用于高效细胞分类的流动细胞光度计管嘴的利记博彩app

专利名称：用于高效细胞分类的流动细胞光度计管嘴的利记博彩app
背景技术：
发明领域实践已经证明，利用流动细胞计量和分类法将精液物理分离成带有精子群的纯化的X-和Y-染色体对于人、牛、猪、羊和兔的性别预选是行之有效的。
分类过程的成功取决于分析精子中的DNA含量的精度和效率。精子的高度溶解流动细胞计量法DNA分析受到其荧光的不均匀辐射的妨碍。由于精子头的平的形状、染色质的密实和高折射率，来自精子边缘的荧光比来自精子的平面侧的荧光亮得到多(Gledhill等，J.CellPhysiol 87期367-376页(1976)；Johnson等，细胞光度计7期，268-273页(1986)；Pinkel等，细胞光度计3期1-9页(1982))。这一事实与无规则定向一起导致了在一样品内的荧光的广泛分布，这种分布中隐藏着具有不同的DNA含量的特定的子群。对于这个问题的一种解决方案是采用一种落射显微照射流动细胞光度计，这种细胞光度计采用了共轴流动的特性。然而，这种系统一般不适用于细胞分类。结合DNA分析和分类的唯一的方案是使用一种正交流动细胞光度计/细胞分类器来收集仅来自适合定向的细胞的荧光(如上述Johnson等和Pinkel等文件)。在这种正交系统中，采用一种90°荧光检测仪用来检测适合定向的精子。一个明亮的信号表示精子的明亮的边缘相对于该90°检测仪有效地定向，因此，平面侧朝向激光束。在该细胞分类器上附加一前荧光检测器(0°)，以便从与激光束相对的平面收集荧光。从适合定向的精子的平面侧收集的向前的荧光信号是DNA含量的精确的测量(如上述Johnson等和Pinkel等文件)。
只有在满足如下的三个准则时改进的高效分类对精子才能是有价值的，这三个准则是1)不降低DNA测量的精度(保持90％的纯度)。
2)分类的稳定性不降低(调节细胞分类器时不浪费时间)。
3)可以重新获得足够的精子，使得它们能在玻璃试管中繁殖和人工授精。
本发明涉及一种新颖的管嘴，其设计成可以独立于外层流速度和样品流量来对大部分精子定向并分类。
现有技术的描述在一般的细胞分类器中，精子(细胞)无规则定向。为了将精子分性，人们已经对细胞分离器进行了改进，用斜面针代替了样品注射针(Dean等，Biophys.J.23期7-13页(1978)；Fulwyer，J.Histochem.Cytochem 25期781-783页(1977)；如上述Johnson等；如上述Pinkel等；Stovel等，Biophys.J.23期1-5页(1978)；Welch等，Cytometry17(辅7)74期(1994))。这种斜面针迫使更大比例的精子在适合的方向上穿过激光束，因为它将圆柱形样品流重新成形为一薄带。这种斜面针有助于使精子定向，特别是使精子头定向，例如无尾精子。离开斜面针的样品核成为一带状，该带对精子施加定向力。然而，只有当样品流较窄时这种带才存在；这就是说，在低样品压力并伴随低样品流量的情况下才存在。这些条件对于高效的精子分类是不利的。而且，由于使用斜面针而带来的定向的改进对于存活的并且能动的精子来说并不那么明显。采用这种系统时，只有20-40％完整的可存活的精子被正确定向(Johnson，Reprod.Fertil.Dev.7893-903页(1995))。这意味着60％至80％的检测到的精子经过分析后发现不适合于DNA分析。对完整并可存活的细胞进行分类的能力与改进的定向效率的结合导致了更高的分类效率。
