用于基因疗法的核酸构建体的利记博彩app

专利名称：用于基因疗法的核酸构建体的利记博彩app
本申请涉及一种蛋白质，该蛋白质可抑制细胞蛋白质p27，从而可解除由p27引起的对细胞增殖的抑制，本申请还涉及该蛋白质的突变体，一些所述的突变体具有显性干涉性状，本申请还涉及编码这些蛋白质的相应核酸，以及所述蛋白质和核酸用于预防和治疗疾病的用途。另外，本申请公开了用于疾病的基因疗法的核酸构建体，所述构建体含有上述核酸。
真核细胞的细胞周期受依赖于细胞周期蛋白的激酶(cdks)的控制；所述激酶需要调节性亚单位(“细胞周期蛋白”)才能保持活性。细胞周期的不同过程(如复制和进入有丝分裂)受不同cdks控制(Morgan，自然，374，131(1995))。与之相关的是依赖于细胞周期蛋白的激酶的活性受到高水平的调节。在这种情况下存在的内部控制机制可以例如防止进入有丝分裂直至DNA已完成其复制。如生长因子的外部因子的控制仅在DNA复制开始前发生；复制由有活性的细胞周期蛋白E/cdks2复合物起始。
除了激酶亚单位中细胞周期蛋白的量以外，依赖于细胞周期蛋白的激酶的活性也受小的抑制蛋白调节(Sherr和Roberts，Gene Dev.，9，1149(1995))。例如，根据其大小被称为p21和p27的两个抑制剂对于细胞周期蛋白E/cdk2而言是至关重要的。通常，在表达大量p27的细胞中，细胞周期蛋白E/cdk2激酶不具活性，DNA复制的进入因而被阻断。
尽管细胞周期正调节物在很多人肿瘤中过量表达或至少组成型表达(Sherr，科学，274，1672(1996))，而负调节物经常突变或仅少量表达(Fero等，细胞，85，733(1996))。这两者存在特殊的关联例如，发现细胞周期蛋白D1基因在很多颈肿瘤中过量表达。因此我们希望依赖于细胞周期蛋白的激酶及其功能是寻求新的，选择性的，具有抗增殖效应的物质过程中的靶结构。
几年前已知p27蛋白的基因(K.Polyak等，细胞，78，59-66(1994))，该基因可得自GenBank[鼠p27；登记号为K09968；人p27K10906]。尽管已对p27基因进行了深入的研究，但迄今为止仍未在人肿瘤中发现p27基因的突变。这种现象非常令人惊奇，因为p27基因失活的小鼠表现出多发性发育异常的表型和肿瘤发生率增加(Fero等，细胞，85，733(1996)，Kiyokawa等，细胞，85，721(1996))。取而代之的是p27的功能明显地受转录后主调节。
因此，p27由蛋白酶解降解；在正常细胞中这也在DNA复制开始时发生。与正常组织相比，很多肿瘤中蛋白酶解降解p27的能力显著增加，这似乎与不利的预后直接相关(Loda等，天然药物，3，231(1997))。
然而，也必定有能导致p27失活的其它机制。例如，用Myc癌基因转化细胞之后，p27首先在功能上失活(即不再与细胞周期蛋白/cdk复合物结合)，并仅在较晚的阶段被降解。迄今为止仍无法理解例如为什么很多乳腺肿瘤可表达大量p27蛋白，而这些肿瘤仍能非常快速地生长。目前仍不知道在这些肿瘤中使p27失活的机制(Fredersdorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，6380(1997))。
因此，有关专家很有兴趣发现负责使肿瘤中p27失活的机制或物质。本发明已解决了这一难题。本申请中描述的蛋白质p163能结合p27，可抑制p27的功能并可导致p27在胞质中被蛋白酶解。1)蛋白质p163及其核酸序列本发明涉及一种新的，被称为p163的蛋白质，该蛋白质能结合p27，从而可抑制p27的功能并可导致p27在胞质中被蛋白酶解。该蛋白质的氨基酸序列已被测定。
蛋白质p163特异性地与p27结合，而不与如Myc，Max，Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白质结合。
本发明还涉及编码蛋白质p163的核苷酸序列。已测定小鼠p163蛋白的核苷酸序列，通过序列比较，也测定了人p163蛋白的核苷酸序列。2)显性失活的p163类似物本发明还涉及编码p163组成肽的核苷酸序列和/或编码身为p163的类似物并可发挥显性失活作用的蛋白质的核苷酸序列，所述显性失活作用即为抑制天然p163蛋白与蛋白质p27结合，而基本上不会削弱p27蛋白与细胞周期蛋白E/cdk2的结合和由此引发的细胞周期蛋白E/cdk2的抑制作用。
本发明还涉及编码p163蛋白显性失活突变体的核酸序列或其组成序列的应用，所述应用包括将这些核酸序列导入靶细胞，抑制靶细胞-特异性p163蛋白和靶细胞-特异性p27蛋白之间的结合，以使靶细胞的增殖被由此释放的靶细胞-特异性p27蛋白抑制。3)抑制p163的肽然而，本发明也涉及编码抑制p163功能的蛋白质或肽的核苷酸序列。所述蛋白质或肽包括与p163蛋白上用于结合p27蛋白的位点结合或与p163蛋白上用于结合Ran(Loeb等，分子细胞生物学，4，209-222(1993))的位点结合，从而可抑制对细胞而言为内源性的p163蛋白的蛋白质或肽。
这些蛋白质包括对应于p27蛋白或Ran蛋白上用于结合p163蛋白的位点的肽。这些蛋白质另外还包括对蛋白质p163，尤其是对其结合p27蛋白的位点具有特异性的抗体或抗体裂解产物，如F(ab)2，Fab，Fv和scFv。
本发明还涉及编码这类抑制蛋白或肽的核酸序列的应用，所述应用包括将这些核酸序列导入靶细胞，抑制靶细胞-特异性p163蛋白和靶细胞-特异性p27蛋白或靶细胞-特异性Ran蛋白之间的结合，以使靶细胞的增殖被由此释放的靶细胞-特异性p27蛋白抑制。4)p163刺激细胞分裂的用途本发明还涉及编码p163蛋白的核苷酸序列或p163蛋白自身用于抑制对细胞而言为内源性的p27蛋白，从而刺激靶细胞的细胞分裂的用途。5)抑制p163的转录和翻译然而，本发明也涉及抑制编码p163蛋白的靶细胞-特异性核酸序列转录和/或翻译，从而导致p27蛋白被释放，进而抑制靶细胞增殖的核酸序列。本发明的这类核酸序列可以是例如反义(三链体)DNA，反义RNA和/或核酶。6)筛查p163抑制剂的检测系统本发明还涉及编码p163蛋白的核酸序列，或p163蛋白，或其组成序列用于筛查p163蛋白和p27蛋白或Ran蛋白之间结合的抑制剂的检测系统的用途，和这些检测系统中发现的p163蛋白抑制剂用于抑制靶细胞增殖的用途。7)检测p163以诊断疾病本发明还涉及编码p163蛋白或编码p163蛋白之组成序列的核酸构建体，或与p163蛋白的这些核酸序列结合的核酸序列或蛋白质序列，或与p163蛋白结合的蛋白质用于检测细胞或组织或体液中编码p163的核酸或检测其中的p163蛋白以确定细胞或组织的增殖状况或诊断疾病状况的用途。8)含有结合p27或p163/p27蛋白复合物的序列的表达系统本发明还涉及一种表达系统，该系统所含核酸序列的表达受p27蛋白的控制，所述表达系统至少含有下列组分组分a)—至少一种激活序列(启动子No.I)组分b)—至少一种转录因子的基因，所述转录因子由融合蛋白组成，组分b)含有·组分b1)转录因子的至少一种激活域·组分b2)1)与p27蛋白结合的p163蛋白的至少一种序列或至少一种组成序列，或2)与p27蛋白中用于结合p163蛋白的位点结合的至少一种抗体或至少一种抗体片段，如Fab，Fv或scFv，或3)与p163蛋白中用于结合p27蛋白的位点结合的至少一种抗体或至少一种抗体片段，如Fab，Fv或scFv，或4)与由p163和p27组成的复合物结合的至少一种抗体或至少一种抗体片段，如Fab，Fv或scFv。
·组分b3)转录因子的至少一种DNA结合域组分c)—通过结合由组分b)编码的转录因子而被激活的至少一种激活序列(启动子No.11)组分d)—至少一种效应基因。
各个组分排列的示例见

图1。所述表达系统能发挥本发明所述功能的前提条件是组分b21)，b22)或b23)被置于组分b1)和b3)之间或加入组分b1)和b3)中以使p27蛋白或p163蛋白与组分b2)的表达产物的结合可抑制激活域[组分b1)]和/或DNA结合域[组分b3)]的功能。在有游离p27或游离p163的细胞中，这种抑制导致效应基因的表达受抑制。在p27蛋白和/或p163蛋白处于复合状态以使之不再能与组分b2)相互作用，或使之不再存在或仅少量存在的细胞中，这种抑制不复存在，这意味着转录因子[组分b)]能以无碍的方式激活激活序列[组分c)]，从而起始效应基因的转录。
组分b24)构成了与众不同的特征。在处于分裂的细胞中，p163/p27复合物与组分b24)的结合抑制了转录因子[组分b)]；与之形成对照的是，转录因子[组分b)]在静息细胞(即其时p27以游离状态存在)中是游离的和功能完全的。
通过激活激活序列[组分a)]可起始效应基因的转录，这会导致转录因子组分b)的基因被表达。转录因子[组分b)]反过来与激活序列[组分c)]结合，这会诱导效应基因[组分d)]的表达。
在本发明的一个具体实施方案中，组分a)与组分c)相同。在这个具体的实施方案中，轻度激活激活序列[启动子I，组分a)]可导致转录因子[组分b)]的表达，转录因子的表达既可激活激活序列[启动子I，组分a)]，也可激活激活序列[启动子II，组分c)]，从而既可以诱导效应基因[组分d)]的基因表达，也可增强转录因子[组分b)]的表达，反过来又可增强效应基因[组分d)]的表达。
通过下列方法可伸展表达系统—将效应基因[组分d)，d’)，d”)]的几个相同或不同的序列连在一起，每种情况下都通过相同或不同的IRES序列或通过激活序列[组分c’)和c”)]相互连接。
—将转录因子[组分b)]的几个相同或不同的基因连在一起，每种情况下都通过相同或不同的IRES序列或通过激活序列[组分a)或组分c)]相互连接。
当不同转录因子的基因连在一起时，选择激活序列以使它们含有能够结合转录因子[组分b)]的核苷酸序列。
根据所选择的激活序列[组分a)或c)]，可使用本发明的核酸构建体来非特异性地，细胞特异性地或病毒特异性地，或在特殊的代谢条件下，或者细胞周期特异性地表达效应基因[组分d)]。效应基因是这样一种基因，它的一部分可编码药理活性化合物或者编码能将无活性的药物前体裂解成活性药物的酶。
例如，所选择的效应基因应使所述活性化合物或所述酶能与配体一起被表达成融合蛋白的形式，所述配体能与细胞表面结合，所述细胞如内皮细胞或肿瘤细胞或白细胞。
优选上文述及的本发明的核酸构建体由DNA组成。术语“核酸构建体”可被理解为能在靶细胞中被转录的人工核酸结构。优选将所述核酸构建体插入载体，尤其优选插入质粒载体或病毒载体。
可给病人施用适当插入载体中的核酸构建体以预防或治疗疾病。给药的方式有经口，局部给药或通过注射或灌注给药。
本发明也涉及含有本发明核酸构建体的哺乳动物细胞。在一个特别优选的实施方案中，将核酸构建体导入细胞系，转染后该细胞系可用作本发明表达效应基因的表达系统的载体。可使用这种细胞给病人提供药物。或者，可将其中导入了本发明核酸构建体的细胞或细胞系，如肿瘤细胞，免疫细胞或内皮细胞局部施用于病人或非肠道(例如静脉内，动脉内)注射给病人或注射入体腔、器官内或皮下施用。
因此，本发明核酸构建体的优选用途在于预防或治疗疾病，对于本发明而言包括体外导入核酸构建体至靶细胞中，在靶细胞中非特异性地，病毒特异性地或靶细胞特异性地，代谢特异性地和/或细胞周期特异性地表达药物，以及给病人局部或非肠道施用靶细胞，或者给病人局部或非肠道施用核酸构建体以将核酸构建体体内导入至靶细胞中。
自然界中不会出现本发明这种形式的核酸构建体，即活性化合物或酶或配体-活性化合物或配体-酶融合蛋白的效应基因不会天然地与本发明核酸构建体中所含的核酸序列连接。
优选掺入本发明表达系统中的效应基因[组分d)]编码药理活性化合物。这种药理活性化合物是蛋白质和糖蛋白，它们选自细胞因子，生长因子，细胞因子或生长因子的受体，抗体或抗体片段，具有抗增殖或细胞静止效应的蛋白质，具有细胞程序死亡或抗细胞程序死亡效应的蛋白质，肿瘤抗原，血管生成抑制剂，诱导血栓形成的蛋白质，凝固抑制剂，具有溶纤效应的蛋白质，血浆蛋白质，激活补体的蛋白质，病毒和细菌的包膜物质，激素，对循环起作用的肽，神经肽，酶，介体，天然产生的、未经改变的调节蛋白和核酶，或对基因表达具有抑制作用的(反义)核苷酸序列。
优选转基因是编码核酶的效应基因，所述核酶可灭活编码蛋白质的mRNA，所述蛋白质选自细胞周期调控蛋白，尤其是细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B，细胞周期蛋白D1，细胞周期蛋白E，E2F1-5，cdc2，cdc25C，p163或DP1，或病毒蛋白质或细胞因子或生长因子或它们的受体。
在另一个实施方案中，效应基因编码配体-活性化合物融合蛋白，所述配体可以是抗体，抗体片段，细胞因子，生长因子，粘附分子或肽激素，活性化合物可以是上文所述的药理活性化合物或酶。例如，效应基因可编码配体-酶融合蛋白，酶可将药物前体裂解成药物，配体可与细胞表面结合，优选与内皮细胞或肿瘤细胞的表面结合。
图1表示本发明的核酸构建体。1)鉴定p163蛋白和编码p163蛋白的核酸序列使用“双杂合体(two-hybrid)技术”(Fields和Song，自然，340，245(1989))发现p163蛋白是一种新的p27配偶体蛋白，为此，使用PCR将鼠p27蛋白的完整编码序列和转录因子GAL4的DNA结合域符合读框地克隆至酵母载体pGBT10(Clontech)中。用此载体转化酵母菌株Hf7c(Clontech Heidelberg，Matchmaker Two Hybrid，K1605-1)，然后分离色氨酸营养缺陷型菌落，在使用针对GAL4和p27的特异性抗体的Western印迹中检测正确融合蛋白的表达。
在第二次转化中，使用得自小鼠胚的经VP16标记的cDNA文库(Vojtek等，细胞，74，205(1993))转化此菌株。对在15nM氨基三唑存在下表现为组氨酸营养缺陷型的400个菌落进行进一步的分析，对这些克隆中的70个测序；它们都编码不同的D-型细胞周期蛋白；已知它们是与p27相互作用的配偶体。使用Southern印迹显示出400个抗性克隆中有390个编码D细胞周期蛋白。其余克隆中有两个(第163号)编码相同的蛋白质对它们进行完整地测序。
由Balb/c-3T3细胞制备λZAP cDNA文库，得自该文库的几个克隆被鉴定为与p163同源。序列分析显示出开放阅读框；该阅读框也被用于得自cDNA文库的VP16嵌合体。两个原始克隆都编码此阅读框的氨基酸121-252。在使用β-半乳糖苷酶作为报道基因的酵母中更详细地鉴定了克隆p163如表1所示，酵母中编码的蛋白质特异性地与p27相互作用，而不与如Myc，Max，Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白质相互作用。表1也显示了p27中与p163发生相互作用的区域的第一处定界。这些数据表明p163和依赖于细胞周期蛋白的激酶(Russo等，自然，382，325(1996))一样与p27的相同区域结合。这暗示了p163和依赖于细胞周期蛋白的激酶竞争同p27的结合。其次，可将p163中与p27相互作用的区域划定为氨基酸121-252。
为了证实得自所述酵母检测系统的这些结果，将重组表达的p163[与谷胱甘肽转移酶(GST)一起表达成融合蛋白]结合到柱上，然后通过在此柱上进行亲和层析试着纯化35S-标记的p27蛋白。含有p163以及谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白的应用使得在这些实验中利用均一的基质成为可能(所谓的GST pulldowns；Hateboer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，8489(1993))。
为了进行这些研究，将得自酵母克隆的阅读框转移至pGEX载体(Pharmacia，Freiburg pGEX-2T；Cat.No.27-4801-01)中，所述载体编码与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的嵌合蛋白，该嵌合蛋白受大肠杆菌的IPTG-诱导的TAC启动子控制(Smith和Johnson，基因，6731，1988)。通过在谷胱甘肽-琼脂糖上进行亲和层析(Smith和Johnson，1988)从经诱导的大肠杆菌培养物中纯化嵌合蛋白，然后对100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，20mM EDTA，10％甘油，0.1mM PMSF透析嵌合蛋白。根据相同方案纯化谷胱甘肽S-转移酶，然后进行透析以作为对照；将纯化的蛋白质储存于-80℃。
