固定得到更好的拟合(图15)。使用自由[θ]F和[θ]U的结果是ΔH＝13.7±6.6、ΔS＝0.045±0.021；然而当用固定的[θ]F模拟时，得到下面的结果ΔH＝10.4±1.4、ΔS＝0.034±0.004。
将CD数据拟合范特霍夫方程，能够计算大部分肽转变的ΔH、ΔS和Tm值。然而，由于一些短肽(图13b)转变起点的不确定性，因此只报道了那些具有明确转变曲线的肽(表16)。
N和C末端状态相同的短肽的熔解温度相关性很好(表7和图16)。8和9肽α-氨基的乙酰化或α-羧基的酰胺化(或者二者兼有)与游离N和/或C末端相比，使转变温度降低了平均13℃。然而，对于末端电荷信号不同的肽，熔解温度没有显著差异(表7，对于8肽，pH4时A肽和B肽与pH9.5时B肽和F肽比较；对于9肽，pH4时C肽和D肽与pH9.5时D肽和H肽比较)，说明任何一种电荷的存在对于短肽的结构转变具有相似的影响。pH7.0时肽的熔解温度相对于那些有“高Tm”值的肽降低(图16)，而且对9肽的影响比对8肽更大。这说明可能存在通过N-C末端相互作用的加成性稳定作用——这或许能够解释为什么一些较小的8肽相对于较大的18肽其熔解温度较低。较小肽N末端额外甘氨酸的存在将“低Tm”和“高Tm”肽的熔解温度都提高了大约6℃(图16)。在C末端附近加入一个或多个疏水残基，发现有相反的影响，导致熔解温度降低20-23℃(将L肽与M肽和N肽比较，表6)。
SDS和TFE的影响图17显示了SDS和TFE影响的结果(如实施例1所述进行)。关于实施例1和2的结果的讨论对于所有研究的肽，观察到在195-205nm和206-212nm处的MRE随温度升高而升高(II型β-转角形成的信号)，这支持这些序列的折叠是由疏水折拢驱动的观点。此处研究的类弹性蛋白肽形成的精确结构依赖于侧翼序列和溶剂条件。在低温下(0℃)，短肽显示有部分结构的迹象，正如在较大聚合物中所看到的(Urry等人，1986，见上文；Urry等人，1985，见上文)。此外，大部分肽显示在210nm处的MRE略微升高，这是VPGVG聚合物内II型β-转角形成的特征(Urry等人，1985)。
对于K肽，在210-230nm处的CD-振幅有明显增加，说明I型或III型β-转角的形成。这种现象也在这种肽在胶粒和非胶粒SDS中观察到。在其它肽于高温下的CD-光谱中发现第I/III型β-转角的一些迹象。这说明，对于许多这些序列可能存在不同β-转角群的平衡，虽然具有GGVG的N末端区域的肽被认为优先采取II型β-转角(Broch等人，1996，国际肽和蛋白质研究杂志，47，p394-404)。I型和II型β-转角之间的互变被认为需要+0.2--1.7kcal/mol能量(Yang等人，1996，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，259，p873-882，及其参考文献)，这一障碍比较小，能够通过侧翼序列或缓冲液组成(TFE、SDS等等)影响。或者，较短肽中Val-Pro键异构化成顺式构象将有助于形成I型或III型β-转角，正如在水中研究VPGVG的环状类似物时发现的(Khaled等人，1981，国际肽和蛋白质研究杂志，17，p23-33；Renugopalakrishnan等人，1978，J.Chem.Soc.Perkin Trans.，2，p111-119)。然而，无论是否形成I、II或III型β-转角，弹性转变仍然是可能的(Bhandary等人，1990，国际肽和蛋白质研究杂志，36，p122-127)。
以前对线性五肽Boc-VPGVG-Ome的晶体学研究(Ayato等人，1980，在“肽化学”(Peptide Chemistry)中，主编K.Okawa，p107-112)显示不存在任何β-转角结构，而VPGVG环状十肽类似物的结构显示有一个VPGVG单位的III型转角及另一个单位的I型转角(Bhandary等人，1990，见上文)。
为了确定移植到其它蛋白质中的弹性蛋白序列的转变温度，考虑侧翼区域是重要的。Urry及其助手划分的疏水等级(1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)只估计聚合物序列中的残基的Tm。我们在此处已经清楚地证明，当合适的侧翼序列存在时，VPGVG单体能够形成与类弹性蛋白聚合物(VPGVG)n相同的II型β-转角结构(在CD的识别能力内)。我们还已经证实，当特定类型的侧翼残基存在时，转变温度可以按与聚合物中看到的相同方式改变(Urry，1993，见上文)。例如，在邻近VPGVG转角序列处加入额外的疏水残基能使熔解温度降低多达20℃，而加入甘氨酸使TM升高6℃。这似乎值得注意，这些巨大的温度影响可以通过加入单个残基产生(比较8肽和9肽(图16)以及L肽和M肽，表6)，虽然当进行多个添加时，影响不是必然的累加(比较M肽和N肽，表6)。此外，当这些额外疏水残基存在时，插入带电荷残基并没有观察到预期的熔解温度升高(比较I肽和J肽，表6)。这说明侧翼连接不同的非弹性残基的弹性序列，其Tm可能通过将侧翼区域的疏水和亲水残基的平衡平均化得到。由较短肽图解了电荷的影响。对于所有肽，N和C末端的电荷将疏水折叠的转变温度提高了差不多20℃(比较pH4和pH9.5时的C肽和H肽，表7)。末端带电荷基团的热力学影响很可能是因肽周围水壳层的稳定性增加引起的。
相反地，与pH4和pH9.5相比较，在pH7.0的磷酸盐缓冲液中具有带电荷末端的肽的Tm降低了。在pH7，两个末端都将带上电荷，在N和C末端之间可能形成的盐桥可能稳定了β-转角并降低了转变的Tm。对于酰胺化和乙酰化的不同长度VPGVG肽(E肽和L肽)，其转变温度对那些长许多的VPGVG聚合物观察到的不同(Luan等人，1990，生物聚合物，29，p1699-1706；Urry等人，1985，见上文)。令人奇怪地，正如在表5中也可看到，在两个温度，0℃(未折叠状态)和60℃(折叠状态)之间，五聚体序列自由能的差异为大约-2.0kcal/mol(ΔG＝5×2.0+(5×0.0066)T)。这与35个残基的分子动力学模拟发现的每一五聚体的转变能量大致相同(Chang和Urry，1988，见上文)。此处重要的结论是，结构转变似乎不依赖肽长度，而且在某种程度上对侧翼区域不敏感，使这些肽可用于蛋白质工程目的。
SDS对弹性蛋白短序列的影响支持了疏水相互作用是较高温度下弹性蛋白结构稳定化的驱动力的假设。在本研究中，低浓度SDS(不超过25mM)诱导β-转角的形成(图17a)。一种可能的机制是SDS可能将跨越PG-转角每一侧(顺式面)的两个缬氨酸连接起来。然后它可能破坏这些缬氨酸周围的水化壳层，从而促进更密切的Val-Val相互作用并诱导II型β-转角。事实上，建立在弹性蛋白肽MD模拟基础上的模型(Wasserman和Salemme，1990，见上文)暗示，在高温形式中两个缬氨酸之间的距离比在低温形式中大约短2。SDS对较长肽(多于一个VPGVG单体)的影响与缬氨酸在其中更受屏蔽的假说是一致的。较短肽与较长弹性蛋白聚合物相比相对较高的ΔH和ΔS(表5)支持这种机制。由于ΔH和ΔS依赖于疏水部分周围网格状水分子的量，因此较大的ΔH和ΔS暗示在这些肽中有较大百分比的疏水表面是溶剂可接触到的。
TFE浓度升高对L肽的影响，说明椭圆率的改变反映了或平衡了肽的内部疏水性。TFE最强的影响在其中疏水相互作用占优势的低于40％ TFE时观察到(Bodkin和Goodfellow，1996，生物聚合物，39，p43-50)。在VPGVG单体的收缩形式/II型β-转角形式中缬氨酸基团之间的较短距离暗示这些疏水残基通过表面积最小化而受到部分水屏蔽，可能是弹性蛋白中由TFE诱导II型β-转角的驱动力。Bodkin和Goodfellow(1996，见上文)已经将其作为TFE诱导二级结构折叠的普遍模型进行了论述。既然总自由能对于TFE/水混合物比单独水要低，则优选的形式将是TFE混合物中Val基团比较靠近的形式。TFE超过40％时，II型β-转角结构形成较慢，反映出静电相互作用占优势。然而，Cammers-Goodwin等人最近的工作(1996，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，118，p3082-3090)提出，通过取代周围的水分子和提高顺式/反式互变速率，TFE还可以使其中酰胺基团暴露于溶剂的线团状态去稳定，这被认为是使酰胺-酰胺氢键最大化，导致二级结构的形成增加以降低自由能。在我们的研究中，在高浓度TFE时温度对II型β-转角稳定性的影响，以及在低浓度时温度对更无序结构的影响是不同的。在较高温度下，本研究中聚合物(VPGVG)n和L肽在206nm处的MRE都降低。可能有几个因子影响这种高浓度TFE下温度诱导的转变。II型β-转角可能发生熔解或者可能转变成其它转角。这可以是不同类型转角的温度依赖性平衡常数、顺式-反式转变速率增加、由于主链静电力更占优势而疏水Val-Val相互作用去稳定、或由于II型β-转角206nm左右CD振幅的TFE依赖性减小的结果。然而，在低浓度TFE中，200nm左右CD振幅的减小可能反映了TFE和温度对破坏肽中Val基团周围的水化壳层并增强Val-Val相互作用的加成影响。