Kachel等(J.Histochem.Cytochem.25774-780(1997))公开了一种用于将扁平颗粒(固定的鸡红血球)在一显微镜上定向的非对称Plexiglas室。Kachel等建议，施加流体动力聚焦力所必需的最简单的流动通路包括一管，该管具有一椭圆形横截面，并终止于一椭圆形出口，该椭圆出口的长轴与构成椭圆管的横截面的长轴成直角。并没有建议将这种装置与一细胞分类器一同使用。
本发明的概述我们现在发现一种特别适用于在一细胞分类器中将非对称或“扁平”细胞进行高效流动分类的管嘴。这种管嘴的独特的设计将两个椭圆形的内部区域与一个椭圆形的出口孔结合起来，能够稳定地形成滴落并分类细胞。本发明的管嘴的一种独特的特性在于，当用于完整的可存活精子时，定向精子的比例基本上与精子的可动性、样品的流速和层流速度无关。
按照这种发现，本发明的一个目的是提供一种细胞分类器管嘴，其将改善一分离流中的非径向对称细胞的正确定向的效率。
本发明的一个特定的目的是提供一种用于在一流动细胞仪中改善精子细胞分类的精度和效率的装置。
本发明的再一个目的是能够使用高速细胞分类器，使每单元时间分类出的精子的数量最大化。
从下面的描述中很容易看出本发明的其它目的和优点。
附图的简要描述

图1是本发明的管嘴的一个实施例的透视图；图2A是本发明的管嘴的内部轮廓的前视图；图2B是图2A所示的管嘴的内部轮廓的俯视图；图3A是本发明的管嘴的内部轮廓的侧视图；图3B是图3A所示的管嘴的内部轮廓的俯视4A是用现有技术的斜面针/锥形管嘴系统测出的公猪的完整精子的定向直方图；以及图4B是用通常的圆柱形针/按照本发明的椭圆形管嘴测出的公猪的完整精子的定向的直方图。
本发明的详细描述本发明的这种新颖的管嘴设计的最典型的实施例是一种空气中射流的管嘴，在下面的讨论中对这种管嘴进行描述。然而，熟悉本领域的一般人员应该理解，这种设计也可以与其它类型的管嘴结合，例如一种石英通道管嘴。
参见图1，这种管嘴基本上包括一具有内部螺纹2的本体1或其它适合于与流动细胞本体或管嘴夹(未示出)连接的装置。在一种替换实施例中，可以用一种压力装配来代替配合螺纹，将管嘴与管嘴夹连接。管嘴的内部适合于接收样品注射针3，调节该注射针，使其伸入管嘴内的深度足以保持一层流。注射针可以是一种标准的圆柱形针，也可以是一种斜面针。在管嘴的与连接装置相对的尖端是一个圆柱形孔5，其用作流动管嘴的最终出口。孔5一般钻入一定位在管嘴本体1的端部的宝石4上。
参见图2A、2B、3A和3B，管嘴的内部包括一第一椭圆区域8和一第二椭圆区域9，一过渡区域12将该两椭圆区域分开。实际上，第一和第二区域以及过渡区域12的所有横截面各为一椭圆的形状，各椭圆具有一长轴和一短轴。第一区域8从嘴部到过渡区域12为锥形，使得所述过渡区域的横截面小于该嘴部的横截面。第二区域从过渡区域到一出口孔15为锥形，使得出口孔15的横截面小于过渡区域的横截面。椭圆出口孔的长轴大致与嘴部和过渡区域的长轴成90°。孔5紧接地位于椭圆形出口孔15的下游。孔5与出口孔15同心地对正，并且其横截面面积也小于出口孔。管嘴1的内部形状可以用一个标准的挠性漏斗想象，将该挠性漏斗的钵体的相对侧挤压，以在嘴部形成一椭圆形，然后再用与施加于钵体的力成90°的力挤压漏斗的主干部，以便在主干部出口处形成一个椭圆形的槽。