然后于4℃下将10μg两种蛋白质各与10μg BSA和20mg膨胀的GST-琼脂糖一起保温2小时；之后离心分离出琼脂糖，用透析缓冲液将琼脂糖洗涤两次。将琼脂糖的等分试样直接煮沸于样品缓冲液中以作为蛋白质结合的对照，SDS凝胶电泳后检测结合的蛋白质。通过体外翻译制备35S-甲硫氨酸-标记的p27(根据厂商的说明Promega，Mannheim；TNT coupled retc.lys.systems；L4610)，于4℃下将所述经标记的p27与上样的琼脂糖一起在总体积为200μl的含有0.1％NP-40的透析缓冲液中保温2小时。用透析缓冲液/0.1％NP-40将琼脂糖洗涤4次，然后在SDS样品缓冲液中煮沸。通过SDS凝胶电泳和荧光显影检测结合的蛋白质。
这些实验的结果示于表2。表2表明重组的、体外合成的35S-标记的p27选择性地与用嵌合的GST-p163融合蛋白上样的柱结合，而不与用相同量的GST上样的柱结合。表2也表明得自细胞提取物的p27不能有效地与GST-p163结合；在此提取物中，p27与依赖于细胞周期蛋白的激酶的复合物结合。稍作加热处理可从这些复合物中释放出p27，从而使之与p163结合。这表明p163和依赖于细胞周期蛋白的激酶竞争与p27的结合。
本发明的编码鼠p163蛋白的核酸序列示于表3。数据库中有此序列的同系物；该同系物是酵母核蛋白(Nup)2基因。Nup2是核膜蛋白质，该蛋白质参与核蛋白的形成和蛋白质进出核的转运。在酵母中，Nup2可能特别地参与输出。
尽管从整体上看同源性并不高，但几个功能域是保守的(表4)。例如，Ran-结合蛋白(RBP-1)，NuP-2和p163之间与调节核转运的调节蛋白(Ran，一种GTP-结合蛋白)结合的位点是保守的(表5)，结构功能已定的短五肽序列也是保守的(表6)。
为了毫无疑问地阐明p163就是核孔蛋白，产生了针对蛋白质[组氨酸-p163(氨基酸121-252)]的多克隆抗血清，然后进行亲和纯化；从免疫荧光下典型的核孔染色(核表面和外周的点被染色)结果看，此抗血清毫无疑问地识别了核孔蛋白。
为了阐明p163或Nup2和p27在细胞内结合，使用CMV表达载体在HeLa细胞中瞬时表达两种蛋白质；48小时后，裂解细胞并通过免疫沉淀/Western印迹检查可能存在的两种蛋白质的相互作用(Peukert等，EMBO J，16，5672(1997))。在每种情况下使用针对Nup2的多克隆抗体和针对鼠p27的多克隆抗体可阐明p27和Nup2之间的结合。仅当p163被表达时p27蛋白才能沉淀良好(见表7)。这证明在HeLa细胞中Nup2和p27能在体内互相结合。
通过使用人EST进行序列比较和序列检索鉴定出人p163蛋白的核酸序列。其中Ran-结合域位于序列AA161285中的第173≥575位，p27-结合域位于序列R62312的第318≥486位，p163的其它组成区段位于序列THC199124的第348≥489位。
为了更精确地限定与Nup2-p163相互作用的p27氨基酸，在酵母中寻找不再与p163相互作用的突变体。为此，对编码p27的cDNA进行诱导错误的PCR反应(PCR的条件描述于“PCR-技术，DNA扩增的原理和应用”；H.A.Erlich，Stockton出版社，纽约1989)，检测含有随机错误的所得克隆与Nup2的相互作用，检测所述克隆与细胞周期蛋白D1的相互作用以作为对照。该PCR的条件(不同于标准条件)是在1U GIBCO Taq聚合酶和0.1mM MnCl2存在下进行40个循环。
将所得cDNA片断与已被BamHI和EcoRI线性化然后经纯化的pGBT10载体一起共转化至酵母菌株HF7c-p163/Nup2中。通过从缺少-Leu-Trp的培养基中选择筛选出经转化的菌落。分离出960个独立的克隆，将它们平铺在选择培养基上(-Leu-His-Trp)。对在此选择培养基上不生长的克隆进行第二个相互作用试验，即β-半乳糖苷试验。
鉴定阴性克隆，从中分离出pGBT10-p27质粒。首先，所得质粒与将p163/Nup2表达成含有反式激活域的嵌合体的酵母表达质粒一起被重新转化，然后所得质粒与将细胞周期蛋白D1表达成含有反式激活域的嵌合体的质粒一起被重新转化以作为对照。如此产生了3个克隆，所述克隆不再选择性地与Nup2相互作用，但与细胞周期蛋白D1相互作用。与几个对照一起测定这些质粒的序列。
所得表型的范围简述于表13。在这些实验中，当在缺乏组氨酸(-Trp-Leu-His，“选择性的”)的条件下生长时，相互作用证实了其自身，而对照(-Trp-Leu；“非选择性的”)显示出两种蛋白质都可在酵母中表达。发现1000个克隆中有3个不再特异性地与p163-Nup2相互作用，但与细胞周期蛋白D1相互作用。这些序列示于表14。所有3个克隆，而不是一系列对照克隆在氨基酸的精氨酸90处携带相同的突变(突变成甘氨酸)。序列也表明克隆是独立形成的，因为它们携有额外的，不同的突变。这清楚地将精氨酸90鉴定为p27与Nup2相互作用的主要氨基酸。可用此突变体证实这种相互作用的生物学关联。2)p163蛋白的显性失活类似物的核苷酸序列上述功能分析揭示了p163蛋白的两个区域对于其功能是至关重要的。
其中一个区域是结合p27的区域(氨基酸121-252)，另一个是结合Ran的区域(氨基酸307-467)，Ran是调节转运功能的GTP-结合蛋白。
因此，本发明涉及蛋白质p163的核酸序列或此蛋白质的一部分的核酸序列，这些核酸序列在p27结合域和/或Ran结合域表现出突变，以使所表达的突变蛋白质与p27或Ran的结合大幅度地减少。当导入细胞时，p163的这些类似物抑制功能细胞-特异性的p163。这会产生游离的p27，导致细胞分裂被抑制。p163的这种显性失活突变体的例子示于表8和9。表8显示出其中缺失了p27-结合域的p163，而表9显示出缺乏Ran-结合域的p163。
因此，本发明涉及将编码显性失活的p163类似物的核酸构建体导入细胞，目的是抑制此细胞的增殖。导入细胞的过程可在体外进行，也可在体内进行。
为了确保本发明核酸构建体的表达是最可能的，和/或确保所述表达受到控制，优选使所述构建体与激活序列连接。这种激活序列的例子列于8.3节。为了确保编码p163的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信号(NLS)。本领域技术人员已知这种NLS。
使用本领域技术人员已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒载体，或借助于并插入病毒载体将核酸构建体导入细胞。3)与p163结合域结合的蛋白质或肽的核苷酸序列已描述的研究成果将p163蛋白的p27-结合域确定为氨基酸121-252，将Ran-结合域确定为氨基酸307-467。
因此，本发明涉及编码肽的核酸构建体，所述肽或与p163中的p27结合域结合从而抑制p163与p27的结合，或与p163中的Ran结合域结合从而抑制p163与Ran的结合。这种抑制导致游离的p27的形成，p27通过例如与细胞周期蛋白E/cdk2结合来抑制细胞增殖。这种抑制性肽的例子是对应于p27蛋白(氨基酸69-178)或Ran的p163-结合域的氨基酸序列。
另一类例子是与p163结合，特别是与p163的p27-结合域或Ran-结合位点结合的抗体或抗体片段，如F(ab)2，Fab，Fv或s.c.Fv。通过例如用p163或p163的p27-结合域或Ran-结合域免疫动物可产生这种抗体。所述结合域示于表5(Ran-结合域)和表10(p27-结合域)。
因此，本发明涉及将编码与p163结合的蛋白质的核酸构建体导入细胞，目的是抑制所述细胞的增殖。导入细胞可在体外或体内发生。
为了确保本发明核酸构建体的表达是最可能的，和/或确保所述表达受到控制，优选使所述构建体与激活序列连接。这种激活序列的例子列于8.3节。为了确保编码本发明核酸构建体的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信号(NLS)。本领域技术人员已知这种NLS。
使用本领域技术人员已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒载体，或借助于并插入病毒载体将核酸构建体导入细胞。4)刺激细胞分裂的p163的核苷酸序列将p163的核苷酸序列或p163蛋白导入细胞可抑制细胞内的p27。这可释放细胞周期蛋白E/cdk2复合物(受p27抑制)，所述复合物可启动细胞分裂。
因此，本发明涉及将编码p163的核酸构建体导入细胞，目的是促进细胞的增殖。导入细胞可在体外或体内发生。
为了确保本发明核酸构建体的表达是最可能的，和/或确保所述表达受到控制，优选使所述构建体与激活序列连接。这种激活序列的例子列于8.3节。为了确保编码p163的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信号(NLS)。本领域技术人员已知这种NLS。
使用本领域技术人员已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒载体，或借助于并插入病毒载体将核酸构建体导入细胞。
例如，当细胞增殖有缺陷时，导入编码p163的核酸构建体可刺激细胞培养物中的细胞或体内细胞增殖。5)抑制p163蛋白转录和/或翻译的核苷酸序列有关p163蛋白核酸序列的知识提供了制备可用于特异性抑制p163转录或翻译的寡核苷酸的可能性。这些反义核酸包括寡核苷酸，反义(三链体)DNA，核酶和反义RNA。制备三链体DNA寡核苷酸的方法详细描述于Frank-Kamenetskii和Mirkin，Ann.Rev.Biochem，64，65(1995)，制备反义RNA寡核苷酸的方法详细描述于Neckers等，Crit.Rev.Oncogen，3，175(1992)；Carter和Lemoine，Br.J.Cancer，67，869(1993)；Mukhdopadhyay和Roth，Crit.Rev.Oncogen，7，151(1996)和Mercola和Cohen，癌症基因疗法，2，47(1995)。
本发明中优选使用能与p163核苷酸序列杂交的三链体DNA或反义RNA寡核苷酸，所述核苷酸序列编码p27蛋白-结合域(总区域，氨基酸121-252)的组成区域或Ran蛋白-结合域(总区域，氨基酸307-467)组成区域。
抑制p163转录和/或翻译的核苷酸序列还包括特异于p163蛋白核苷酸序列区域的核酶。
制备核酶的方法详细描述于Burke，核酸分子生物学，8，105(1994)，Christoffersen和Marr，药物化学杂志，38，2023(1995)和Scott等，科学，274，2065(1996)。本发明优选与p163核苷酸序列杂交的核酶，所述核苷酸序列位于p27蛋白-结合域(氨基酸121-252)或Ran蛋白-结合域(氨基酸307-467)的核苷酸序列的区域。
能被核酶裂解的p163蛋白核苷酸序列的例子列于表11。
将寡核苷酸形式的三链体DNA，反义RNA或核酶[使用本领域技术人员已知的方法(见上述文献)制备并保护以防DNA酶或RNA酶降解]或者在体外加入靶细胞，或者通过注射或局部应用而进行体内施用。
然而，本发明也涉及将核酸构建体导入细胞，目的是通过转录在细胞中形成对应于本发明寡核苷酸的反义RNA或核酶，从而抑制所述细胞的增殖。导入细胞可在体外或体内发生。
为了确保本发明核酸构建体的表达是最可能的，和/或确保所述表达受到控制，优选使所述构建体与激活序列连接。这种激活序列的例子列于8.3节。
使用本领域技术人员已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒载体，或借助于并插入病毒载体将核酸构建体导入细胞。6)筛查p163功能抑制剂的检测系统有关p163蛋白及其与p27蛋白的相互作用的发现使筛查所述相互作用的抑制剂成为可能。这需要检测系统，该检测系统中p27蛋白和p163蛋白之间的结合被抑制，这种抑制的出现由指示剂显示。
大量方法是已知的，一个所述方法的例子是双杂合体筛选试验(有关内容见C.1节和表1)。
然而也可以使用例如亲和系统来筛选，在该系统中，p163[优选为p27-结合域(氨基酸121-252)]与固相结合并与检测物质一起保温，通过对p163蛋白中p27-结合域的经标记的结合配偶体的结合的抑制作用可确定检测物质的结合。所述经标记的结合配偶体可以是p27或特异性地结合p163蛋白的p27-结合域的抗体。
可以按照与组建检测p163和p27之间结合的抑制剂的系统相同的方式，组建检测p163和Ran之间结合的抑制剂的系统，并将该检测系统用于筛选。因此，本发明涉及编码p163或p163的组成蛋白的核酸序列用于筛选p163抑制剂的用途，或p163蛋白或其组成蛋白用于筛选p163抑制剂的用途。7)p163的核酸序列或p163的蛋白质序列用于诊断细胞增殖时期或疾病状况的用途如导言A)节中所述，很多肿瘤的特征在于p27的胞内浓度增加。由于这些肿瘤在增殖，可假定这种浓度增加的p27的功能受到抑制。根据本发明，p163是p27的特异性抑制剂。在细胞中检测这种抑制剂使得对细胞的增殖状况得出结论成为可能。这种结论对于例如评估肿瘤细胞或肿瘤组织的恶性非常重要。通过细胞死亡可释放p163蛋白。因此，在体液中检测到p163即可对体内的增殖过程和/或伴随细胞死亡的过程，如炎症过程有一定论。通过与经标记物质的特异性结合可检测到p163蛋白。所述特异性结合的物质包括p27蛋白，Ran蛋白和例如通过用p163蛋白或用p163蛋白的组成序列免疫动物产生的抗体。
然而，通过使编码p163蛋白的核酸序列与相应的mRNA杂交也可检测到细胞或组织中的p163 mRNA。可以使用本领域技术人员熟知的聚合酶链反应(PCR)技术，其中使用所谓的引物对可复制欲检测的几拷贝核酸序列，从而增加了检测的敏感性。
用于扩增和检测编码p163的核酸序列的引物对的例子示于表12a，b和c。
然而，也可以通过例如使用Gussoni等，Nature Biotechnol，14，1012(1996)所述的荧光原位杂交法来检测编码p163的RNA。
因此，本发明涉及检测编码p163的核酸序列或检测p163蛋白以确定细胞或组织的增殖状况或检测活的哺乳动物中的增殖变化，或伴随细胞死亡的变化。8)由p163，p27或p163/p27复合物控制的表达系统的区别性特征8.1.组分b)8.1.1.p163，p27或p163/p27蛋白复合物的结合序列[组分b2)]在本发明一个优选的实施方案中，表达系统的组分b2)含有与p27蛋白结合的p163蛋白或p163蛋白的一部分的至少一种核酸序列。
在另一个优选的实施方案中，表达系统的组分b2)含有抗体或抗体的一部分的至少一种核酸序列，所述抗体或其一部分含有结合序列(VH和VL)，所述结合序列针对的位点是—p27蛋白中与p163蛋白结合的位点，或—p163蛋白中与p27蛋白结合的位点。
例如，在这些实施方案中，细胞中存在的游离的p27蛋白或游离的p163蛋白可结合组分b2)的表达产物，从而抑制由组分b)编码的转录因子，结果阻断了表达系统。但是，如果p27蛋白在细胞中例如与p163蛋白复合，那么组分b2)的表达产物可保持游离状态，进而转录因子[组分b)]也可保持游离状态，表达系统就能发挥作用。
因此，本发明的这些表达系统能够在处于分裂的细胞中起作用(存在p163/p27复合物)，而在静息细胞中被抑制(游离的p27)。
在另一个具体的实施方案中，带有组分b2)的表达系统含有抗体或抗体的一部分的至少一种核酸序列，所述抗体或其一部分含有由p27和p163组成的复合物的结合序列(VH和VL)。在此实施方案中，p27和p163的复合物与组分b2)的表达产物结合，从而阻断表达系统，而游离的p27或p163不与组分b2)的表达产物结合。
因此，本发明的该表达系统在处于分裂的细胞中被阻断(存在p163/p27复合物)，而在静息细胞中能发挥作用(游离的p27)。
当选择组分b2)的抗体时，优选利用抗体的表位结合部分，即FVL和FVH，如果抗体来源于鼠，则使之人源化。人源化的方式如Winter等人(自然，349，293(1991)和Hoogenbooms等人(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993))所述。根据现有技术，如Winter等，自然，349，293(1991)，Hoogenbooms等，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993)，Girol.Mol.Immunol，28，1379(1991)或Huston等，Int.Rev.Immunol，10，195(1993)所述的方法可制备抗体片段。抗体，抗体片段和重组抗体片段的制备详细描述于专利申请DE 9649 645.4中。