本研究由此例证，类弹性蛋白短肽可以发生与天然和经修饰的聚合物中观察到的相同的结构转变。在弹性蛋白聚合物(VPGVG)n中，相同的五聚体序列都参与形成有II型β-转角的β螺旋(Pro2-Gly3，具有Val1C＝O…H-N Val4氢键)。分子内疏水性接触被认为可驱动该螺旋内的转变(Urry，1988a，见上文)。然而，唯一的稳定化氢键位于每个单体(VPGVG)内。虽然如此，但螺旋的形成未必是疏水折拢驱动及五聚体内氢键稳定而产生的合作转变。我们没有发现这种合作影响的证据。8肽(1个VPGVG单位)和18肽(3个VPGVG单位)的ΔH和ΔS值是相同的，说明“合作单位”没有超越一个重复单位。
从8肽到18肽的构型熵对总熵的贡献显示为最小——单个VPGVG肽的构象熵(在松弛(764)和伸展(58)构象的几种状态之间的差异，ΔSconf)已经计算为每个残基1.024cal·mol-1·K-1(每个残基一个熵单位)。假定熵得自没有随机链网的内在链动力学，那么在8肽和18肽之间升高的构象熵改变将正好是0.010kcal·mol-1·K-1(Urry，1988a，见上文)。这显示了当链长增加时，转变中的ΔS(表6)不能被这些ΔSconf的略微增加平衡。
这使得有可能将这些序列加工成球蛋白。8肽(E肽)从0℃到60℃的转变涉及的自由能为-3.2kcal/mol(表5；ΔG＝8×2.0-T(8×0.0066))。这一能量应该足以改变球蛋白结构和功能的构象。另一方面，为了具有更强和更剧烈的力量，增加单体(VPGVG)的数目可能比较理想。例如，连续串联作为接头肽的3-5个单体，可以使用单个大的可塑变形的能量以移动蛋白质的不同结构域或亚基。同样，这些序列可以用来取代表面转角而诱导局部结构转变，或者通过插入到酶或结合蛋白中从而提供调节蛋白的热稳定性或热不稳定性的新方法。表1具有受保护或未受保护末端的弹性蛋白短肽和具有不同组成的较长肽的序列肽之间的差异用粗体表示，其中Ac-乙酰基，NH2-酰胺。
AH-GVG(VPGVG)-NH2E Ac-GVG(VPGVG)-NH2BH-GVG(VPGVG)-OH F Ac-GVG(VPGVG)-OHCH-GGVG(VPGVG)-NH2G Ac-GGVG(VPGVG)-NH2DH-GGVG(VPGVG)-OH H Ac-GGVG(VPGVG)-OHIAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)ILG-NH2JAc-GKL(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)ILG-NH2KAc-GKL(VPGVG)(VPGEG)(VPGVG)ILG-NH2LAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)-NH2MAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)L-NH2NAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)IL-NH2OAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)-NH2表2弹性蛋白短肽的特征肽 MH+ 氨基酸分析[aa，测定值(预期值)][测定值(预期值)]A639.4(640.1)P，0.94(1)；G，4.04(4)；V，2.44(3)B641.4(640.4)P，1.05(1)；G，4.22(4)；V，2.52(3)C696.4(697.2)P，0.92(1)；G，5.31(5)；V，2.67(3)D698.4(697.4)P，0.90(1)；G，5.15(5)；V，2.54(3)E682.4(682.1)P，0.95(1)；G，4.29(4)；V，2.63(3)F683.4(683.4)P，0.88(1)；G，4.36(4)；V，2.65(3)G738.4(739.2)P，1.01(1)；G，5.20(5)；V，2.66(3)H739.4(740.2)P，0.95(1)；G，5.06(5)；V，2.53(3)I1784.2(1785.2) P，3.74(3)；G，8.24(9)；V，5.68(7)；I，1.13(1)；L，1.27(1)J1869.3(1870.3) P，3.52(3)；G，7.39(8)；V，4.84(6)；I，1.02(1)；L，2.24(2)；K，1.21(1)K1900.5(1900.3) P，3.25(3)；G，7.98(8)；V，4.32(5)；I，0.88(1)；L，1.97(2)；K，1.09(1)；E，1.17(1)L1500.7(1501.8) P，3.80(3)；G，7.65(8)；V，5.66(7)M1614.0(1614.9) P，3.43(3)；G，6.96(8)；V，5.06(7)；L，1.24(1)N1728.6(1728.1) P，3.53(3)；G，7.80(8)；V，5.87(7)；I，1.03(1)；L，1.19(1)O2320.8(2320.8) P，5.82(5)；G，12.22(12)；V，9.13(11)表3弹性蛋白肽8和9肽热转变的热力学数值aTm(℃)ΔHU→F(kcal mol-1)ΔSU→F(kcal mol-1K-1)肽pH4.0 pH7.0 pH9.5pH4.0pH7.0pH9.5 pH4.0 pH7.0 pH9.5A 44403111.2±4.214.0±3.622.8±6.30.035±0.0130.045±0.0110.075±0.021B 43394113.7±3.616.3±3.813.2±4.50.043±0.0120.052±0.0120.042±0.014C 44413117.1±6.314.7±3.212.6±3.40.054±0.0070.047±0.0100.042±0.011D 38363816.3±3.913.9±1.515.9±2.10.052±0.0120.045±0.0050.051±0.007E 31323315.7±2.815.6±3.116.8±5.10.052±0.0090.051±0.0100.055±0.017F 33374016.8±3.313.4±4.310.2±2.40.055±0.0110.043±0.0140.033±0.008G 32313317.3±4.715.7±3.120.8±5.80.057±0.0150.052±0.0100.068±0.019H 30394415.8±6.916.3±2.417.0±3.10.052±0.0230.052±0.0080.054±0.010a对在每个pH在一个波长测定每种肽的MRE，并对温度作图。取决于缓冲液、pH和肽的种类，这个范围为197-202nm。数值通过将数据拟合范特霍夫方程(ΔCp＝0，允许ΔH和ΔS浮动)得到。Tm由ΔH/ΔS得到。表4弹性蛋白18-21肽在pH7.0热转变的热力学数值a肽Tm(℃)ΔHU→FΔSU→F(kcal mol-1)(kcal mol-1K-1)I 16 19.5±25.9 0.068±0.088J 18 25.2±5.20.083±0.018L 35 --M 14 16.0±13 0.055±0.043N 18 --a数据分析如表3所述进行，不同之处在于数值是通过将数据拟合范特霍夫方程(其中ΔCp＝0)，指定基线的斜率和离轴偏移，并且允许ΔH和ΔS浮动而得到。表5弹性蛋白肽的ΔH和ΔS与其它工作的比较肽每个残基的ΔH 每个残基的ΔS(kcal mol-1) (cal mol-1K-1)8肽缓冲液平均值(E)2.0 6.69肽缓冲液平均值(G)2.0 6.621肽平均值(I+J) 1.1 3.650聚丙氨酸肽a1.3 -(-VPGVG-)n，n＞120b0.240.8a(Schohtz等人，1991，美国国家科学院进展，88，p2854-2858)，由差示扫描量热测定(differential scanning calorimetry，DSC)的数据，测定α-螺旋伸展成线团的变化(范特霍夫估计)；b(Luan等人，1990，见上文)由DSC测量。