在下面的表I中给出了一本发明优选实施例中的实际的相对尺寸。在图2A、2B、3A和3B中标出了这些尺寸的标记。尺寸A和B分别表示嘴部10的短轴和长轴。尺寸a和b分别表示过渡区域12的短轴和长轴。尺寸a还表示出口孔15的长轴。尺寸c表示出口的短轴。尺寸X是第一区域8的高度，尺寸Y表示第二区域9的高度。在表I中给出的尺寸被认为是对于完整的可存活精子的定向的目的来说大致是最佳的。然而，熟悉本领域的人员应该理解，这些尺寸在合理的限度内是可以变化的，这种变化不会显著地改变在对可存活的精子和其它非对称细胞和物品进行定向时管嘴的分类起作用的能力。这些尺寸的公差至少为表I中给定的值的10％。
表II表示各种有意义的管嘴尺寸基于表I中所给出的关系的比率。这些比率可以在±20％的限度内变化，其条件是，B/A的比率保持大于1，这样才可以使嘴部10为椭圆。典型的是，B/A应该至少为1.1.将B/A与b/a比较，显然第一区域的横截面的长轴相对于短轴的相对尺寸从该区域的嘴部到过渡区域逐渐增大。在接下来的过渡区域下游的横截面中，即，在第二区域中，长轴/短轴之比率开始下降。在位于过渡区域12与出口孔15之间的“转换”点20处，两轴相等且第二区域的内部横截面为圆。从该转换点至出口孔，第二区域的横截面重新成为椭圆；但此椭圆的横截面的长轴与上述转换点之上的横截面的长轴成90°角。对于由接近出口孔的各相继的横截面所内接的椭圆，长轴与短轴的比率逐渐增大。应该理解，在从管嘴的嘴部到出口孔的各逐渐下游的横截面上，长轴与短轴的尺寸与第一和第二区域的连续的锥度同步下降。
本发明的椭圆形管嘴能够使超过60％的精子定向以进行分类。与普通的采用一标准的圆柱形管嘴结合一标准的圆锥样品注射针并且精子垂直于激光束无规则定向的系统相比，这种椭圆形管嘴使为分类而定向的精子的比例增加约三倍。与一标准的并结合了一斜面注射针的标准的锥形管嘴相比，效率大约增加了两倍。当使用一斜面针来定向精子时，定向的精子的那部分随着增加的样品速率而下降。我们已经发现，由于椭圆管嘴，在高达每秒至少15000精子的样品速率下保持着一种适合的定向比例。这种高量级的性能对于有效的精子分类是有益的。在利用牛精子进行的测试(例5)中，显然，一台装备有这种新的管嘴的细胞分类器有效地分离出纯度为90％的带有精子的X-和Y-染色体。
可预见本发明的管嘴可用于分类各种哺乳类的存活的精子，也可以用于分类血细胞、卵细胞和其它非对称单元。用牛精子所作的测试(例2)表明，管嘴的性能没有受到精子游动性的影响。
装有本发明管嘴的一种高速分类器将分类的带有精子的X-和Y染色体的产量提高了10倍，并且使得用有性别的精子的人工授精代替玻璃试管中繁殖更加可行，也使得牲畜或其它动物在性别预选时的胚胎移植和外科授精更加可行。
下面的例子用于进一步描述本发明。
例子精子制备和染色在本次研究中采用了按照常规采集计划从几头成年公牛和几只育龄公猪排出的精液，还采集了成年的新西兰白牡兔(兔子)的精液。此外，还分别对鼠和人的精液样品做了演示目的的评价，因为它们的精子的头的形状不同。由Johnson等(Biol.Repro.41199-203(1989))和Johnson等(Gamete Research17203-212(1987)描述的方法进行的精液制备和染色。简而言之，纯精液部分扩散为浓度为15X106/ml至100×106/ml的纯精液部分对于公牛精子，由Hepes缓冲的介质中含有0.1％BSA(pH＝7.4)，对于公猪精子，BeltsvilleThawing溶液(BTS，pH＝7.2)，对于兔子精子，Tris缓冲剂(0.21 MTris，58mM葡萄糖和67mM柠檬酸；pH＝6.9)。鼠和人的精液在BTS中扩散。