可直接由现有的杂交瘤制备重组的抗体片段，也可以借助于噬菌体展示技术(Winter等，Annu.Rev.Immunol，12，433(1994))，从鼠或人抗体片段文库中分离重组的抗体片段。然后在基因水平上直接将这些抗体片段用于与组分b1)和b3)偶联。
为了由杂交瘤制备重组的抗体片段，通过分离mRNA、将RNA逆转录为cDNA、然后通过聚合酶链反应并使用分别与可变片段的5’和3’末端互补的寡核苷酸进行扩增可分离出编码抗体的抗原结合域(VH，VL)的遗传信息。然后将所得的编码VH和VL片段的DNA片段克隆至细菌表达载体；例如，可用此方法表达Fv片段，单链Fv片段(scFv)或Fab片段。
使用噬菌体展示技术也可直接从鼠或人源的抗体文库(免疫文库或首次用于实验的文库)中分离新的抗体片段。在抗体片段的噬菌体展示中，抗原结合域以scFV片段基因的形式或作为Fab片段基因，作为与丝状噬菌体的g3P外被蛋白的基因的融合蛋白，被克隆至噬菌体基因组或噬粒载体中。在荷载有抗原的塑料容器中(淘选)，在缀合了抗原的顺磁珠上或通过与细胞表面结合来选择与抗原结合的噬菌体。
通过PCR扩增经免疫动物或病人的B淋巴细胞中的可变抗体片段的基因可制备免疫文库。为此使用了特异于鼠或人免疫球蛋白或特异于人免疫球蛋白基因家族的寡核苷酸的组合。
通过使用未经免疫的供体作为免疫球蛋白基因的来源可制备首次用于实验的文库。或者，可使用免疫球蛋白种系基因来制备半合成的抗体所有组成成分，通过使用简并引物的PCR扩增可变片段的互补决定区3。与免疫文库相比，这些所谓的单箱(single-pot)文库的有利之处在于可从单个文库中分离出针对大量抗原的抗体片段。
通过噬菌体展示技术可进一步增加抗体片段的亲和性，其中利用随机的，基于密码子的或定点的诱变，通过用得自原初所有组成成分的片段改组各个区域的链或通过使用细菌突变菌株可由现存的抗体片段制备新的文库，在严格条件下通过重新选择来分离具有改良特性的抗体片段。另外，通过用人的所有组成成分逐步取代其中一个可变区，随后使用原始抗原选择(被引导的选择)可使鼠抗体片段人源化。或者，通过有目的地用原始鼠抗体的相应区域取代人抗体的高变区也可实现鼠抗体的人源化。8.1.2.激活域[组分b1)]和DNA结合域[组分b3)]在本发明中，转录因子激活域和DNA结合域的所有可利用的基因都可用于组分b)。其描述不会限制本发明的这些区域的例子是—激活域[组分b1)]·HSV1-VP16的酸反式激活域(TAD)(氨基酸406-488；Triezen-berg等，Genes Developm，2718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm，5190(1995)或氨基酸413-490；Regier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，883(1993))的cDNA的至少一种序列，或·Oct-2的激活域(氨基酸438-479；Tanaka等，分子细胞生物学，146046(1994)或氨基酸3-154；Das等，自然，374657(1995))的至少一种序列，或·SP1的激活域(氨基酸340-485；Courey和Tijan，细胞，55，
887(1988))的至少一种序列，或·NFY的激活域(氨基酸1-233；Li等，生物化学杂志，267，8984(1992)；van Hujisduijnen等，EMBO J，9，3119(1990)；Sinha等，生物化学杂志，92，1624(1995)；Coustry等，生物化学杂志，270，468(1995))的至少一种序列，或·ITF2的激活域(氨基酸2-452；Seipel等，EMBO J，13，4961(1992))的至少一种序列，或·c-Myc的激活域(氨基酸1-262；Eilers等)的至少一种序列，或·CTF的激活域(氨基酸399-499；Mermod等，细胞，58，741(1989)；Das和Herr，自然，374，657(1995))的至少一种序列。
—DNA结合域[组分b3)]·Gal4蛋白的DNA结合域(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，102916(1990))的cDNA的至少一种序列，或·LexA蛋白(氨基酸1-81；Kim等，科学，255203(1992))或整个LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，细胞，43729(1985))的至少一种序列，或·lac阻抑(lacI)蛋白(Brown等，细胞，49603(1987)；Fuerst等，PNAS USA 862549(1989))的至少一种序列，或·四环素阻抑(tetR)蛋白(Gossen等，PNAS USA 895547(1992)；Dingermann等，EMBO J，111487(1992))的至少一种序列，或·ZFHD1蛋白(Pomerantz等，科学，26793(1995))的至少一种序列。
本发明中，在DNA结合域的3’末端加入核定位信号(NLS)是有利的。8.2.可被组分b)激活的启动子单位II[组分c)]激活序列此激活序列的选择取决于转录因子基因[组分b)]中DNA结合域[组分b3)]的选择。
例如，针对8.1.2.中所列的DNA结合域的例子依次存在下列可能性8.2.1.可能性A)—激活序列含有至少一种与Gal4蛋白(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10，2916(1990))结合的序列[核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTGAC CG-3’，SEQ ID NO1]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本启动子(核酸48-5191；Tooze(编辑)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或·c-fos的启动子(Das等，自然，374，657(1995))或·U2 sn RNA启动子或·HSV TK的启动子(Papavassiliou等，生物化学杂志，265，9402(1990)；Park等，Molec.Endocrinol，7，319(1993))。8.2.2.可能性B)—激活序列·含有至少一种与LexA蛋白(LexA操纵基因；Brent等，自然，612，312(1984))结合的序列[核苷酸序列5’-TACTGTATGTACATACAGTA-3’，SEQ ID NO2]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本启动子(核酸48-5191；Tooze(编辑)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或另一种启动子(见可能性A)8.2.3.可能性C)—激活序列
·含有至少一种与lacI阻抑蛋白(Fuerst等，PNAS USA862549(1989)；Simons等，PNAS USA811624(1984))结合的Lac操纵基因序列[核苷酸序列5’-GAATTGTGAGCGCTCACAAT TC-3’，SEQ ID NO3]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本启动子(核酸48-5191；Tooze(编辑)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或另一种启动子(见可能性A)8.2.4.可能性D)—激活序列·含有至少一种与四环素阻抑(tetR)蛋白结合的四环素操纵基因(tetO)序列[核苷酸序列5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’，SEQ ID NO4]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本启动子(核酸48-5191；Tooze(编辑)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或另一种启动子(见可能性A)8.2.5.可能性E)—激活序列·含有至少一种与ZFHD-1蛋白(Pomerantz等，科学，267，93(1995))结合的序列[核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’，SEQ ID NO5]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本启动子(核酸48-5191；Tooze(编辑)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约；冷泉港实验室))或另一种启动子(见可能性A)8.3.激活序列I[组分a)]本发明中用作激活序列的核苷酸序列在结合转录因子之后可激活位于3’末端附近的基因的转录。激活序列的选择取决于需治疗的疾病和需转导的靶细胞。因此，能以非限制性的方式，靶细胞特异性地，在特殊的代谢条件下，细胞周期特异性地或病毒特异性地激活激活序列[组分a)]。这些启动子序列已详细描述于专利申请EP95930524.4，EP95931933.6，EP95931204.2，EP95931205.9，EP97101507.8，EP97102547.3，DE196.39103.2和DE196.51443.6。可选择的启动子序列的例子是8.3.1.能以非限制性的方式被激活的激活序列和启动子如—RNA聚合酶III的启动子—RNA聚合酶II的启动子—CMV启动子和增强子—SV40启动子8.3.2.病毒启动子和激活序列如—HBV—HCV—HSV—HPV—EBV—HTLV—HIV当使用HIV启动子时，包括TAR序列[第-453至-80位，Rosen等，细胞，41，813(1985)]的整个LTR序列被用作病毒特异性的启动子。8.3.3.可经代谢激活的启动子和增强子序列，如可被缺氧诱导的增强子。8.3.4.可被细胞周期特异性激活的启动子这些启动子的例子是cdc25C基因，细胞周期蛋白A基因，cdc2基因，B-myb基因，DHFR基因，E2F-1基因或cdc25B基因的启动子，或者是结合转录因子的序列。所述序列在细胞增殖过程中似乎或确实被激活。这些结合序列包括例如结合c-myc蛋白的序列。这些结合序列也包括被称为MycE盒的核苷酸序列[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’，SEQ ID NO6；Blackwood和Eisenmann，科学，2511211(1991)]的单体或多体。8.3.5.可被四环素激活的启动子，如与相应阻抑蛋白联合的四环素操纵基因8.3.6.嵌合启动子嵌合启动子是可被细胞特异性地，代谢特异性地或病毒特异性地激活的上游激活序列与含有核苷酸序列CDE-CHR或E2FBS-CHR的下游启动子组件的联合，抑制蛋白与之结合从而可在细胞周期的G0和G1相抑制上游激活序列的激活(PCT/GB9417366.3；Lucibello等，EMBO J，14，12(1994))。8.3.7.可被细胞特异性激活的启动子优选这些启动子包括这样的启动子或激活序列，它们由得自编码优先在选定细胞中形成的蛋白质的那些基因的启动子或增强子组成。
例如，本发明中优选在下列细胞中使用下列蛋白质的启动子8.3.7.1.在内皮细胞中被激活的启动子和激活序列—脑特异性的，内皮葡萄糖-1-转运蛋白—Endoglin—VEGF受体1(flt-1)—VEGF受体2(flk-1，KDR)—tie-1或tie-2—B61受体(Eck受体)—B61—内皮肽，尤其是内皮肽B或内皮肽1—内皮肽受体，尤其是内皮肽B受体—甘露糖6-磷酸受体—von Willebrand因子—IL-1α和IL-1β—IL-1受体
—血管细胞粘附分子(VCAM-1)—合成的激活序列。
也可使用合成的激活序列作为天然的内皮细胞特异性启动子的替代物，所述激活序列由用于结合转录因子的寡聚化位点组成，所述转录因子优先或选择性地在内皮细胞中具有活性。一个例子是转录因子GATA-2，内皮肽1基因中转录因子的结合位点是5’-TTATCT-3’[Lee等，生物化学，266，16188(1991)，Dormann等，生物化学杂志，267，1279(1992)和Wilson等，分子细胞生物学，10，4854(1990)]。8.3.7.2.在经激活的内皮细胞附近的细胞中被激活的启动子或激活序列—VEGFVEGF基因的基因-调节序列是5’-侧翼区，3’-侧翼区，c-Src基因或v-Src基因—类固醇激素受体及其启动子元件(Truss和Beato，Endocr.Rev，14，459(1993))，尤其是小鼠乳腺肿瘤病毒启动子8.3.7.3.在肌细胞，尤其是平滑肌细胞中被激活的启动子或激活序列—原肌球蛋白—α-肌动蛋白—α-肌球蛋白—PDGF的受体—FGF的受体—MRF-4—果糖磷酸激酶A—磷酸甘油酸变位酶—肌钙蛋白C—肌细胞生成素—内皮肽A的受体—结蛋白—VEGFVEGF基因的基因-调节序列已列于“在经激活的内皮细胞附近的细胞中被激活的启动子”一节(见上文)—“人工”启动子螺旋-环-螺旋(HLH)家族(MyoD，Myf-5，肌细胞生成素，MRF4)的因子被描述成肌肉-特异性的转录因子。肌肉-特异性的转录因子还包括锌指蛋白GATA-4。不仅肌肉-特异性基因的启动子可使HLH蛋白和GATA-4表现出肌肉特异性转录，在异源前后序列(context)中也能使HLH蛋白和GATA-4表现出肌肉特异性转录，人工启动子同样也能做到这一点。具有此特性的人工启动子的例子是多拷贝的结合肌肉特异性HLH蛋白，如E盒(MyoD)的(DNA)位点(如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC，SEQ IDNO7)或多拷贝的结合α-肌球蛋白重链基因的GATA-4的DNA位点(如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’，SEQ ID NO8)。8.3.7.4.在胶质细胞中被激活的启动子和激活序列这些启动子和激活序列尤其包括例如编码下列蛋白质的基因的基因-调节序列或元件—Schwann细胞-特异性蛋白质periaxin—谷氨酰胺合成酶—胶质细胞特异性蛋白质(胶质原纤维酸性蛋白质＝GFAP)—胶质细胞蛋白质S100b—IL-6(CNTF)—5-HT受体—TNFα—IL-10—胰岛素样生长因子受体I和II—VEGF上文已列出VEGF基因的基因-调节序列。8.3.7.5在造血细胞中被激活的启动子和激活序列具有这种特性的基因-调节序列包括在造血细胞或其邻近细胞，如基质中表达的细胞因子或其受体的基因的启动子序列。
它们包括下列细胞因子及其受体的启动子序列，例如—干细胞生长因子受体—干细胞生长因子—IL-1α—IL-1受体—IL-3—IL-3受体(α-亚单位)—IL-3受体(β-亚单位)—IL-6—IL-6受体—GM-CSF—GM-CSF受体(α-链)—干扰素调节因子1(IRF-1)IL-6和IFNγ或IFNβ可等效地激活IRF-1的启动子。
—促红细胞生成素—促红细胞生成素受体。8.3.7.6.在淋巴细胞和/或巨噬细胞中被激活的启动子和激活序列所述启动子和激活序列包括例如细胞因子，细胞因子受体和粘附分子和抗体Fc片断的受体的基因的启动子和激活序列。
例如—IL-1受体—IL-1α—IL-1β—IL-2—IL-2受体—IL-3—IL-3受体(α-亚单位)—IL-3受体(β-亚单位)
—IL-4—IL-4受体—IL-5—IL-6—IL-6受体—干扰素调节因子1(IRF-1)(IL-6和IFNγ或IFNβ可等效地激活IRF-1启动子)。
—IFNγ-反应性启动子—IL-7—IL-8—IL-10—IL-11—IFNγ—GM-CSF—GM-CSF受体(α-链)—IL-13—LIF—巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体—I和II型巨噬细胞清除剂受体—MAC-1(白细胞功能抗原)—LFA-1α(白细胞功能抗原)—p150，95(白细胞功能抗原)8.3.7.7.在滑膜细胞中被激活的启动子和激活序列所述启动子和激活序列包括基质金属蛋白酶(MMP)的启动子序列，例如下列MMP的启动子序列—MMP-1(间质胶原酶)—MMP-3(溶基质素/transin)另外还包括金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的启动子序列，例如—TIMP-1