表6弹性蛋白肽热转变的热力学数值a肽 pH TM(℃)ΔHU-FΔSU-F(kcal mol-1)(kcal mol-1K-1)A7.041 11.0±2.70.035±0.009B9.535 14.9±4.90.048±0.016C4.045 20.0±2.90.063±0.009D9.540 13.0±4.80.042±0.016G9.535 13.7±2.80.047±0.009H9.547 14.4±2.30.045±0.007I7.020 26.0±10.6 0.089±0.036J7.018 25.3±2.50.087±0.009L7.037 18.9±4.70.061±0.015M7.014 15.9±10.7 0.055±0.036N7.017 12.1±2.40.042±0.008a选择处于各自特异pH值的A-H肽(8和9肽)，因为这些熔解曲线具有比较明确的转变(图13a)。对较长的18-21肽(I-N)进行拟合(终点、ΔHU→F和ΔSU→F可变动，只指定转变前和转变后曲线的斜率)。表7弹性蛋白短肽转变的熔解温度a肽pH4.0 pH7.0 pH9.5A 35 41 30B 40 34 35C 45 37 24D 39 27 40E 22 21 20F 23 34 39G 33 26 35H 26 36 47a对每个pH在一个波长测定每种肽的MRE，并对温度作图。根据缓冲液、pH和肽的种类，这个范围为197-202nm。通过将数据拟合范特霍夫方程(ΔCp＝0，最初允许转变的ΔH、ΔS和终点浮动)得到数值。Tm由ΔH/ΔS关系式得到。实施例3将弹性序列加工到蛋白A微结构域的一级结构中来自金黄色葡萄球菌的蛋白A能结合哺乳动物IgG的Fc部分。这种3螺旋束蛋白质发现存在于细菌的细胞表面，含有串联的同源结合结构域，每个大约有60个残基，命名为E、D、A、B和C(Lofdahl等人，1983，美国国家科学院进展，80，p697-701；Uhlen等人，1984，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，259，p1695-1702)。其X射线和NMR(Gouda等人，1992，生物化学(Biochemistry)，31(40)，p9665-9672)结构都能得到，而且已经构建了一个合成的蛋白A结构域——Z结构域，以进行高水平的蛋白质表达。最近，Z结构域被进一步最小化至33个残基，并保留了它与IgG的Fc部分的大部分亲和力(Braisted和Wells，1996，见上文)。该结构只由通过一个I型β-转角连接在一起的两个α-螺旋组成。
用固相肽化学法合成含有不同转角区域(即其中的野生型序列被弹性肽取代)的突变蛋白A序列的肽(表8，其中粗体表示的氨基酸是被取代以引入弹性肽的氨基酸)，并如实施例1所述用圆二色性法进行分析。仪器用溶于二噁烷的异雄甾酮在304nm校准，使用1.0cm石英比色杯应该得到强度142.5ΔA。通过同时在260nm校正离轴偏移，跟踪222nm处肽的熔解转变。记录222nm和260nm的3个实验值(每个有5-10秒钟的整合时间)的平均值。迅速冷却至24℃，在190-260nm扫描，测试转变的可逆性。测试了不同的溶剂，在不同温度下测试不同浓度三氟乙醇对结构的影响。由显示可逆两相模拟模型得到肽熔解的自由能，使用Grafit软件拟合数据(详见实施例1)。
表面等离子体振子共振光谱通过表面等离子体振子共振光谱，使用BIAcoreXTM(Biosensor，瑞典)监控肽(分析物)与固定化Fc(配基)相互作用的动力学。在低于或高于室温10℃进行测量前，将BIAcoreX冷却或加热至平衡(根据生产商的介绍)。在10mM pH4.5乙酸钠缓冲液中，使用胺偶联试剂盒，用购自生产商的N-乙基-N’-[(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将IgG2a小鼠单克隆抗体561(αCD34)(Dynal A/S(挪威)惠赠)的纯化FC固定在研究级CM-5羧甲基化传感器芯片上。Fc-561的固定化在10℃使用35μL含100μg Fc-561/mL的溶液(流速5μL/min)进行，表面未反应基团用pH8.5的1M乙醇胺封闭。表面用pH2.4的10mM甘氨酸-HCl缓冲液再生后，固定了大约1000RU的Fc-561。在相似条件下将人血清白蛋白(HAS，30μL 50μg HSA/mL，NovoNordisk，丹麦)固定化作为对照蛋白质。
用Hepes缓冲盐溶液(pH7.4的10mM Hepes，150mM NaCl，3.4mM EDTA和0.005％P20)流速30μL/min进行分析。每种肽(分析物)注入4-10×100μL。同时减去芯片HSA部分的RU(由于体积影响)，以校正分析物与Fc-561的结合。在每次注射前，使用5μL pH2.4的10mM甘氨酸-HCl缓冲液将表面再生。通过将分析物在含0.005％P20的HBS中稀释得到几个低浓度，分析得到结合常数的数据，解离常数由分析物重新结合最少化的最高浓度测定。在最初200秒测定结合的结合速率，并且同样地在另外200-300秒记录流动缓冲液中的解离相(解离速率)。
BIAcoreX数据的评价芯片上金膜表面附近折射指数的变化与RU的变化有关，由此使监控分析物结合和解离的变化成为可能。每种传感器记录图代表实时记录的折射指数随时间的变化。结合速率和解离速率常数，分别用kon和koff表示，它们通过使用BIAevaluation2.1软件(Pharmacia Biosensor)评价传感器记录图的数据来拟合。通过二次幂的非线性拟合，由方程(5)得到只是两个独立的单组分事件加和的双组分结合相。
R＝RA(1-exp(-ksAt))+RB(1-exp(-ksBt)) (5)其中R代表在时刻t的应答，而RA和RB是两个事件的稳态应答水平。为了测定结合速率，将拟合的ksA和ksB值对分析物浓度C作图。
通过使用关系式ksA＝konAC+koffA和ksB＝konBC+koffB由ksA或ksB对C的线性拟合的斜率得到平行结合的kon速率。如下测定双组分相互作用的解离常数，或解离速率，R＝RDexp(-koffAt)+REexp(-koffBt) (6)这里有RD和RE，即每个事件在解离起始时对总应答的贡献。然而，只有拟合的koffA和koffB通过指定解离的起始(t＝t0)被进一步使用。不同结合和解离速率的测定使计算解离常数KD成为可能KD＝koff/kon。同样地，得到一定温度范围内不同肽和野生型1号肽之间结合自由能的相对差异ΔΔG，表示如下ΔΔG＝+RTXln(X肽在TX的KD/野生型1号肽在TX的KD) (7)R代表摩尔气体常数，Tx代表计算KD(基于快速结合和解离速率)和ΔΔG的温度(用绝对温度表示)。结果对经结构最小化的基于蛋白A的IgG-结合肽(Braisted和Wells，1996，见上文)进行修饰(表8，1号肽，对照)。它具有使用肽合成法可以容易制成的序列，而且它与IgG结合的结合速率较好。用弹性蛋白序列GVPGVG取代此肽中的I型β-转角HDPNLN。我们省略了转角N末端起始的GV部分，因为它侧接有相似的小且疏水的残基AL(ALHDPNLN)。为了避免影响弹性蛋白序列在较高温度下的折叠，转角C末端的EE残基(HDPNLNEE)用QQ取代(表8，2号肽(1号突变体)和4号肽(2号突变体)。由此用Syntem(Nmes，法国)合成肽，由反相HPLC纯化至95-98％纯。由质谱验证分子量，并由氨基酸分析验证组成(数据没有显示)。
由圆二色性法对肽进行结构鉴定在磷酸盐缓冲液中于低温下对肽进行远紫外圆二色性扫描，以研究转角区域内突变的影响(图18)。只有野生型肽(1号肽，表8)具有可检测的特征性α-螺旋的CD-光谱，最小值在208和222nm左右，而最大值在190nm左右。然而，其相对低的CD-振幅(MRE在-10,000deg·cm2·dmol-1左右)说明光谱只显示部分折叠α-螺旋结构(Luo和Baldwin，1997，生物化学，36，p8413-8421及其参考文献)。更令人惊讶的是，观察到具有弹性蛋白β-转角的突变体在低温下不成形。然而，具有受保护C末端的3号肽(3号突变体)比其它突变体有更大比例的螺旋性(在222nm处测量)。
TFE对α-螺旋有稳定化作用，因此测试1-4号肽。图19a-c还证实了TFE可稳定或诱导这些肽中的α-螺旋结构，正如2号肽所示(图19b)。通过升高TFE在磷酸盐缓冲液中的浓度，发生2号肽由无规线团变成α-螺旋光谱的CD-转变，同二色性点在204nm左右。3号和4号肽可以得到相似的光谱。这说明所有突变肽均具有折叠α-螺旋的倾向，尽管它们在磷酸盐缓冲液中很大程度上是无序的。