接着以每15X106精子7.1μM Hoechst33342(Calbiochem-Behring Corp.，La Jolla，CA)对精子进行染色，并在32℃的条件下孵化40分钟。对于公牛精子研究，在分析之前，将propidiumiodide(PI)(1.5μm，Calbiochem-Behring Corp.，La Jolla，CA)加入Hoechst33342染色的精子上。这使得死的精子与活的精子区分开，正如Johnson等人所描述的(1994)。
细胞分类对于例1-5，采用两种带有本发明的管嘴的标准细胞分类系统来对可存活的完整精子进行分类EPICSV系列流动细胞光度计/细胞分类器(Coulter Corporation，Miami FL)和EPICS750(一种EPICSV的改进型)。对于例6和7，采用一种新的系统，MoFlo高速细胞分类器(Cytomation Inc.，Fort Collins，CO)。对各细胞分类器进行了改进，使其用于对精子进行分类，如Johnson等所述(1986)。基本的改变是将向前光散射二级管探侧器改为一向前的荧光探侧器，这对于完整和可存活的精子的定向和分类是必要的。这种改进使得能够从较亮的精子边缘收集荧光(存在90°荧光探侧器，其选择适合定向的精子的比例)，也能够从精子的较暗的一面收集荧光，后者的荧光只由向前探侧器从定向的精子中收集。标准的EPICS使用一种76μm的锥形液流管嘴，这种管嘴被本发明的具有表I中所示的尺寸的椭圆形管嘴所代替。对MoFlo高速系统做了改进，使其具有与EPICS系统共同的完整的流动细胞系统，这样，MoFli高速系统就能够接收椭圆形管嘴。精子在穿过射流进入空气的管嘴后即与激光束交会。只有管嘴对精子的定向负责，其既可以与标准的圆柱形针配合实现精液的定向，也可以与斜面针配合实现精子的定向。用紫外线光刺激染色的精子的荧光。
为了充分演示本发明的效率，进行了若干试验。下面描述的前5个试验用于对改进进行定量(学生的小样品t-试验)，以便由本发明的管嘴获得定向和分类。后两个试验(例6和7)将本发明的管嘴用于高效的X和Y精子分类，以便进行否则无法实现的繁殖。
在报告所分类的样品的纯度时，百分比通过对分类的样品的流动细胞再分析确定。用脉冲声波刺激精子的部分(100000至250000精子)，以使其尾部移动(以便能够在分析时更精确)。将这些精子抑制并重新放置在流动细胞光度计上。所形成的统计直方图带有具有一种双Gausian曲线配合的程序。
例1在本实例中，将本发明的管嘴的性能与一标准的精液分类系统和一采用了出口处带有12°包角的斜面针的系统进行了比较。在不同的两天用标准的锥形管嘴和标准的圆柱形注射针对8头不同的公牛的精液进行了分析。在不同的三天，用1)标准的锥形针和斜面针，2)椭圆形针和标准的圆柱形针对15头不同的公牛的精液进行了分析和计量。
样品的流速为大约每秒2000精子。在各例中为选择定向的精子的信号而设定的窗口都相同。用两个不同的细胞分类器(EPICSV和EPICS750)以标准的及椭圆形的管嘴对精子进行了计量。通过这种方式，避免了由于向前和向后改变针而使定向的精子的比例降低。
使用椭圆形管嘴与配装有圆柱形针或斜面针的标准管嘴相比，公牛精子的定向有了很大的改进(成对差别的t-试验，p＜0.05，单独数据未示出)。用椭圆形管嘴(52.5±4.7％，n＝15)与结合了标准的圆柱形针的标准的锥形管嘴(17.3±0.7％，n＝8)相比，定向的精子的比例平均提高了3.0倍，与结合了斜面针的标准管嘴(22.7±3.5％，n＝15)相比，定向的精子的比例平均提高了2.3倍。