—TIMP-2—TIMP-38.3.7.8.在白血病细胞中被激活的启动子和激活序列所述启动子和激活序列包括例如下列蛋白质的启动子—c-myc—HSP-70—bcl-1/细胞周期蛋白D-1—bcl-2—IL-6—IL-10—TNFα，TNFβ—HOX-11—BCR-Abl—E2A-PBX-1—PML-RARA(前髓细胞白血病-视黄酸受体)—c-myc—c-myc蛋白结合并激活被称为MycE盒的核苷酸序列多体(5’-GGAAGCAGA CCACGTGGTCTGCTTCC-3’，SEQ ID NO6)。8.3.7.9在肿瘤细胞中被激活的启动子或激活序列与在肿瘤细胞中形成或在肿瘤细胞中具有活性的转录因子相互作用的基因-调节核苷酸序列被设想为启动子或激活序列。
本发明中优选的启动子或激活序列包括编码特别地在癌细胞或肉瘤细胞中形成的蛋白质的基因的基因-调节序列或元件。因此，对于小-细胞支气管癌优选使用N-CAM蛋白的启动子，对于卵巢癌优选使用“肝炎生长因子”受体的启动子或L-丝束蛋白的启动子，对于胰腺癌优选使用L-丝束蛋白的启动子或多形上皮粘蛋白(PEM)的启动子。8.4.效应基因[组分d)]本发明中的效应基因[组分d)]编码可用于预防和/或治疗疾病的活性化合物。效应基因和启动子序列的选择取决于疾病治疗的性质并要考虑需转导的靶细胞。
例如，对于下列疾病可选择下列启动子序列和效应基因的联合(详细描述见列入本文作参考文献的专利申请EP 95930524.4，EP95931933.6，EP 95931204.2，EP 95931205.9，EP 97101507.8，D196.17851.7，D196.39103.2和D196.51443.6)。8.4.1.肿瘤的疗法1.1.靶细胞—处于增殖中的内皮细胞或—与内皮细胞相邻的基质细胞和肌肉细胞，或—肿瘤细胞或白血病细胞1.2.启动子—内皮细胞-特异性和细胞周期-特异性，或—细胞-非特异性或肌肉细胞-特异性和细胞周期-特异性，或—肿瘤细胞-特异性(实体肿瘤，白血病)和细胞周期-特异性1.3.细胞增殖抑制剂的效应基因，例如下列抑制剂的效应基因—成视网膜细胞瘤蛋白(pRb＝p110)或相关的p107和p130蛋白通过磷酸化可使成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)和相关的p107和p130蛋白失活。优选使用这些细胞周期抑制剂的基因，所述基因在被表达的蛋白质的灭活位点表现出突变，而后者的功能未受损伤。已描述了p110中这些突变的例子。以类似的方式突变p107蛋白或p130蛋白的DNA序列。
—p53蛋白或者通过与特殊的蛋白质，如MDM2结合，或者通过利用去磷酸化的C-末端丝氨酸使p53寡聚化能使p53在细胞中被灭活。因此优选使用通过丝氨酸392使C-末端被截短的p53蛋白的DNA序列。
—p21(WAF-1)—p16蛋白—其它cdk抑制剂—GADD45蛋白
—bak蛋白—结合调节蛋白质的蛋白质(见II.1.)1.4.凝固诱导因子和血管生成抑制剂的效应基因，例如—纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)—PAI-2—PAI-3—制管张素—干扰素(IFNα，IFNβ或IFNγ)—血小板因子4—TIMP-1—TIMP-2—TIMP-3—白血病抑制因子(LIF)—组织因子(TF)及其凝结-活性片断1.5.细胞静止和细胞毒性蛋白的效应基因，例如—穿孔素—粒酶—IL-2—IL-4—IL-12—干扰素，如IFNα，IFNβ或IFNγ—TNF，如TNFα或TNFβ—制癌蛋白M—鞘磷脂酶—爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物1.6.细胞静止或细胞毒性抗体的效应基因以及在抗原结合抗体片段和细胞静止，细胞毒性或炎性蛋白或酶之间形成的融合蛋白的效应基因—细胞静止或细胞毒性抗体包括例如Burrows等人(Pharmac.Ther，64，155(1994))，Hughes等人(癌症研究，49，6214(1989))和Maruyama等人(PNAS USA，87，5744(1990))所述的针对内皮细胞膜结构的那些抗体。所述抗体特别地包括针对VEGF受体的抗体。
—所述抗体还包括针对肿瘤细胞上的膜结构的细胞静止或细胞毒性抗体。这种性质的抗体已描述于例如Sedlacek等，Contrib.toOncol，32，Karger Verlag，Munich(1998)和Contrib.to Oncol，43，Karger Verlag，Munich(1992)。其它例子是针对下列物质的抗体路易斯唾液酸；肿瘤上由T细胞识别的肽；癌基因表达的蛋白质；神经节苷脂，如GD3，GD2，GM2，9-0-乙酰基GD3，岩藻糖基GM1；血型抗原及其前体；多形上皮细胞粘蛋白上的抗原；热激蛋白的抗原。
—所述抗体还包括针对白血病细胞膜结构的抗体。已描述了大量这种性质的单克隆抗体在诊断和治疗方法中的应用(例见Kristensen，Danish Medical Bulletin，41，52(1994)；Schranz，TherapiaHungarica，38，3(1990)；Drexler等，Leuk.Res，10，279(1986)；Naeim，Dis.Markers，7，1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol，4，847(1992)；Drexler等，Blut57，327(1988)；Freedman等，Cancer Invest，9，69(1991))。根据白血病的类型，针对下列膜抗原的单克隆抗体或其结合抗原的抗体片段适用于，例如作为配体细胞 膜抗原AML CD13CD15CD33CAMALSialosyl-LeB-CLLCD5CD1cCD23膜免疫球蛋白的独特型和同种型T-CLLCD33M38IL-2受体T-细胞受体ALL CALLACD19非霍奇金淋巴瘤—根据本领域技术人员已知的技术(Winter等，自然，349，293(1991)；Hoogenbooms等，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993)；Girol.Mol.Immunol，28，1379(1991)或Huston等，Intern.Rev.Immunol，10，195(1993))进行鼠抗体的人源化以及Fab和rec.Fv片断的基因的制备和最优化。根据本领域技术人员已知的现有技术类似地进行rec.Fv片断与细胞静止蛋白，细胞毒性蛋白或炎性蛋白或酶的融合。1.7.由结合靶细胞的配体和细胞静止及细胞毒性蛋白形成的融合蛋白的效应基因。配体包括与内皮细胞上的膜结构或膜受体结合的所有物质。这些配体的例子是
—与内皮细胞表达的受体结合的细胞因子，如IL-1，或生长因子，或它们的片断或其组成序列，如PDGF，bFGF，VEGF和TGF。
—所述配体还包括与经激活和/或处于增殖中的内皮细胞结合的粘附分子。它们包括例如SLex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻连蛋白。
—所述配体还包括与肿瘤或白血病细胞的膜结构或膜受体结合的物质。这些配体的例子是与白血病细胞或肿瘤细胞所表达的受体结合的激素或生长因子，或它们的片段或组成序列。有关这种性质的生长因子已有描述(例见Cross等，细胞，64，271(1991)，Aulitzky等，药物，48，667(1994)，Moore，临床癌症研究，1，3(1995)，Van Kooten等，Leuk.Lymph，12，27(1993))。
—根据本领域技术人员已知的现有技术可实现与靶细胞结合的这些配体与细胞静止，细胞毒性或炎性蛋白或酶的基因融合。1.8.炎症诱导物的效应基因，例如下列物质的效应基因—IL-1—IL-2—RANTES(MCP-2)—单核细胞趋化及活化因子(MCAF)—IL-8—巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1α，-β)—嗜中性白细胞活化蛋白-2(NAP-2)—IL-3—IL-5—人白血病抑制因子(LIF)IL-7—IL-11—IL-13—GM-CSF—G-CSF
—M-CSF—眼镜蛇毒因子(CVF)或CVF的组成序列，它们在功能上相当于人补体因子C3b，即能与补体因子B结合，被D因子裂解后构成C3转化酶(convertase)—人补体因子C3或其组成序列C3b—在功能和结构上类似于CVF的人补体因子C3的裂解产物—激活补体或引发炎症的细菌蛋白质，如鼠伤寒沙门氏菌孔蛋白，金黄色葡萄球菌聚集因子，modulin，尤其是得自革兰氏阴性细菌的modulin，得自军团菌或B型流感嗜血菌或克雷伯氏菌的主要外膜蛋白，或得自G族链球菌的M分子。1.9.激活细胞静止因子前体的酶的效应基因，如将无活性的前体物质(前药)转变或裂解成有活性的细胞静止因子(药物)的酶的效应基因Deonarain等人(英国癌症杂志，70，786(1994))，Mullen，Pharmac.Ther，63，199(1994))和Harris等人(Gene Ther，1，170(1994))已评述了具有这种性质的物质，以及总是与之有关的前药和药物。例如，可使用下列酶之一的DNA序列—单纯疱疹病毒胸苷激酶—水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶—细菌硝基还原酶—细菌β-葡糖苷酸酶—得自黑麦的植物β-葡糖苷酸酶—人β-葡糖苷酸酶—人羧肽酶(CB)，如肥大细胞CB-A，胰腺CB-B或细菌羧肽酶—细菌β-内酰胺酶—细菌胞嘧啶脱氨酶—人过氧化氢酶或过氧化物酶—磷酸酶，尤其是人碱性磷酸酶，人前列腺酸性磷酸酶或5型酸性磷酸酶—氧化酶，尤其是人赖氨酰氧化酶或人酸性D-氨基氧化酶
—过氧化物酶，尤其是人谷胱甘肽过氧化物酶，人嗜伊红性粒细胞过氧化物酶或人甲状腺过氧化物酶—半乳糖苷酶8.4.2.自身免疫病和炎症的疗法2.1.靶细胞—处于增殖中的内皮细胞或—巨噬细胞和/或淋巴细胞—滑膜细胞2.2.启动子—内皮细胞特异性和细胞周期特异性的或—巨噬细胞特异性和/或淋巴细胞特异性和/或细胞周期特异性的或—滑膜细胞特异性和/或细胞周期特异性的2.3.治疗变态反应的效应基因，如下列物质的效应基因—IFNβ—IFNγ—IL-10—针对IL-4的抗体或抗体片断—可溶性的IL-4受体—IL-12—TGFβ2.4.防止移植器官排斥的效应基因，如下列物质的效应基因—IL-10—TGFβ—可溶性的IL-1受体—可溶性的IL-2受体—IL-1受体拮抗剂—可溶性的IL-6受体—免疫抑制抗体或其含有VH和VL的片断或其通过接头键合的VH和VL片断。
免疫抑制抗体是例如，特异于T-细胞受体或其CD3复合物的抗体，或针对CD4或CD8，也针对IL-2受体，IL-1受体或IL-4受体的抗体，或针对粘附分子CD2，LFA-1，CD28或CD40的抗体。2.5.治疗抗体介导的自身免疫病的效应基因，如用于—TGFβ—IFNα—IFNβ—IFNγ—IL-12—可溶性的IL-4受体—可溶性的IL-6受体—免疫抑制抗体或其含有VH和VL的片断2.6.治疗细胞介导的自身免疫病的效应基因，如用于—IL-6—IL-9—IL-10—IL-13—TNFα或TNFβ—免疫抑制抗体或其含有VH和VL的片断2.7.细胞增殖抑制剂，细胞静止或细胞毒性蛋白和激活细胞静止因子的前体的酶的效应基因编码这种性质的蛋白质的基因的例子已列于“用于治疗肿瘤的效应基因”一节。
如该段落所述，本发明中可使用编码融合蛋白的效应基因，所述融合蛋白由抗体或这些抗体的Fab或rec.Fv片断，或特异于靶细胞的其它配体与上述细胞因子，生长因子，受体，细胞静止或细胞毒性蛋白和酶融合而成。2.8.治疗关节炎的效应基因本发明中所选择的效应基因表达的蛋白质能直接或间接抑制例如关节中的炎症和/或促进关节中胞外基质(软骨，结缔组织)的重建。
例子有—IL-1受体拮抗剂(IL-1-RA)；IL-1-RA可抑制IL-1α以及IL-1β的结合—可溶性IL-1受体；可溶性IL-1受体可结合并灭活IL-1—IL-6IL-6可使滑膜细胞和软骨细胞中TIMP和超氧化物的分泌增加而IL-1和TNFα的分泌减少—可溶性的TNF受体可溶性的TNF受体可结合并灭活TNF—IL-4IL-4可抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌—IL-10IL-10可抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌并增加TIMP的分泌—胰岛素样生长因子(IGF-1)IGF-1可刺激胞外基质的合成—TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2TGFβ可刺激胞外基质的合成—超氧化物歧化酶—TIMP，尤其是TIMP-1，TIMP-2或TIMP-38.4.3.血细胞缺损形成的疗法3.1.靶细胞—造血系统的处于增殖中的，不成熟细胞，或—与造血细胞相邻的基质细胞3.2.启动子—造血细胞特异性和/或细胞周期特异性—细胞非特异性和细胞周期特异性3.3.治疗贫血的效应基因，例如
—促红细胞生成素3.4.治疗白细胞减少症的效应基因，例如—G-CSF—GM-CSF—M-CSF3.5.治疗血小板减少症的效应基因，例如—IL-3—白血病抑制因子(LIF)—IL-11—血小板生成素8.4.4神经系统损害的疗法4.1.靶细胞—胶质细胞或—处于增殖中的内皮细胞4.2.启动子—胶质细胞特异性和细胞周期特异性的或—内皮细胞特异性和细胞周期特异性的或—非特异性和细胞周期特异性的4.3.神经元生长因子的效应基因，例如—FGF—神经生长因子(NGF)脑衍生神经营养因子(BDNF)—神经营养蛋白-3(NT-3)—神经营养蛋白-4(NT-4)—睫状神经营养因子(CNTF)4.4.酶的效应基因，例如—酪氨酸羟化酶—多巴脱羧酶4.5.抑制或中和TNFα神经毒效应的细胞因子及其抑制剂的效应基因，例如—TGFβ—可溶性TNF受体TNF受体中和TNFα—IL-10IL-10抑制IFNγ，TNFα，IL-2和IL-4的形成—可溶性的IL-1受体—IL-1受体I—IL-1受体II可溶性IL-1受体中和IL-1的活性—IL-1受体拮抗剂—可溶性的IL-6受体8.4.5.血液凝固系统和血液循环系统障碍的疗法5.1.靶细胞—内皮细胞或—处于增殖中的内皮细胞或—内皮细胞和平滑肌细胞附近的体细胞，或—巨噬细胞5.2.启动子—细胞非特异性和细胞周期特异性的或—内皮细胞，平滑肌细胞或巨噬细胞特异性和细胞周期特异性的5.3.抑制凝固或促进纤溶的结构基因，例如—组织纤溶酶原激活物(tPA)—尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)—tPA和uPA的杂合体—C蛋白—水蛭素—丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpine)，如C-1S抑制剂，α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶III
—组织因子途径抑制剂(TFPI)5.4.促进凝固的效应基因，例如—F VIII—F IX—von Willebrand因子—F XIII—PAI-1—PAI-2—组织因子及其片断5.5.血管生成因子的效应基因，例如—VEGF—FGF5.6.降低血压的效应基因，例如—激肽释放酶—内皮细胞氧化氮合酶5.7.可抑制损害内皮细胞层之后平滑肌细胞增殖的效应基因，例如—抗增殖的，细胞静止或细胞毒性蛋白或—上文所述的(在肿瘤一节)将细胞静止因子的前体裂解成细胞静止因子的酶，或—由这些活性化合物之一和配体，例如特异于肌肉细胞的抗体或抗体片断组成的融合蛋白5.8.其它血浆蛋白的效应基因，例如—白蛋白—C1灭活剂—血清胆碱酯酶—运铁蛋白—1-抗胰蛋白酶8.4.6.接种6.1.靶细胞
—肌肉细胞或—巨噬细胞和/或淋巴细胞—内皮细胞6.2.启动子—非特异性和细胞周期特异性的或—靶细胞特异性和细胞周期特异性的6.3.预防传染病的效应基因常规生产有效疫苗的可能性是有限的。