野生型肽在磷酸盐缓冲液中的CD-光谱只具有部分折叠的α-螺旋结构，正如通过升高TFE的浓度后扫描肽发现的(图19a和c)。在大约20％(v/v)TFE中，转变似乎是完全的，而且同样地对2-4号肽，TFE的主要诱导影响一直到30％都可观察到。然而，对于1号肽，升高TFE的浓度超过20％后其在222nm的CD-信号减弱。这些拐点在20％TFE左右的CD-曲线的S形特征曲线，暗示这种转变涉及协同相互作用。
当TFE的浓度高达50％时，螺旋度最高的是1号肽(野生型)＞3号肽＝4号肽＞2号肽。对于1号和2号肽，胶粒SDS(25mM)也诱导类似α-螺旋的CD-光谱(数据没有显示)。然而，这些光谱的208/222比率比在TFE-诱导的α-螺旋光谱中观察到的大很多(图19a、b)，这是不完全α-螺旋诱导或向310-螺旋结构的转变的典型特征(Hungerford等人，1996，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35，p326-329)。图20a-c显示了在较高温度下1-4号肽在TFE中诱导结构的稳定性。
图20a显示了1号肽在30％TFE中的熔解和可逆性测试。对于1号和2号肽，熔解曲线大约95-100％可逆，而对于3号和4号肽，曲线在冷却后大约95％可逆。在204nm处的同二色性点还说明，1号肽在TFE中α-螺旋的熔解遵循两相可逆转变方式。图20b显示了1号肽中α-螺旋在不同溶剂中的熔解。TFE对二级结构存在显著的热稳定效果，而且通过增加磷酸盐缓冲液中TFE的浓度，在熔解曲线TM处的斜率作为温度的函数降低(协同作用降低)。1号肽在胶粒SDS中的熔解具有最平的斜率，截断1号肽在磷酸盐缓冲液中的熔解曲线。注意SDS对1号肽α-螺旋结构在较低温度下有去稳定效果，在较高温度下有稳定作用。
为了定量研究IgG结合肽转角区域内突变的影响，在所有肽中通过使用30和60％TFE诱导α-螺旋结构。肽在60％TFE中的熔解(图20c)揭示了不同肽在α-螺旋稳定性方面的差异。
通过将数据拟合可逆范特霍夫两相转变，进行熔解曲线的进一步研究。拟合是建立在30％或60％TFE中1号肽的拟合终点并将TFE中的其它熔解曲线的终点固定为这些值这一基础之上的。表9显示了不同肽的热力学数据。不同肽的TM之间最大的差异在于30％TFE中。与野生型1号肽比较，3号和4号肽的TM降低了33-35℃，而2号肽足足降低了48℃。这些结果证实2号肽是最不稳定的肽，而野生型1号肽是最耐热的肽。
由表面等离子体振子共振评价肽使用BIAcoreXTM(BIAcore，瑞典)研究合成肽与小鼠单克隆IgG2a抗体561的固定化Fc的结合动力学。图21a、b显示了1号肽在20℃结合相的数据的拟合。1号肽对双组分模型拟合更好。对其它肽在所有温度下也发现有这种现象。然而，在10℃下1号肽也可以很好地拟合单组分模型。作为覆盖测试结合和解离相的温度范围的最适当模型，选择两组分模型。
图22a和b显示了对1号和2号肽记录的典型传感器记录图。传感器记录图揭示了与相对快速的结合速率和解离速率有关的结合。由ksA或ksB对所用最低浓度的线性拟合的斜率测量结合速率(图22a、b插图)。快速结合速率的二次拟合的线性相关系数(r)为0.98左右。虽然异类动力学的拟合更适合肽在所有温度下的情况，但是只有快速结合速率可以由统计方法测定。慢速结合速率大小低大约50倍而且可变性大很多(高达100％，数据没有显示)。然而，在较低温度下统计测定快速和慢速解离速率，表10列出了1-4号肽在10℃的慢速解离速率。
使用慢速解离速率，由单或双组分模型拟合得到的1号肽的动力学常数，与以前报道的非常相似(Starovasnik等人，1997，美国国家科学院进展，94，p10080-10085)。图23a-c显示了1号和2号肽的快速结合速率和解离速率以及解离常数的温度相关性。1号和2号肽的快速解离速率在同一数量级。然而，虽然1号肽的结合速率比2号肽高100倍，但它们对温度的应答效果相反。当温度从10℃升高到30℃时，1号肽的结合速率减半，而2号肽却加倍。2号肽在较高温度下结合速率升高稳定了它的解离常数。令人惊讶地，虽然3号和4号肽具有更大的α-螺旋倾向，但它们与配基的结合比2号肽差很多。它们在10℃的快速结合速率分别为211±113和289±90s-1·M-1，而它们的快速解离速率为0.674s-1(3号肽)和0.563s-1(4号肽)。这大约是2号肽结合速率的一半，而解离速率与2号肽相比要高。没有测定它们在其它温度下的速率。
2号肽相对于野生型1号肽之间的结合自由能的差异(ΔΔG)是线性的，正如图24所示。在温度范围10-30℃内，ΔΔG是正数，说明1号肽与Fc-561的结合比2号肽要强。然而，在相同温度范围内，ΔΔG降低了0.057kcal·mol-1·K-1，或Δ(ΔΔG)降低了1.2kcal·mol-1。如果此关系在更广温度范围仍是线性的，这暗示在354K(81℃)以上2号肽将是比野生型1号肽更好的Fc-561结合剂，而且结合自由能将超过4kcal·mol-1。对于3号和4号肽，它们在10℃相对于1号肽的ΔΔG值分别为+4.8和+4.5kcal·mol-1(比2号肽的正ΔΔG值高15-20％)。结构最不稳定的2号肽是与3号和4号肽相比更好的配基结合剂，而且它的结合速率随温度而升高，使用CD进一步研究这些令人惊讶的结果。
用CD研究肽在缓冲液中的温度依赖性在222nm用CD研究在含0.005％P20的HBS缓冲液(BIAcore running缓冲液)中温度对1号、2号和4号肽的影响，对于1号肽，随着温度升高，其CD-振幅降低，正如前面对于1号肽在TFE或磷酸盐缓冲液中的熔解发现的那样(图20b)。对2号和4号肽在含P20的HBS中和在10mM磷酸盐缓冲液中的波长扫描(210-260nm)揭示，通过升高温度，在此区域有几乎相同的光谱。通过升高温度，它们的CD-振幅在210nm以下降低，在210-260nm升高，与1号肽相比影响相反(图25a-c)。
温度CD-光谱几乎是100％可逆的，正如图25a-c所示。也对2号肽在磷酸盐缓冲液中于15.5℃和48℃下光谱的浓度依赖性测试到620μM，它们在222nm没有任何显著的偏差(数据没有显示)。野生型肽(1号肽)也显示很容易溶解而且是以单体存在的(Starovasnik等人，1997，见上文)。通过升高温度，进一步测定了2-4号肽在10mM磷酸盐缓冲液和HBS中在222nm的MRE，图26a、b显示了它们各自的熔解曲线。S形特征曲线说明涉及协同效应，将数据拟合从未折叠到折叠构象的两相可逆转变。3号肽的熔解遵循异常的熔解曲线，MRE在222nm有升高和降低。因此，表11只列出了2号和4号肽的热力学数据。2号和4号肽在它们相应缓冲液中的范特霍夫图是线性的，相关系数平均为-0.98。注意4号肽具有比2号肽更长的折叠前区域和更大的TM。转变涉及的能量比肽在TFE中熔解涉及的能量更高(表9)。讨论通过增加转角区域内的疏水性，在弹性蛋白GVPGVG区域内诱导结构的概率应当随温度增加而增加。因此将野生型肽位点25-26的谷氨酸残基突变成谷氨酰胺。总共改变了下列残基将野生型I型β-转角用可能形成II型β-转角的残基取代，引入螺旋去稳定化的残基(Val、Gly)，而且将噬菌体展示选择的转角附近的Glu-Glu基团变成Gln-Gln。在N末端位点的谷氨酰胺对螺旋的稳定性具有消极的影响(Chakrabartty等人，1993，美国国家科学院进展，90，p11332-11336)。换句话说，由于将弹性蛋白序列引入到如此小的肽(选自噬菌体展示)中而破坏二级结构的风险是巨大的。
然而，以前已经显示了弹性蛋白转角区域的不确定性。有一些报道显示，除详细鉴定的II型β-转角之外，弹性蛋白序列还可能形成I型和III型转角(Arad和Goodman，1990，生物聚合物，29，p1651-1668；Bhandary等人，1990，见上文)。二级结构在较低温度下显然完全的熔解也是弹性蛋白肽或聚合物的特征之一(Urry，1988a，见上文；1988b，蛋白质化学杂志(J.Protein Chem.)，7，p81-114；1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。这种熵驱动的折叠暗示弹性蛋白的疏水基团被水化，因此在较低温度下对结构或稳定性没有贡献。
Urry把弹性蛋白的弹性描述成振动熵机制(1988a，见上文)。在弹性蛋白序列中的某些扭转角的偶联诱导序列中的大振幅摇摆运动。这暗示IgG-肽中插入的弹性蛋白序列由于内在链热力学应当具有巨大的熵，而且由于温度而引起的弹性蛋白转角中扭转角的偶联变化应当诱导整个序列中的结构变化。确实，IgG结合短肽中I型β-转角被更疏水的弹性蛋白转角取代，使野生型肽在磷酸盐缓冲液中的二级结构被完全熔解。然而，甚至野生型肽本身也是不稳定的，后来被末端的二硫桥稳定(Starovasnik等人，1997，见上文)。