例2设计本实例是为了分析采用了本发明的椭圆形管嘴定向后对精子的活动性的影响。活动性是可存活精子的一项重要的特征，因为只有活动的精子样品才被认为是适合于区分性别和繁殖。将定向的完整的可存活精子的比例与定向的但无尾部的精子的比例和定向但死去的完整的精子的比例做了比较。在不同的四天对不同的公牛的精液进行计量。样品流速大约为每秒2000个精子。通过其Hoechst荧光的不同，可以从死去的精子中单独分析出可存活的精子，因为只对死去的精子染色PI使Hoechst荧光熄灭。
定向的可存活的公牛精子的比例(56.8±6.7％)与无尾的公牛精子(59.8±4.2％)或死去的公牛精子(53.3±4.3％，在p＝0.05，n＝4时无显著差别)的比例相同，这表明采用新颖的椭圆形管嘴时活动性对公牛精子的定向的影响可以忽略。
例3设计本实例是为了估计在定向时样品流速的影响。样品流速是很重要的，因为它有利于在尽可能短的时间内对精子分类。在两天内用500精子/秒和2000精子/秒的样品流速对8头公牛的精液进行了计量。对于500精子/秒的样品流速，获得了52.1±6.4％的定向，而对于2 000/秒，获得52.3％±6.5的定向。(n＝8，成对差别t-试验)，这表明，定向没有受到样品流速的影响。
例4在例4中，对收集的兔子、鼠和人的精子进行了评价，以便研究这种椭圆形管嘴对这些精子形态完全不同的物种的定向的影响。用椭圆形管嘴对3只不同的兔子的精液进行分析，并测定正确定向的精子的比例。此外，对鼠精子和冷冻后解冻的人精液进行了分析，以演示这种管嘴对这些物种的应用。
用椭圆形管嘴进行计量时，很高比例的兔子精子被正确地定向(48±2.4％，n＝3)。用鼠精子和冷冻后解冻的人精子获得的定向精子的比例分别为44％和45％。
例5设计本实例是为了试验这种新颖的管嘴系统对于从两种物种中分类出足够数量的总体的精子的能力，然后可以将这两种精子空运到国家的不同的地区，并用于在同一天在该特定的位置进行母卵细胞的试管繁殖。在每天的试验(表III)中都得到了高纯度的分类出的样品。所获得的纯度平均为，X精子分类纯度87.6％±3.1％和Y精子分类纯度89.3±2.5％。
获得的公猪精子定向的平均特征为，X精子分类纯度85.3±2.1％，Y精子分类纯度89.4±2.4％(表IV)。定向精子的比例平均为60.5±0.9％。用锥形管嘴/斜面针系统和椭圆形管嘴/斜面针所获得的定向统计直方图分别表示在图4A和4B中，以示出定向的显著的改进。图中成对的彼此垂直的线表示有效地分类带有精子的X和Y染色体所需的定向窗口。
例6例6表示在很短的时间内可以分类出足够的精子，而且其数量足以用于进行常规的牛的人工授精。两百万使用公猪和公牛精子分类出的X和Y精子需要分别在上午9点至中午之间以及上午8点至10点之间以大约90％(85-95％)的纯度分类和回收。附加这些限制条件是因为需要抵消空运的时间，这样就可以在其它国家中由研究合作者在同一天进行玻璃试管繁殖(IVF)。
上述分类对于公猪IVF成功地进行了4次，对公牛IVF成功地进行了6次。用以前的每小时只能回收几十万精子的分类技术不能进行这种试验。
例7分类出的X和Y(首先是X)精子被用于奶牛的人工授精。对于每个接收对象需要大约四至五百万个纯度为大约90％(85-90％)的精子。每天用分类出的精子对多达5个接受对象进行人工授精。因此，在上午9点与下午4点之间需要分离出两千五百万X精子(X和Y总数五千万)。如果不使用本发明的管嘴，这一直是不可能的。这些试验(1至5)成功地进行了5次。