结果开发了DNA疫苗技术。然而，这些DNA疫苗的有效性值得怀疑(Fynan等，Int.J.Immunopharm，17，79(1995)；Donnelly等，免疫学，2，20(1994))。
预期本发明DNA疫苗的效力较高。
被选定的活性物质是由传染性病原体形成的蛋白质的DNA，所述蛋白质通过引发免疫反应，即通过抗体结合和/或通过细胞毒T淋巴细胞导致病原体的中和和/或分解。具有这种性质的所谓的中和抗原已被用作接种抗原(见Eliis，Adv.Exp.Med.Biol，327，263(1992))。
本发明中优选编码得自下列病原体的中和抗原的DNA—甲型流感病毒—HIV—狂犬病病毒—HSV(单纯疱疹病毒)—RSV(呼吸道合胞病毒)—副流感病毒—轮状病毒—VZV(水痘-带状疱疹病毒)—CMV(巨细胞病毒)—麻疹病毒—HPV(人乳头瘤病毒)—HBV(乙型肝炎病毒)
—HCV(丙型肝炎病毒)—HDV(丁型肝炎病毒)—HEV(戊型肝炎病毒)—HAV(甲型肝炎病毒)—霍乱弧菌抗原—布氏疏螺旋体—幽门螺杆菌—疟疾抗原—然而，本发明中这种性质的活性物质也包括抗独特型抗体或其与抗原结合的片断的DNA，所述片断中结合抗原的结构(互补决定区)构成传染性病原体的中和抗原的多拷贝蛋白质结构或糖类结构。
对于细菌传染性病原体而言，这种性质的抗独特型抗体可特别地取代糖类抗原。
Hawkins等人(J.Immunother，14，273(1993))以及Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol，15，227(1993))评述了这种性质的抗独特型抗体及其裂解产物。6.4.“肿瘤疫苗”的效应基因—它们包括肿瘤细胞上的抗原。有关这种性质的抗原的评述例如参见Sedlacek等，Contrib.to Oncol，32，Karger Verlag，Munich(1998)和Contrib.to Oncol，43，Karger Verlag，Munich(1992)。
其它例子由下列蛋白质抗原的基因或对应于下列非蛋白质抗原的抗独特型抗体的可变区(VL，VH)的基因组成—神经节苷脂—路易斯唾液酸—肿瘤上由T细胞识别的肽—癌基因表达的蛋白质—血型抗原及其前体—肿瘤相关粘蛋白上的抗原—热激蛋白上的抗原8.4.7.慢性传染病的疗法7.1.靶细胞—肝脏细胞—淋巴细胞和/或巨噬细胞—上皮细胞—内皮细胞7.2.启动子—病毒特异性或细胞特异性和细胞周期特异性的7.3.效应基因，例如用于—表现出细胞静止，细胞程序死亡或细胞毒性效应的蛋白质—将抗病毒或细胞毒性物质的前体裂解成活性物质的酶7.4.抗病毒蛋白质的效应基因—具有抗病毒效应的细胞因子和生长因子。它们包括例如IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFβ，TNFα，IL-1或TGFβ—特异性地灭活各个病毒的抗体，或其含有VH和VL的片断，或其利用接头键合的VH和VL片断，有关它们的制备已有描述。
针对病毒抗原的抗体的例子是抗-HBV，抗-HCV，抗-HSV，抗-HPV，抗-HIV，抗-EBV，抗-HTLV，抗-柯萨奇病毒，抗-汉坦病毒—Rev-结合蛋白。在逆转录病毒基因表达过程中，这些蛋白质与Rev RNA结合并抑制依赖于Rev的转录后步骤。Rev-结合蛋白的例子是RBP9-27，
RBP1-8U，RBP1-8D，RBP1-8假基因—消化细胞周期控制蛋白基因的mRNA或病毒mRNA的核酶。有关催化HIV的核酶的评述例见Christoffersen等，药物化学杂志，38，2033(1995)。7.5.抗细菌的蛋白质的效应基因抗细菌的蛋白质包括例如中和细菌毒素或调理细菌的抗体。这些抗体包括例如抗下列细菌的抗体脑膜炎球菌C或B，大肠杆菌，疏螺旋体，假单胞菌，幽门螺杆菌，金黄色葡萄球菌8.5.相同或不同效应基因的联合本发明还涉及可自我增强的，并在适当时可被药理控制的表达系统，该系统含有两个相同或两个不同的效应基因(组分d)和d’))的DNA序列的联合。为了确保这两个DNA序列的表达，在两个效应基因之间插入另一个启动子序列，或优选插入内部核糖体进入位点(IRES)的cDNA以作为调控元件。
IRES使通过IRES互相连接的两个DNA序列的表达成为可能。
有关这种性质的IRES的描述例见Montford和Smith，(TIG11，179(1995)；Kaufman等，核酸研究，19，4485(1991)；Morgan等，核酸研究，20，1293(1992)；Dirks等，基因，128，247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然，334，320(1988)和Sugitomo等，BioTechn，12，694(1994))。
例如，可使用脊髓灰质炎病毒的IRES序列的cDNA(5’UTR的第≤140至≥630位)。
本发明中优选利用其它的启动子序列或IRES序列连接表现出加性效应的效应基因。
例如，本发明中优选用于下列的效应基因的组合8.5.1.肿瘤的疗法—相同或不同的，细胞静止，细胞程序死亡，细胞毒性或炎性蛋白或—相同或不同的裂解细胞静止因子的前体的酶8.5.2.自身免疫病的疗法—具有抑制细胞和/或体液免疫反应的协同效应的不同细胞因子或受体或—不同或相同的TIMP8.5.3.血细胞缺损形成的疗法—不同的，梯级顺序的细胞因子，如IL-1，IL-3，IL-6或GM-CSF和促红细胞生成素，G-CSF或血小板生成素8.5.4.神经细胞损害的疗法—神经元生长因子和细胞因子或细胞因子的抑制剂8.5.5.血液凝固系统和血液循环系统障碍的疗法—抗凝剂和纤溶剂(如tPA或uPA)或—细胞静止，细胞程序死亡或细胞毒性蛋白和抗凝剂或纤溶剂—几种不同的，协同作用的血液凝固因子，如F VIII和vWF或F VIII和F IX8.5.6.接种—抗原和免疫刺激细胞因子，如IL-1α，IL-1β，IL-2，GM-CSF，IL-3或IL-4受体—一种传染性病原体或不同传染性病原体的不同抗原，或—一种肿瘤类型或不同肿瘤类型的不同抗原8.5.7.病毒传染性疾病的疗法—抗病毒蛋白和细胞静止，细胞程序死亡或细胞毒性蛋白—针对一种病毒或几种病毒的不同表面抗原的抗体8.5.8.细菌传染性疾病的疗法—针对生物体不同表面抗原和/或毒素的抗体8.6.插入信号序列和跨膜结构域8.6.1.增强翻译为了增强翻译，可在启动子序列的3’末端插入核苷酸序列GCCACC或GCCGCC，并在信号或跨膜序列的起始信号(ATG)的5’末端直接插入所述核苷酸序列(Kozak，细胞生物学杂志，108，299(1989))。8.6.2.促进分泌为了促进效应基因的表达产物的分泌，可用能改善胞外分泌的异源信号序列取代效应基因DNA序列中可能会含的同源信号序列。
因此，可插入例如免疫球蛋白的信号序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等，自然，332，323(1988))或CEA的信号序列(DNA位置≤33至≥134；Schrewe等，分子细胞生物学，10，2738(1990)；Berling等，癌症研究，50，6534(1990))或人呼吸道合胞病毒糖蛋白的信号序列(氨基酸的cDNA≤38至≥50或48至65；Lichtenstein等，普通病毒学杂志，77，109(1996))。8.6.3.锚定活性化合物3.1)为了在形成活性化合物的经转导细胞的细胞膜中锚定活性化合物，可替代性地，或另外在信号序列中插入跨膜结构域的序列。
因此，可在启动子序列和效应基因序列之间插入例如人巨噬细胞集落刺激因子的跨膜序列(DNA位置≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt，83，15(1988))或人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的信号和跨膜区域(氨基酸1至63或其组成序列，氨基酸38至63；Vijaya等，分子细胞生物学，8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒学杂志，77，109(1996))的DNA序列，或流感病毒神经氨酸苷酶的信号和跨膜区域(氨基酸7至35或其组成序列氨基酸7至27；Brown等，病毒学杂志，62，3824(1988))的DNA序列。3.2)然而，为了在形成活性化合物的经转导细胞的细胞膜中锚定活性化合物，也可插入糖磷脂锚的核苷酸序列。
在效应基因核苷酸序列的3’末端插入糖磷脂锚，除了插入糖磷脂锚以外，还可插入信号序列。
已描述了例如CEA，N-CAM和其它膜蛋白，如Thy-1的糖磷脂锚(例见Ferguson等，Ann.Rev.Biochem，57，285(1988))。3.3)按本发明，还可以使用配体-活性化合物融合蛋白的DNA序列将活性化合物锚定于细胞膜上。所述融合蛋白的配体的特异性针对的是选定靶细胞的细胞膜上的膜结构。
与细胞表面结合的配体包括例如针对下列细胞的表面上的结构的抗体或抗体片断—内皮细胞。它们特别地包括针对VEGF受体的抗体和针对细胞分裂素受体的抗体—或肌肉细胞，如针对肌动蛋白的抗体或针对血管紧张肽II受体的抗体或针对生长因子受体，如针对EGF受体或针对PDGF受体或针对FGF受体的抗体，或针对内皮肽A受体的抗体—配体也包括针对肿瘤细胞膜上肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的抗体或其片断。这种性质的抗体已有描述。
优选以人源化的形式使用鼠单克隆抗体。可使用本领域技术人员已知的现有技术制备Fab和rec.Fv片断及其融合产物。
配体还包括能与所选定的各个细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物，如细胞因子或粘附因子，生长因子或其片断或其组成序列，或介体或肽激素。例子有—内皮细胞的配体，如IL-1，PDGF，bFGF，VEGF，TGGβ或细胞分裂素以及细胞分裂素的衍生物或类似物—还包括粘附分子。已描述了内皮细胞这种性质的粘附分子，如SLex，LFA-1，MAC-1，LeCAM-1，VLA-4或玻连蛋白，或玻连蛋白的衍生物或类似物(例见Augustin-Voss等，细胞生物学杂志，119，483(1992)；Pauli等，Cancer Metast.Rev，9，175(1990)；Honn等，Cancer Metast.Rev，11，353(1992)；Varner等，CellAdh.Commun，3，367(1995))。表1
表2柱上样品与下列物质涂覆的亲和层析柱的结合谷胱甘肽 谷胱苷肽转移酶-p163 转移酶融合蛋白重组的+++ +(35S-标记的)p27含有p27的细胞提取物 (+) -(RAT1-Myc ER)含有p27的细胞提取物 +++ -RAT1-Myc ER)，(95C加热2分钟)cdk-2(细胞提取物) - -cdk-4(细胞提取物) - -表3[SEQ ID NO.9]TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG 1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA 1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG 1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC 1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG 1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT 1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG 1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG 1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG 1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA1958表4p1631 MAKRVAEKELTDRNWDEEDEVEEM 24 [SEQ ID NO.10]MAKRVA+ +++D + +++YNup2 1 MAKRVADAQIQRETYDSNESDDDV 24 [SEQ ID NO.11]P163 137 NQPPSSGPASSTACPGNAYHKQLAGLNCSN+ +G A P+ +L LNYNup2 71 NRADGTGEAQVDNSPTTESNSRLKALNLQVRDWIVKHVNTNPLCDLTPIFKDYERYLATI 196 [SEQ ID NO.12]++ + V PL DL P+F YE Y+ IFKAKVDDLVLGKPLADLRPLFTRYELYIKNI 130 [SEQ ID NO.13]P163 215 ATAGMEPPSLFGSTKLQQESPFSFHGNKAEDTA + P ST + PF G++YNup2 535 ANSSTSPAPSIPSTGFKFSLPFEQKGSQTTTNSEKVEFTAEKKSDAAQGAT 265 [SEQ ID NO.14]K E T E + +Q ATDSKEESTTEATGNESQDAT 585 [SEQ ID NO.15]P163 239 HGNKAEDTSEKVEFTAEKKSDAAQGATSASFSFG 272 [SEQ ID NO.16]+G++++D+ ++A+ + AT +FSFGYNup2 444 NGSESKDSDKPSLPSAVDGENDKKEATKPAFSFG 477 [SEQ ID NO.17]P163 399 LGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNPPLDEKQPT 438 [SEQ ID NO.18]+GN+LLN + + N ++ PD K TYNup2 655 MGNVLLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAADGKLVT 694 [SEQ ID NO.19]表5RBP1 (小鼠) DSHADHDTST---ENADESTTHP--QFEPIVSVPE----RBP1 (人)5DSHADHDTST---FNADESNHDP--QFEPIVSVPE----NUP2p (酵母) 560 SQTTTNDSKE---ESTTEATGNESQDATKVDATPEESKPp163 (小鼠) 307 QSKAASSLFSAKASESPAGGGSSECRDGEEEENDEPPKVRBP1 (小鼠) QEIKTLEEDEEELTKMRAKLFRFASENDLPEWKEPRHGDVKLLKHK-RBP1 (人)QEIKTLEEDEEELTKMRAKLFRFASENDLPEWKERGTGDVKLLKHK-NUP2p (酵母) INLQNGEEDEVALTSQKAKLMTFNA--ETKSYDSRGVGEMKLLKKKDp163 (小鼠) VVTEVK--EEDAFYSKKCKLFYKKDNEF----KEKGVGTLHL-KPT-RBP1 (小鼠) EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDRBP1 (人)EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDNUP2p (酵母) DSPKVRLLCRSDGMGNV-LLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAAp163 (小鼠) ATQKTQLLVRADTNLGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNP--RBP1 (小鼠) FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI [SEQ ID NO.20]RBP1 (人)FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI [SEQ ID NO.21]NUP2p (酵母) DG-------KLVTYIVFKQKLEGRSFTKAIEDAKKEM [SEQ ID NO.22]p163 (小鼠) PLDEKQPTLPATMLIRVKTSEDADELHKILLEKKDAA [SEQ ID NO.23]表6p163(小鼠)[SEQ ID NO.24]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Gln Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser305 310 315 320Glu Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu325 330 335Glu Glu Asn Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu340 345 350Glu Asp Ala Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp355 360 365Asn Glu Phe Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr370 375 380Ala Thr Gln Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly385 390 395 400Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg405 410 415Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu420 425 430Asp Glu Lys Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys435 440 445Thr Ser Glu Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys450 455 460Asp Ala465NUP2(酵母) [SEQ ID NO.25]Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp1 5 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val Thr Pro Ser Thr Lys Val Ala Ser20 25 30Ser Ala Val Met Asn Arg Arg Lys Ile Ala Met Pro Lys Arg Arg Met35 40 45Ala Phe Lys Pro Phe Gly Ser Ala Lys Ser Asp Glu Thr Lys Gln Ala50 55 60Ser Ser Phe Ser Phe Leu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln65 70 75 80Val Asp Asn Ser Pro Thr Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu85 90 95Asn Leu Gln Phe Lys Ala Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro100 105 110Leu Ala Asp Leu Arg Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys115 120 125Asn Ile Leu Glu Ala Pro Val Lys Phe Ile Glu Asn Pro Thr Gln Thr130 135 140Lys Gly Asn Asp Ala Lys Pro Ala Lys Val Glu Asp Val Gln Lys Ser145 150 155 160Ser Asp Ser Ser Ser Glu Asp Glu Val Lys Val Glu Gly Pro Lys Phe165 170 175Thr Ile Asp Ala Lys Pro Pro Ile Ser Asp Ser Val Phe Ser Phe Gly180 185 190Pro Lys Lys Glu Asn Arg Lys Lys Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asn Asp195 200 205Ile Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Ser Gly Thr Val Ser Ser210 215 220Asp Val Phe Lys Leu Asn Pro Ser Thr Asp Lys Asn Glu Lys Lys Thr225 230 235 240Glu Thr Asn Ala Lys Pro Phe Ser Phe Ser Ser Ala Thr Ser Thr Thr245 250 255Glu Gln Thr Lys Ser Lys Asn Pro Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Lys260 265 270Thr Asn Val Asp Asn Asn Ser Lys Ala Glu Ala Ser Phe Thr Phe Gly275 280 285Thr Lys His Ala Ala Asp Ser Gln Asn Asn Lys Pro Ser Phe Val Phe290 295 300Gly Gln Ala Ala Ala Lys Pro Ser Leu Glu Lys Ser Ser Phe Thr Phe305 310 315 320Gly Ser Thr Thr Ile Glu Lys Lys Asn Asp Glu Asn Ser Thr Ser Asn325 330 335Ser Lys Pro Glu Lys Ser Ser Asp Ser Asn Asp Ser Asn Pro Ser Phe340 345 350Ser Phe Ser Ile Pro Ser Lys Asn Thr Pro Asp Ala Ser Lys Pro Ser355 360 365Phe Asn Phe Gly Val Pro Asn Ser Ser Lys Asn Glu Thr Ser Lys Pro370 375 380Val Phe Ser Phe Gly Ala Ala Thr Pro Ser Ala Lys Glu Ala Ser Gln385 390 395 400Glu Asp Asp Asn Asn Asn Val Glu Lys Pro Ser Ser Lys Pro Ala Phe405 410 415Asn Phe Ile Ser Asn Ala Gly Thr Glu Lys Glu Lys Glu Ser Lys Lys420 425 430Asp Ser Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gly Ile Ser Asn Gly Ser Glu Ser435 440 445Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala Val Asp Gly Glu Asn450 455 460Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Phe Gly Ile Asn Thr Asn465 470 475 480Thr Thr Lys Thr Ala Asp Thr Lys Ala Pro Thr Phe Thr Phe Gly Ser485 490 495Ser Ala Leu Ala Asp Asn Lys Glu Asp Val Lys Lys Pro Phe Ser Phe500 505 510Gly Thr Ser Gln Pro Asn Asn Thr Pro Ser Phe Ser Phe Gly Lys Thr515 520 525Thr Ala Asn Leu Pro Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile530 535 540Pro Ser Thr Gly Phe Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser545 550 555 560Gln Thr Thr Thr Asn Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr565 570 575Gly Asn Glu Ser Gln Asp Ala Thr Lys Val Asp Ala Thr Pro Glu Glu580 585 590Ser Lys Pro Ile Asn Leu Gln Asn Gly Glu Glu Asp Glu Val Ala Leu595 600 605Phe Ser Lys Ala Lys Leu Met Thr Phe Asn Ala Glu Thr Lys Ser Tyr610 615 620Asp Ser Arg Gly Val Gly Glu Met Lys Leu Leu Lys Lys Lys Asp Asp625 630 635 640Pro Ser Lys Val Arg Leu Leu Cys Arg Ser Asp Gly Met Gly Asn Val645 650 655Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr Glu Pro Leu Ala660 665 670Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val Ala Ala Asp Gly675 680 685Lys Thr Tyr Ile Val Lys Phe Lys Gln Lys Glu Glu Gly Arg Ser Phe690 695 700Thr Lys Ala Ile Glu Asp Ala Lys Lys Glu Lys705 710 715表7检测HeLa细胞中p27和p163之间的结合被下列物质转染的HeLa细胞的总蛋白的沉淀与下列物质的沉淀 Cmv-p27CMV-p27-+CMV-NapCMV-Nap2-Nap2-特异性抗体 - + + -p27-特异性抗体 + ++ - -表8 [SEQ ID NO.26]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp115 120 125Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly Lys Lys Ile130 135 140Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe145 150 155 160Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp Ala Ala Gln165 170 175Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser Glu Ser Pro180 185 190Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Asn195 200 205Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu Glu Asp Ala210 215 220Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp Asn Glu Phe225 230 235 240Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr Ala Thr Gln245 250 255Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly Asn Ile Leu260 265 270Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg Thr Gly Lys275 280 285Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu Asp Glu Lys290 295 300Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys Thr Ser Glu305 310 315 320Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys Asp Ala325 330 335表9 [SEQ ID NO.27]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120 125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Ile165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Glu Lys Glu Leu305 310表10[SEQ ID NO.28]Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser1 5 10 15Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly20 25 30Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp35 40 45Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro50 55 60Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu65 70 75 80Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr85 90 95Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln100 105 110Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu115 120 125Lys Val Glu Phe130
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道—(C)城市法兰克福(D)州—(E)国家德国(F)邮政编码(ZIP)65926(G)电话069-305-3005(H)传真069-35-7175(I)电报—(ii)发明题目用于基因疗法的核酸构建体(iii)序列数57(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…17(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGACAACTG TTGACCG 17(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…20(xi)序列描述SEQ ID NO2TACTGTATGT ACATACAGTA 20(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子
(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO3GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…42(xi)序列描述SEQ ID NO4TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…12(xi)序列描述SEQ ID NO5TAATGATGGG CG 12(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…26(xi)序列描述SEQ ID NO6GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置 1…17(xi)序列描述SEQ ID NO7AGCAGGTGTT GGGAGGC17(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征