为了将它们分类，我们需要用TFE诱导肽中的结构。通过使用较高浓度的TFE(＞30％(v/v))，凭借不同肽的更多的熔解数据，也有可能得到改进的熔解曲线。然而，会存在破坏野生型肽中一些已有螺旋性的风险，正如此肽浓度超过20-25％时看到的。在熔解曲线的协同效应和它们在不同浓度TFE中相应的ΔS和ΔH值之间存在联系。TFE浓度升高时的熔解曲线的协同效应和ΔH值降低了，Luo和Baldwin最近也发现了这一现象(1997，见上文)。这也符合更早的观察结果——熔解曲线在TM处的斜率与ΔH有关(Applequist，1963，化学及物理学杂志(J.Chem.Phys.)，38，p934-941)。这暗示1号肽在25mM SDS中(具有最平的斜率，图20b)应当也具有很小的ΔH值。因此，ΔH的降低不只是与肽结合的氢键合水分子的减少有关，可能也与溶剂的疏水性及其与肽的相互作用有关。
然而，除了Luo和Baldwin关于对ΔH的影响的研究(1997，见上文)，我们还显示ΔS以相似的方式随TFE浓度的增加而降低。这进一步支持他们的看法TFE通过加强它的分子内H键从而稳定α-螺旋。然而，没有看到由于肽氢键合水分子减少而增加熵，大概因为它们被更多的TFE和水分子取代，并且TFE-水混合物的能量进一步降低(Rico等人，1986，生物聚合物，25，p1031-1053)。
稳定TFE中的α-螺旋为显示突变体和野生型α-螺旋肽(其中突变体的螺旋性被完全破坏)之间分子内稳定性的差异提供了一条途径。含有最疏水转角的突变体(2号肽)显示了这一点，其在30％TFE中熔解α-螺旋的转变温度相对于野生型肽降低了48℃。含有弹性蛋白转角但是在转角附近含有Glu-Glu序列的其它肽(3号和4号肽)在TFE中更具螺旋性，而且它们的TM“只”降低了33-35℃。由具有酰胺化C末端的α-螺旋-3号肽的TM发现存在稳定螺旋的作用(表9)。在前面有关于α-螺旋也显示如此(Fairman等人，1989，蛋白质结构、功能和遗传(ProteinsStruct.Funct.Genet.)，5，p1-7)。
2-4号肽在磷酸盐缓冲液中或在含P20的HBS中的CD-振幅，在222nm区域内随温度而升高，这是α-螺旋或I型β-转角形成的特征(Perczel等人，1993，见上文；Woody，1995，见上文)。然而，缓冲液中熔解曲线在222nm处CD-信号的大小比转变成α-螺旋的预计低很多，而与I型β-转角的强度减小更相似(Woody，1995，见上文)。
这种转变的CD-信号受在较高温度采取无规线团构象的较大数目残基影响，因此通过升高温度并不转变成典型的α-螺旋光谱(Perczel等人，1993，见上文)。所有肽在TFE中的稳定性显示α-螺旋的含量应随着温度升高而降低，对1号肽在磷酸盐缓冲液中也观察到如此。然而，2-4号肽在磷酸盐缓冲液中并不如此，它们在磷酸盐缓冲液中在222nm处的CD振幅随温度而增加。熔解曲线中的协同效应比对α-螺旋熔解的观察结果更大。在TFE中具有比2号肽更大的α-螺旋倾向的4号肽，在222nm处的转变应当具有比2号肽更低的TM。然而，发现相反的结果。在两个不同温度下的浓度非依赖性和这种转变涉及的完全可逆性暗示这是分子内转变。因此，在222nm处对2-4号肽的影响可能是由于温度诱导的I型β-转角。
此转角结构也发现存在于弹性蛋白序列中(Arad和Goodman，1990，见上文；Bhandary等人，1990，见上文)，虽然-Pro-Gly-II型β-转角比I型β-转角更稳定0.2-1.7kcal mol-1，而且也是弹性蛋白中更常见的β-转角(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841；Yang等人，1996，见上文及此处参考文献)。I型β-转角是结构最小化肽中螺旋I和螺旋II之间改良的、噬菌体展示选择的转角(Starovasnik等人，1997，见上文)。这种类型的转角可能确保螺旋虽然发生了熔解，也是正确地排列而能结合的。也有来自自然界的结合诱导结构转变的报道(Daughdrill等人，1997，自然结构生物学(Nature Struc.Biol.)，4，p285-291；Uesugi等人，1997，科学(Science)，277，p1310-1313)。诱导螺旋排列的结构转变可能有助于稍后与配基结合时增加α-螺旋性。
通常将CD-光谱明显没有二级结构的肽假定为“无规线团”肽。然而，通过轻微摇动溶剂或通过结合诱导，被抑制的结构可能会展现出来(Waterhous和Johnson，1994，生物化学，33，2121-2128页)。因此无规线团并非“无规”，而是含有大量隐藏的二级结构，它们可能被或不被溶剂/结合诱导(Siligardi，1996，生物聚合物)。弹性蛋白肽或聚合物的电荷的影响和它们各自的转变温度之间也有清楚的相关性(参阅实施例1和2；Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)，在此工作中的结果符合这种看法。
具有最疏水转角区域的2号肽在磷酸盐缓冲液中222nm处温度诱导的转变的TM，与3号和4号肽相比最低。后一种肽在相当于2号肽转角区域附近(Gln-Gln)多两个负电荷Glu-Glu。根据在弹性蛋白序列中观察到的结果，带电荷多的肽将提高水合的概率，因此也提高疏水相互作用的TM。此转变涉及的能量(表11)也与在弹性蛋白短肽中的发现惊人的相似。对于那些弹性蛋白肽8-21肽，有关II型β-转角形成的相似转变的平均ΔH和ΔS，分别为16.8kcal mol-1和0.056kcal mol-1K-1(基于实施例1和2的结果)。同样，与以前对α-螺旋的熔解发现的结果(表10)相比，此处ΔH和ΔS的差异更大，说明涉及疏水相互作用的温度诱导转变成I型β-转角是加热时最可能形成的结构。
2号肽在含P20的HBS中由0-60℃的转变涉及自由能变化3.0kcalmol-1。这与形成β-转角所需的能量(2-4kcal mol-1)相同，但是低于α-螺旋起始所需的能量(4kcal mol-1)(Yang等人，1996，见上文及此处参考文献)。
通过先确定哪种动力学模型适合使用，由表面等离子体振子共振研究所有肽的活性。如果分析物或配基以多种构象存在，那么可能解释为什么对所有肽使用BIAevaluation2.1能较好拟合异类双组分结合动力学模型。在此研究中使用的配基是单克隆小鼠IgG2a(561)的纯化Fc，但是此研究中的2-4号肽都是在HBS中没有任何螺旋结构的，而且同样1号肽的螺旋性随温度降低。然而，可以在二级结构稳定性处于其局部最高水平的最低温度将1号肽拟合单组分模型。最近观察到46个残基的蛋白A片段(B-结构域)可能经过具有不同H键模式的两种不同螺旋构象发生折叠(Guo等人，1997，美国国家科学院进展，94，p10161-10166)，说明此研究中未折叠的蛋白A衍生33肽可能存在不同的中间构象。
通过升高温度，未折叠肽(1号肽，对照)的比例增加了，而且形成更大比例的不均匀群体。2号肽的结合速率升高符合pH7的10mM磷酸盐缓冲液或含P20的HBS中的CD-熔解曲线，显示二级结构随温度而增加(图23a、b)。1号肽随着温度升高而结合速率降低与二级结构降低之间具有联系。这说明结合速率遵循肽的二级结构。以前的报道已经显示了α-螺旋含量和结合强度之间存在很好相关性(Jansson等人，1997，生物化学，36，p4108-4117，及此处参考文献)。然而，两种肽的解离速率都相当相似(而且大)，随着温度升高都轻微增加。这说明两种肽存在相似的分子间解离力。这进一步说明1号和2号肽在结合后获得相似的结构，或者这种效果是因固定化配基的结构变化引起的。
温度诱导的结合和结构对转角附近Glu残基的电荷变化的反应相似(2号肽(-GVPGVGQQ-)与3号和4号肽(-GVPGVGEE-)相比)。虽然由于2号肽中QQ残基的螺旋去稳定作用而使得3号和4号肽形成α-螺旋的倾向比2号肽更大(比较2号、3号和4号肽在60％TFE中的熔解曲线，Chakrabartty等人，1993，见上文)，但它们与配基的结合并非更好。对于2号肽，转角区域中更疏水的基团相互作用，诱导TM比4号肽更低的结构(I型β-转角)，它可能影响分子内两个熔解的α-螺旋之间的接近度或涉及结合的残基的位置。温度诱导2号肽折叠与1号肽相比较都是由熵驱动的，这一观察结果说明了升高温度涉及的结合能量(2号肽相对于1号肽)和ΔΔG的负斜率。通过基因工程改造，可以产生具有足够大的负斜率ΔΔG/T的肽或蛋白质。