表I优选实施例的参数A B a b c X Y实际(mm)6 7 0.9 2 0.2 5.52.5相对于c 30c35c4.5c 10c-27.5c 12.5c表II优选实施例的有意义的尺寸比率
.5表IV用椭圆形管嘴计量的猪(公猪)X精子和Y精子的分类纯度日定向 X类(％) Y类(％)1 61.5 84.0 89.02 60.0 84.3 87.33 60.0 87.7 92.0平均±公差60.5±0.9 85.3±2.1 89.4±2.权利要求
1.一种管嘴，其包括一具有第一内部区域和第二内部区域的本体，一过渡区域将所述第一区域与所述第二区域分开，其中，所述第一区域、第二区域和所述过渡区域的各横截面基本上都为一具有一长轴和一短轴的椭圆形，所述第一区域包括一嘴部，并且从所述嘴部到所述过渡区域为锥形，所述过渡区域的横截面小于所述嘴部的横截面，其中，所述第二区域从所述过渡区域到一出口孔为向下的锥形，所述出口孔的横截面小于所述过渡区域的横截面，其中，所述出口孔的长轴与所述嘴部和所述过渡区域的长轴之间的夹角大约为90°。
2.如权利要求1所述的管嘴，其中，所述过渡区域的长轴与短轴的比率大于所述嘴部的相应的比率。
3.如权利要求1所述的管嘴，其中，所述出口孔的长轴与短轴的比率大于所述过渡区域的相应的比率。
4.如权利要求1所述的管嘴，其中，随着所述第一区域的横截面面积从所述嘴部到所述过渡区域的减小，所述长轴与短轴的比率增加。
5.如权利要求1所述的管嘴，其中，所述长轴与短轴的比率从所述过渡区域到所述第二区域内的一点下降，在该点上，所述长轴与短轴相等，然后，长轴与短轴的比率增加，且该长轴与所述嘴部和所述过渡区域的长轴的夹角大致为90°。
6.如权利要求1所述的管嘴，其中，所述管嘴还包括用于连接流动容器的装置。
7.如权利要求6所述的管嘴，其中，所述连接装置为与所述第一区域相邻的内螺纹，并且适合于被所述流动容器的外螺纹所接受。
8.如权利要求6所述的管嘴，其中，所述连接装置为一种压力配合结构。
9.如权利要求1所述的管嘴，其中，所述本体还包括一位于所述出口孔下游的圆柱形孔口，该孔口的横截面小于所述出口孔的横截面。
10.如权利要求1所述的管嘴，其中，在图2A、2B、3A和3B中的B/A的比率在大约1.1-1.4的范围内，b/a的比率在大约1.8-2.6的范围内，a/c的比率在大约3.6-5.4的范围内，X/A的比率在大约0.7-1.1的范围内，Y/a的比率在大约2.2-3.4的范围内，A/a的比率在大约5.4-8.0的范围内，而B/b的比率在大约2.8-4.2的范围内。
11.如权利要求1所述的管嘴，其中，在图2A、2B、3A和3B中，A值大约为6mm，B值大约为7mm，a值大约为0.9mm，b值大约为2mm，c值大约为0.2mm，X值大约为5.5mm，Y值大约为2.5mm。
全文摘要
一种分类管嘴(1),其具有两个横截面为椭圆的锥形区域(8、9),这种管嘴能够定向并分类不对称或大部分扁平的细胞。这种管嘴(1)特别适用于在细胞分类器中分类可存活的阳(Y)和阴(X)精子群。
文档编号G01N33/48GK1265195SQ98807567
公开日2000年8月30日 申请日期1998年7月24日 优先权日1997年7月24日
发明者W·伦斯, G·R·维尔希, L·A·约翰逊 申请人:美国政府农业部