(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…41(xi)序列描述SEQ ID NO8GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度1958个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…1958(xi)序列描述SEQ ID NO9TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA 120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT 180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG 240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG 300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG 360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA 420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT 480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT 540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA 600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT 660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT 720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT 780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC 840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG 900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC 960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG 1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC 1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA 1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA 1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA 1958(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met20(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp1 5 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val20(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度60个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…60(xi)序列描述SEQ ID NO12Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly1 5 10 15Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp20 25 30Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro35 40 45Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile50 55 60(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度60个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…60(xi)序列描述SEQ ID NO13Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln Val Asp Asn Ser Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu Asn Leu Gln Phe Lys Ala20 25 30Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro Leu Ala Asp Leu Arg Pro35 40 45Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys Asn Ile50 55 60(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度51个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…51(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr20 25 30Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln35 40 45Gly Ala Thr50(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度51个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…51(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile Pro Ser Thr Gly Phe1 5 10 15Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser Gln Thr Thr Thr Asn20 25 30Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gln35 40 45Asp Ala Thr50(2)SEQ ID NO16的资料(i)序列特征(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置 1…34(xi)序列描述SEQ ID NO16His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala1 5 10 15Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征
(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…34(xi)序列描述SEQ ID NO17Asn Gly Ser Glu Ser Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala1 5 10 15Val Asp Gly Glu Asn Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO18的资料(i)序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…40(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys1 5 10 15Thr Arg Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro20 25 30Pro Leu Asp Glu Lys Gln Pro Thr35 40(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度40个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…40(xi)序列描述SEQ ID NO19Met Gly Asn Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr1 5 10 15Glu Pro Leu Ala Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val20 25 30Ala Ala Asp Gly Lys Leu Val Thr35 40(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征(A)长度157个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…157(xi)序列描述SEQ ID NO20Asp Ser His Ala Asp His Asp Thr Ser Thr Glu Asn Ala Asp Glu Ser1 5 10 15Thr Thr His Pro Gln Phe Glu Pro Ile Val Ser Val Pro Glu Gln Glu20 25 30Ile Lys Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Leu Phe Lys Met Arg Ala35 40 45Lys Leu Phe Arg Phe Ala Ser Glu Asn Asp Leu Pro Glu Trp Lys Glu50 55 60Pro Arg His Gly Asp Val Lys Leu Leu Lys His Lys Glu Lys Gly Thr65 70 75 80Ile Arg Leu Leu Met Arg Arg Asp Lys Thr Leu Lys Ile Cys Ala Asn85 90 95His Tyr Ile Thr Pro Met Met Glu Leu Lys Pro Asn Ala Gly Ser Asp100 105 110Arg Ala Trp Val Trp Asn Thr His Thr Asp Phe Ala Asp Glu Cys Pro115 120 125Lys Pro Glu Leu Leu Ala Ile Arg Phe Leu Asn 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His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro50 55 60Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu65 70 75 80Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr85 90 95Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln100 105 110Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu115 120 125Lys Val Glu Phe130(2)SEQ ID NO29的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO29AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22(2)SEQ ID NO30的资料(i)序列特征
(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO30CAAATCCAGA AAAGCGTCCT C 21(2)SEQ ID NO31的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO31TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG24(2)SEQ ID NO32的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO32AGAAAAGCGT CCTCCTCCAG A 21(2)SEQ ID NO33的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO33TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG24(2)SEQ ID NO34的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征
(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO34AGCGCCACTA ACCAAATCCA GA 22(2)SEQ ID NO35的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO35AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22(2)SEQ ID NO36的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO36GAAAAGCGTC CTCCTCCAGA AG 22(2)SEQ ID NO37的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO37GAAAGCAAAG CGCAGAAATG TT 22(2)SEQ ID NO38的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO38CTCCAGCGCC ACTACCAAAT C 21(2)SEQ ID NO39的资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…20(xi)序列描述SEQ ID NO39CCCGCACGGA GCAGTTCAAG 20(2)SEQ ID NO40的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO40GCAGCGGCAG ATCCCAAGGT AG 22(2)SEQ ID NO41的资料(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…17(xi)序列描述SEQ ID NO41GGCATCGTTT TTCTCCA17(2)SEQ ID NO42的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO42CGTTCTTATC GTCTCTGTGT TC 22(2)SEQ ID NO43的资料(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…19(xi)序列描述SEQ ID NO43GCATCCTTTT TCTCCAGTA19(2)SEQ ID NO44的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…18(xi)序列描述SEQ ID NO44TGTTCCAAAT CCACCAAT 18(2)SEQ ID NO45的资料(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…19(xi)序列描述SEQ ID NO45GTCTGCATCC TCGCTGGTT 19(2)SEQ ID NO46的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO46CGTTCTTATC GTCTGTGTTC C 21(2)SEQ ID NO47的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…18(xi)序列描述SEQ ID NO47TTTTACCCGA ATCAACAT18(2)SEQ ID NO48的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO48GTACGGGAAC AGGGAAGAAT A 21(2)SEQ ID NO49的资料(i)序列特征(A)长度212个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…212(xi)序列描述SEQ ID NO49Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe Met195 200 205Ile Phe Ile Lys210(2)SEQ ID NO50的资料(i)序列特征(A)长度183个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质