如本文描述的将可诱导型转换机制引入蛋白A，说明可以将野生型结构以这种方式进行改变从而导致最初的稳定性丧失。通过将弹性蛋白转换机制引入到在较高温度下可以折叠成稳定结构的结构中，其活性和稳定性可以再恢复。因此在螺旋之间使用弹性蛋白序列也是适当的。因此，通过用VPGVG螺旋中断序列将蛋白A的转角从I型β-转角变成弹性蛋白β-转角，我们首先熔解了α-螺旋，并将新的热诱导转换导回到I型β-转角。因此这可能为蛋白A以及其它螺旋蛋白提供了一种新的温度调控，其中在较低温度下降低结合速率而在较高温度下提高结合速率从而调节结合。表8具有插入的弹性蛋白序列的最小化蛋白A序列Noa1号肽 2号肽 3号肽*4号肽(蛋白A对照)(1号突变体)(2号突变体*) (3号突变体)A5 PHEPHE PHEPHEA6 ASNASN ASNASNA7 METMET METMETA8 GLNGLN GLNGLNA9 GLNGLN GLNGLNA10 GLNGLN GLNGLNA11 ARGARG ARGARGA12 ARGARG ARGARGA13 PHEPHE PHEPHEA14 TYRTYR TYRTYRA15 GLUGLU GLUGLUA16 ALAALA ALAALAA17 LEULEU LEULEUA18 HISGLY GLYGLYA19 ASPVAL VALVALA20 PROPRO PROPROA21 ASNGLY GLYGLYA22 LEUVAL VALVALA23 ASNGLY GLYGLYA24 GLUGLN GLUGLUA25 GLUGLN GLUGLUA26 GLNGLN GLNGLNA27 ARGARG ARGARGA28 ASNASN ASNASNA29 ALAALA ALAALAA30 LYSLYS LYSLYSA31 ILEILE ILEILEA32 LYSLYS LYSLYSA33 SERSER SERSERA34 ILEILE ILEILEA35 ARGARG ARGARGA36 ASPASP ASPASPA37 ASPASP ASPASP残基号 33 33 33 33*这种肽具有酰胺化的C末端，其它肽具有游离N和C末端。a在蛋白A序列中的氨基酸编号表9肽在三氟乙醇中熔解的热力学数值*TmΔH ΔS(℃) (kcal·mol-1) (kcal·mol-1·K-1)1号肽磷酸盐缓冲液13 13.1±0.4 0.046±0.00120％TFE 48 10.7±0.7 0.033±0.00230％TFE 48 11.9±0.4 0.037±0.00160％TFE 44 9.1±0.1 0.0286±0.00052号肽30％TFE 0 8.7±0.6 0.032±0.00260％TFE 9 6.8±0.2 0.0241±0.00063号肽30％TFE 18 6.4±0.2 0.0219±0.000760％TFE 23 6.2±0.1 0.0211±0.00054号肽30％TFE 8 9.7±1.0 0.035±0.00460％TFE 23 7.8±0.1 0.0263±0.0005a测定每种肽在222nm的平均残基椭圆率，并拟合可逆范特霍夫方程(ΔCp＝0，允许ΔH、ΔS和转变后终点浮动)。将转变前终点固定为就1号肽在相似溶液中的熔解最初拟合的值。表10由表面等离子体振子共振测量的在10℃下肽和小鼠单克隆IgG2a561(αCD34)的Fc相互作用的动力学参数akoff快速(s-1) Kd快速(μM-1) koff慢速(s-1Kd慢速(μM-1)1号肽 0.109±0.004 0.69±0.030.0322±0.0004 0.203±0.0041号肽b0.044 0.241号肽 0.041 0.1852号肽 0.39±0.08953±207 0.0349±0.004 86±113号肽 0.7±0.1 3194±17750.10±0.04 493±3254号肽 0.56±0.061948±638 0.0212±0.001 73±23a用含0.005％(v/v)表面活性剂P20的HBS流速30μl/min，并使用固定化HSA校正体积的影响，由分析物与配基(1000RU)的异类结合动力学的拟合测定快速和慢速解离速率(koff)。解离常数(KD)是建立在快速结合速率基础上的(图23b)。以±S.E表示误差，而且KD的误差由KD＝koff/kon的关系式依据kon和koff的S.E计算得到。
b将1号肽拟合10℃的单个均质1∶1结合，得到结合速率为1.87×10-5M-1·s-1，此数值还用于计算上面显示的KD值。
cStarovasnik等人(1997，见上文)给出的结合单克隆IgG1的参数，kon为2.2×10-5M-1·s-1。c中的实验温度没有给出。c中的拟合是建立在肽和配基之间1∶1相互作用基础上的。表112号肽和4号肽在缓冲液中222nm处的热转变热力学数据aTm ΔHΔS(℃) (kcal·mol-1) (kcal·mol-1·K-1)2号肽在磷酸盐26 19.0±1.6 0.063±0.005缓冲液中2号肽在含P20 31 15.4±1.9 0.051±0.006的HBS中4号肽在磷酸盐45 18.5±1.5 0.058±0.005缓冲液中4号肽在含P20 39 13.8±1.9 0.044±0.006的HBS中GVG(VPGVG)肽b18.2 0.062a将222nm处的熔解数据拟合可逆的范特霍夫方程(允许ΔH、ΔS和转变终点浮动)。热容量固定为0。
b数值是短肽GVG(VPGVG)n(n＝1和3)在pH7.0磷酸盐缓冲液中的平均值。实施例4用弹性接头基因工程改造抗-gp41 ScFv 3D6将ScFv 3D6(抗HIV-gp41，Engelhardt等人，1994，生物技术(BioTechniques)，17，p44-46，基因库编号U35316)的序列由质粒pDAP2(Kerschbaumer等人，1996，免疫技术(Immunotechnology)，2，p145-150)亚克隆到质粒pUC119His6mycXba(Griffiths等人，1994，EMBOJ.13，p3245-3260)中。在前一种质粒中(图27a)，scFv以碱性磷酸酶融合蛋白的形式表达，含有用于周质表达的pelB前导序列和用于金属亲和层析纯化的His6标签。后一种质粒(图27b)还含有c-myc标签，便于使用抗体9E10进行阳性鉴定/纯化(Hoogenboom等人，1991，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，19，p4133-4137)。两种质粒都由LacZ启动子调控并且携带氨苄青霉素抗性基因，3D6 mRNA和蛋白质通过使用1mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)合成。
使用含有SGGGGSGGRASGGGGS接头的3D6 scFv质粒(图28)作为起点，用如下基于弹性蛋白的接头加工scFv旧的scFv接头序列-SGGGGSGGRASGGGGS-新的scFv接头序列-X[VPGVG]nY-，其中n＝1-10，X、Y可以是相同的或不同的任何氨基酸残基，优选小的脂族氨基酸残基以保持接头的弹性。在这个实施例中，我们具体地设计了下列将要克隆到3D6 scFv中的接头。
(I) -S[GVG(VPGVG)VPG]S- 11聚体接头(II) -S[GVG(VPGVG)4VPG]S- 26聚体接头(III)-S[GVG(VPGVG)7VPG]S- 41聚体接头将第一个接头区(I)如图29a-c中所示进行克隆。图29a显示了pDAP2质粒中3D6基因的结构，而在图29b中使用限制性位点Hind III和Not I，已经将该基因亚克隆到pUC119His6mycXba中。如图29c和30所示，使用引物组合LMB3(B)与VHLINK(F)以及PHENCO(F)与VLLINK(B)进行进一步的PCR诱变。这一步引入了新的限制性位点(在图30中用*标记)。在图29c中图解了用于3D6基因克隆、筛选和测序的引物位置。图30b显示了3D6基因与新的接头构建物的装配。最初的11聚体接头(I)通过连续限制性酶切和与退火VPGVG-编码寡核苷酸退火得以扩展(图31和图32)。图31显示了26聚体接头区(II)的装配，通过将含有两个开口限制性位点(在图31中用**标记)的退火寡核苷酸连接到基因的接头区(I)(在图31中用粗体和下划线表示)而装配。在这个步骤中，引入了一个新的XmaI限制性位点并在图31中用(*)标记。图32显示了41聚体接头区(III)的装配，是通过将含有两个开口限制性位点(在图32中用**表示)的退火寡核苷酸连接到经限制酶消化的质粒中3D6基因的接头区(II)(在图32中用粗体和下划线表示)内而装配的。图33b显示了最终的41聚体接头区(III)的结构。将3D6基因亚克隆至pUC119His6mycXba中将冻干的pDAP2-3D6质粒溶于无菌的纯水中并热转化(于42℃1-2分钟)到CaCl2感受态TOPP2细胞中，并在含100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养板上筛选。使菌落在4ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB中于37℃和250rpm进一步生长过夜。取细菌培养物样品进行甘油保存(在含15％甘油的LB中于-70℃保存)，使用Hybaid RecoveryTM快速制备微量试剂盒(QuickPrep Mini Kit)(Hybaid，Middlesex，英国)或WizarTMPlus微量制备DNA纯化系统(Minipreps DNA Purification Systems)(Promega，Madison，WI)纯化pDAP2-3D6质粒。在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定质粒pDAP2-3D6和pUC119His6mycXba。pDAP2-3D6和pUC119His6mycXba质粒都分别使用10U Not I和20U Hind III(New England Biolabs，NEB)在含100μg/ml BSA的缓冲系统2(NEB)中于37℃进行16小时限制性酶切，然后于65℃20分钟热灭活。在1％(w/v)低熔点(LMP)琼脂糖(Gibco)上，于4℃使用pH8.0的Tris-乙酸-EDTA缓冲系统(TAE)分离3D6基因和开口的pUC119His6mycXba质粒，用长波(＞300nm)UV灯检测并从凝胶上切下来。使用MAGICTM-PCR制备物DNA纯化系统(PCR Preps DNA PurificationSystem)(Promega，Madison，WI)纯化3D6基因，使用Qiaquick GelExtraction Kit(Qiagen，Crawley，英国)纯化开口的质粒。在1％琼脂糖凝胶上分析产物，使用400U T4 DNA连接酶(NEB)在提供的T4连接酶缓冲液中于16℃，将3D6基因连接到开口的pUC119His6mycXba中过夜。进行只有开口载体的对照连接反应。将连接反应混合物(10μl)热转化到CaCl2感受态的TG1细胞中，并在2xTY琼脂培养板上于37℃温育过夜。用牙签挑取阳性转化体，并用PCR-筛选鉴定在20μl反应混合物中使用引物LMB3(B)和Phenenco(F)(图34)各10pmol、200μM各种核苷酸(Pharmacia或Bioline)、和含MgCl2和Taq-聚合酶的缓冲液(Bioline)。在热循环仪(MJ Research)上进行PCR-筛选，程序如下最初94℃ 5分钟，然后30个重复循环，顺序为94℃(30秒钟)、42℃(30秒钟)和72℃(1分钟)。程序最后为72℃5分钟并冷却至4℃。在1或1.5％琼脂糖凝胶上在Tris-硼酸-EDTA缓冲系统(TBE)中分析PCR产物，并让阳性菌落在4ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB过夜培养物中生长。制成甘油保存物，并分离质粒，用Hybaid RecoveryTM快速制备微量试剂盒(Hybaid，Middlesex，英国)纯化。将来自三个含有质粒pUC119His6mycXba的阳性菌落的3D6基因在两个方向上使用引物LMB3(B)和Phenenco(F)进行测序。使用自动荧光染色终止子测序方法(377 Perkin-Elmer测序仪)。在所有三个克隆中都检测到N末端的一个突变(氨基酸E变成D)和一些沉默突变。接头构建物(I)的克隆在二次反应混合物中使用高保真延伸聚合酶(Boehringer Mannheim)进行PCR扩增，插入第一个接头构建物(11聚体；编号I)(图29c和30)。每次含有正向和反向引物组合VHLINK(F)和LMB3(B)(覆盖scFv的VH-区并带有新的接头)，或VLLINK(B)和PHENECO(F)(覆盖scFv的VL-区并带有新的接头)(图29c)。将引物(每种15pmol)、200μM dNTP(Pharmacia)、1μl 1∶10稀释的模板(带有旧接头的3D6-pUC119His6mycXba)和提供的延伸缓冲液在热循环仪上温育，延伸程序为94℃(2分钟)；10个循环，顺序为94℃(15秒钟)、43℃(30秒钟)和72℃(45秒钟)；然后15个循环，顺序为94℃(15秒钟)、43℃(30秒钟)和72℃(最初45秒钟，然后每个循环延长20秒钟)。以72℃5分钟并冷却至4℃完成程序。将VH和VL的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶(TBE缓冲液)上分析，显示每种产物分别为一条清晰的条带，VH(正好超过500bp)和VL(正好低于500bp)。用MAGICTMPCR制备物DNA纯化系统(Promega，Madison，WI)纯化产物。VH的PCR产物应当具有新的接头(带有Kpn I、EcoN I和Xho I位点)。VL应当同样在新的接头上带有Kpn I、EcoN I和BamH I位点。在VH和VL的PCR产物中，覆盖Kpn I和EcoN I位点的序列是重叠的。使用相应的NEB酶及其说明书，用限制性酶切和T4连接酶检测位点Kpn I和EcoN I。在1.5％琼脂糖凝胶(TBE缓冲液)上分析连接产物，显示Kpn I在1000bp左右(3D6scFv)给出比EcoN I强许多的条带。因此两种PCR产物都用20U Kpn I根据NEB的说明书进行限制性酶切。用MAGICTMPCR制备物DNA纯化系统(Promega，Madison，WI)纯化产物，以除去小的消化产物(10-16bp)，并如上所述将VH和VL用T4连接酶于16℃进一步连接过夜。将连接混合物热灭活(65℃10分钟)，用MAGICTMPCR制备物DNA纯化系统纯化，并用40U Hind III和20U Not I如前述进行进一步限制性酶切。消化混合物于65℃(20分钟)热灭活后，于4℃进行LMP 1.5％琼脂糖凝胶电泳(TAE缓冲系统)。根据基因的MW切下相应的凝胶区域，并用β-琼脂糖酶I根据NEB的方法于40℃消化过夜。将DNA用异丙醇于-20℃沉淀2小时，干燥，重悬于20μl无菌纯水中，并在1.5％琼脂糖凝胶(TBE)上分析。在1000bp左右检测到三条带，可能来自VH-VH、VL-VL和VH-VL装配。然而，只有VH-VL可以成功地插入到开口的载体中。将分离的三条带用T4(NEB)连接到Hind III/Not I限制性酶切的载体pUC119His6mycXba中，并热转化(于42℃90秒钟)到感受态TG1细胞中。如上所述将菌落进行PCR筛选和分离。将由菌落分离得到的质粒进行新位点Xho I和Kph I的检测(使用NEB所述相应的限制性酶切方法)。将质粒进行Xho I和Kph I限制性酶切。如上所述将质粒进一步进行正向和反向测序，鉴定到新的接头。接头构建物(II)的克隆如图31所示装配接头。首先将编码接头构建物(I)的质粒用80U XhoI在NEB2缓冲液中进行限制性酶切，然后用40U Kpn I在NEB1缓冲液中进行进一步的限制性酶切。两次限制性酶切都是在100μg/ml BSA中于37℃进行过夜，限制性酶切混合物在每次温育后都用WizardDNA清洗系统(DNA Clean-up System)纯化。将单链寡核苷酸LINK1(F)和LINK1(B)各150pmol，分别在T4连接酶缓冲液中用T4多核苷酸激酶于37℃磷酸化反应60分钟。将激酶混合物于65℃热灭活20分钟，然后退火。首先将每种寡核苷酸25pmol的混合物于94℃温育5分钟以完全解开寡核苷酸。然后将这些寡核苷酸在热循环仪上每分钟下降1℃而由94℃冷却到20℃缓慢退火。将双链寡核苷酸冻干，并再溶于冰冷的无菌纯水中，并且向经限制性酶切的载体中加入摩尔数100倍过量的双链寡核苷酸并使用T4 DNA连接酶(NEB)于16℃连接过夜。将连接反应混合物热灭活(65℃，10分钟)并加到感受态TG1细胞中，在含100μg/ml氨苄青霉素的2xTY培养板上于37℃生长过夜。使用覆盖大约220bp包含接头区的引物组合LMB3(B)与Phenenco(F)或INT1(F)与INT1(B)，经PCR筛选鉴定阳性菌落(图29c)。后一组引物对新接头大小增加的分辨率较好。还通过Xma I消化和双向测序验证了质粒的序列。接头构建物(III)的克隆将含有带有接头构建物(II)的基因的质粒在含100μg/ml BSA的NEB1缓冲液中用40U Xma I和40U Kpn I于37℃限制性酶切过夜，并将限制性酶切混合物用WizardDNA清洗系统纯化。以与接头构建物(II)相似的步骤进行磷酸化、退火和将单链寡核苷酸LINK2(F)和LINK2(B)克隆到经Xma I/Kpn I限制性酶切的载体中(图32)。如对接头构建物(II)所述进行克隆的鉴定。图33显示了接头区(III)的结构。3D6 scFv的表达与纯化构建物可以以含有c-myc和His6标签的纯scFv的形式在载体pUC119His6mycXba中表达，或者它们可以作为只含有His6标签的碱性磷酸酶的融合蛋白形式在质粒pDAP2中(通过亚克隆)表达。将含有目的基因的质粒热转化到大肠杆菌TG1菌株中，在盛有500ml M9ZB培养基(含有1％(w/v)葡萄糖，加入了100μg/ml氨苄青霉素)的2升锥形瓶中进行克隆的表达。将新鲜接种的转化菌落于37℃(250rpm)在温育摇床(NewBrunswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ)中培养12-18小时至A600达到1.0-2.0。在诱导前，将细胞离心(4500xg，室温10分钟)并重悬于预热到30℃含有1％甘油的M9ZB培养基中。将温度降低到20℃左右，加入1mM IPTG(终浓度)并进一步温育3-24小时从而诱导3D6的表达。
将细胞进行渗透休克后，离心收获细胞(Sorvall，5400rpm，4℃，12分钟)并将沉淀块溶于渗透休克裂解缓冲液(100ml 20％蔗糖，30mM Tris，1mM EDTA)，于室温用力摇动10分钟后再离心(8500rpm，4℃，30分钟)。沉淀在100ml 5mM MgSO4中经过相似的处理(4℃，摇动10分钟)后，提取周质裂解物并在Spectropore管中透析。
将表达的3D6 scFv从周质裂解物中用金属亲和层析(Qiagen，Ni2+或Zn2+柱)纯化。将收集液浓缩，并在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析，Western电转移到硝酸纤维素膜上。用9E10小鼠抗体(c-myc)和连接了辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠抗体(Sigma)(在2％(w/v)奶粉PBS中稀释到0.1％(v/v))进行检测和纯度分析。通过碱性磷酸酶部分的活性(酶实验)直接检测3D6-碱性磷酸酶融合蛋白。使用Gill和von Hippel的方法由一级序列计算消光系数ε0.1％(分析生物化学(Anal.Biochem.)，1989，182，p319-326)，用分光光度法在280nm测定3D6的浓度。
使用具有gp41表位(短肽)、固定到GST(谷胱甘肽转移酶)表面的融合蛋白GST-epi41分析3D6 scFv的活性。GST-epi41通过它的伯胺固定在金片上，并用表面等离子体振子共振(BIAcore2000，Biasensor公司，瑞典)在不同温度下分析与3D6 scFv的结合。由至少5种不同浓度测定kon速率，而使用3D6的最高浓度测定koff速率。实施例5将弹性序列加工到含有二硫桥的蛋白A微型结构域的一级结构中又合成了两种肽——5号肽和6号肽(图35)，并如实施例3所述进行研究。
5号肽和6号肽与实施例3中研究的肽表现相似。具有弹性序列的6号肽在222nm处的CD-振幅随温度升高而增加，而且同样的，在对照肽中α-螺旋随温度升高而熔解。此外，通过加入硫酸钠，正如CD-光谱所示，6号肽形成被认为是I型β-转角的结构(图36)。
使用由制造商(BIAcore)提供的胺偶联试剂盒，将3370RU的Fc-561(如上文所述)用HSA(3717 RU)固定在对照CM-5芯片表面，通过表面等离子体振子共振(BIAcore 2000)进一步研究肽。图37图解了温度对5号肽和6号肽的影响。这在图38中进一步图解，该图中还给出了不同动力学参数(与上文实施例3所述相似，但显示略微大些的影响)。结果6号肽(具有VPGVG转角)对Fc-561的亲和力随温度在5-37℃增加大约20倍。这与不具有VPGVG-转角的5号肽是相反的(图38c)。
6号肽结构表现与实施例3中研究的肽相似，它随温度升高而形成I型β-转角。
权利要求
1.含有功能部分和至少一个插入的氨基酸序列的生物分子，该氨基酸序列包含当一个或多个环境参数适当改变时可收缩的弹性肽，其中当插入的序列被诱导收缩或伸展时，该功能部分的性质或特征改变。
2.权利要求1的生物分子，其中所述生物分子包含一个或多个多肽。
3.权利要求1或2的生物分子，其中所述功能部分是抗体或者它的功能变体、衍生物或类似物。
4.权利要求1-3中任何一项的生物分子，其中所述氨基酸序列插入到组成成分之间，构成形成生物分子其余部分至少一部分的链，以形成连续链。
5.权利要求1-4中任何一项的生物分子，其中所述的插入氨基酸序列取代了它所插入的分子的一部分。
6.权利要求1-5中任何一项的生物分子，其中所述氨基酸序列由弹性肽及位于其一侧或两侧长度为1-100个氨基酸的侧翼序列组成。
7.权利要求6的生物分子，其中所述N末端的侧翼序列为GVG或GGVG。
8.权利要求1-7中任何一项的生物分子，其中所述环境参数为温度、压力或pH。
9.权利要求1-8中任何一项的生物分子，其中所述性质或特征的改变是不可逆的。
10.权利要求1-9中任何一项的生物分子，其中当所述弹性肽被诱导收缩时，所述功能部分活性提高。
11.权利要求1-10中任何一项的生物分子，其中所述弹性肽含有序列(XP/G(X)m)n，其中XP/G(X)m代表一个可收缩单位，P/G是脯氨酸或甘氨酸，每一个X代表任何氨基酸且可以是相同的或不同的，m是1-10的整数，n是1-100的整数，序列中的每一个单位可以是相同的或不同的。
12.权利要求11的生物分子，其中每一个X选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或其它疏水性氨基酸残基或者它们的衍生物。
13.权利要求10或11的生物分子，其中XP/G(X)m具有序列VPGVG、VPGV或IPGVG。
14.权利要求10-13中任何一项的生物分子，其中m＝1-6。
15.权利要求10-14中任何一项的生物分子，其中m＝1-3。
16.权利要求1-10中任何一项的生物分子，其中所述弹性肽含有序列(PEXK)n或(XKEXPEKX)n，其中P、E和K分别指脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸，每一个X可以是相同的或不同的任何氨基酸，n是1-100的整数，序列中的每一个单位可以是相同的或不同的。
17.权利要求16的生物分子，其中X选自亮氨酸或缬氨酸或者它们的衍生物。
18.权利要求16或17的生物分子，其中序列PEXK为PEVK。
19.权利要求16或17的生物分子，其中序列XKEXPEKX为LKELPEKL。
20.权利要求10-19中任何一项的生物分子，其中n＝1-10。
21.权利要求10-20中任何一项的生物分子，其中n＝1-5。
22.权利要求1-21中任何一项的生物分子，其中所述弹性肽长度为5-25个氨基酸。
23.权利要求1-22中任何一项的生物分子，其中所述插入的氨基酸序列长度为5-100个氨基酸。
24.权利要求23的生物分子，其中所述插入的氨基酸序列长度为8-20个氨基酸。
25.权利要求1-24中任何一项的生物分子，它是由化学合成法产生的。
26.权利要求2-25中任何一项的生物分子，它是由表达编码该生物分子的DNA序列产生的。
27.权利要求3-26中任何一项的生物分子，其中该生物分子是单链抗体，所述氨基酸序列插入到所述抗体的连接区内。
28.权利要求1、2或4-26中任何一项的生物分子，其中所述生物分子具有可诱导的酶活性。
29.含有编码权利要求2-28中任何一项所定义的生物分子的序列的核酸分子。
30.含有权利要求29定义的核酸分子的载体。
31.权利要求1-28中任何一项定义的生物分子在纯化方面的用途。
32.权利要求1-28中任何一项定义的生物分子作为生物传感器，用来检测或监控该生物分子环境参数改变的用途。
33.权利要求1-26中任何一项的生物分子作为药物的用途。
全文摘要
本发明涉及含有插入的氨基酸序列的生物分子,该氨基酸序列包含可诱导收缩的弹性肽,该弹性肽在收缩或伸展时会改变它所插入的分子(特别是生物分子如抗体)的性质或特征。本发明还涉及编码这种生物分子的核酸分子以及它们的用途。
文档编号G01N33/53GK1276796SQ98810230
公开日2000年12月13日 申请日期1998年8月28日 优先权日1997年8月29日
发明者H·雷尔森, A·里斯, L·科斯那斯 申请人:戴奈尔有限公司