(B)位置1…183(xi)序列描述SEQ ID NO50Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Cys Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155 160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO51的资料(i)序列特征(A)长度199个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO51Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Pro Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln His Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Arg50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Pro Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO52的资料(i)序列特征(A)长度199个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO52Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Gly Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO53的资料(i)序列特征(A)长度199个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO53Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln Ala1 5 10 15Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val Asn20 25 30His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met Glu35 40 45Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys Pro50 55 60Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu Pro65 70 75 80Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys Val85 90 95Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val Pro100 105 110Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp Gln115 120 125Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys Pro130 135 140Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile Lys145 150 155 160Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn Ala165 170 175Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln Thr180 185 190Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser195(2)SEQ ID NO54的资料(i)序列特征(A)长度220个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…220(xi)序列描述SEQ ID NO54Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala1 5 10 15Arg Gln Ala Asp His Pro Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro20 25 30Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp35 40 45Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His50 55 60Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser65 70 75 80Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys85 90 95Lys Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala100 105 110Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val115 120 125Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln130 135 140Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln145 150 155 160Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro165 170 175Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg180 185 190Gln Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe195 200 205Met Ile Phe Ile Ile Lys Val Ile Lys Lys Ile Ser210 215 220(2)SEQ ID NO55的资料(i)序列特征(A)长度183个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质
(B)位置1…183(xi)序列描述SEQ ID NO55Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Gln Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155 160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO56的资料(i)序列特征(A)长度138个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…138(xi)序列描述SEQ ID NO56Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Ser Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys130 135(2)SEQ ID NO57的资料(i)序列特征(A)长度197个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1…197(xi)序列描述SEQ ID NO57Met Ser Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met1 5 10 15Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu20 25 30Phe Gly Pro Val Asn His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His35 40 45Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe50 55 60Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu65 70 75 80Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys85 90 95Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser100 105 110Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg115 120 125His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu130 135 140Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Gln Asn Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp165 170 175Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly180 185 190Leu Arg Arg Gln Thr19权利要求
1.含有下列组分的核酸构建体组分a)转录组分b)的激活序列组分b)转录因子的基因，所述基因含有b1)激活域b2)与抑制剂结合的序列b3)DNA-结合域组分c)通过与组分b)的表达产物结合而被激活的激活序列，所述激活序列诱导组分d)的转录组分d)效应基因。
2.权利要求1所要求的核酸构建体，其中组分a)与组分c)相同。
3.权利要求1或2所要求的核酸构建体，其中组分a)是可被非特异性，细胞特异性，代谢特异性，病毒特异性和/或细胞周期特异性地激活的启动子序列。
4.权利要求3所要求的核酸构建体，其中组分a)选自—在下列细胞中被激活的启动子皮肤，肺，胃肠道，肾脏和尿道的内皮细胞，腹膜细胞，胸膜细胞和上皮细胞，肌肉细胞，结缔组织细胞，造血细胞，巨噬细胞，淋巴细胞，白血病细胞，肿瘤细胞或胶质细胞—病毒如HBV，HCV，HSV，HPV，EBV，HTLV，CMV或HIV的启动子序列—由缺氧激活的启动子或增强子序列或cdc25C，细胞周期蛋白A，cdc2，E2F-1，B-myb，DHFR基因的细胞周期特异性激活序列，和—结合转录因子的序列，所述序列似乎或确实以依赖于细胞增殖的方式被激活，所述序列如Myc E盒的单体或多体。
5.权利要求1至4中任一个所要求的核酸构建体，其中激活域[组分b)的组分b1)]选自包括Oct-2，Sp1，NFY，ITF-2，VP-16，c-Myc和CTF的转录因子的激活域。
6.权利要求1至5中任一个所要求的核酸构建体，其中结合抑制剂的序列(b2)选自可抑制p27蛋白，中和p27对细胞增殖的抑制作用的蛋白质。
7.权利要求1至5中任一个所要求的核酸构建体，其中结合抑制剂的序列(b2)含有表6所示的p163氨基酸序列[SEQ ID NO24]或其部分。
8.权利要求7所要求的核酸构建体，其中根据表6的编号，p163氨基酸序列的部分选自具有下列位置的氨基酸序列的肽1至24[SEQ IDNO10]，137至196[SEQ ID NO12]，215至265[SEQ ID NO14]，239至272[SEQ ID NO16]，399至438[SEQ ID NO18]和307至469[SEQID NO20]。
9.权利要求1至5中任一个所要求的核酸构建体，其中通过从权利要求7所要求的蛋白质中缺失功能域，从表6的[SEQ ID NO24]中缺失p27-结合域或Ran-结合域可衍生得到结合抑制剂的序列(b2)。
10.权利要求9所要求的核酸构建体，其中缺失了p27-结合域之后可得到具有表8所示氨基酸序列[SEQ ID NO26]的蛋白质，缺失了Ran-结合域时可得到具有表9所示氨基酸序列[SEQ ID NO27]的蛋白质。
11.权利要求1至5中任一个所要求的核酸构建体，其中通过从权利要求2所要求的蛋白质中缺失除p27-结合域区以外的所有氨基酸序列可衍生得到结合抑制剂的序列(b2)。
12.权利要求11所要求的核酸构建体，其中结合抑制剂的序列含有表10所示的氨基酸序列[SEQ ID NO28]。
13.权利要求1至5中任一个所要求的核酸构建体，其中结合抑制剂的序列(b2)选自权利要求6至12中任一个所要求的抑制剂的同源性蛋白质，另一种哺乳动物类或人的相应部分。
14.权利要求13所要求的核酸构建体，其中抑制剂的氨基酸序列是p163的人类似物。
15.权利要求1至14中任一个所要求的核酸构建体，其中组分c)含有至少一种结合组分b)的DNA(结合)序列，并被这种结合所激活。
16.权利要求15所要求的核酸构建体，其中DNA结合序列选自结合Gal4蛋白的序列(5′-CGGACAACTGTTGACCCG-3′， SEQ ID NO1)；结合LexA蛋白的序列(5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′，SEQ IDNO2)；结合LacI阻抑蛋白的序列(5′-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3′，SEQ ID NO3)；结合四环素阻 抑 蛋 白 的 序 列 (5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3′，SEQ ID NO4)和结合ZFHD-1蛋白的序列(5′-TAATGATGGGCG-3′，SEQ ID NO5)。
17.权利要求1至16中任一个所要求的核酸构建体，其中效应基因(组分d)是编码活性化合物的基因，所述活性化合物选自细胞因子，趋化因子，生长因子，细胞因子、趋化因子或生长因子的受体，具有抗增殖或细胞静止或细胞程序死亡效应的蛋白质，抗体，抗体片段，血管生成抑制剂，肽激素，凝结因子，凝结抑制剂，纤溶蛋白，对血液循环起作用的肽或蛋白质，血浆蛋白和传染性病原体或细胞或肿瘤的抗原，选定的抗原可导致免疫反应。
18.权利要求1至14中任一个所要求的核酸构建体，其中效应基因是编码可将药物前体转变成药物的酶的基因。
19.权利要求1至14中任一个所要求的核酸构建体，其中效应基因是编码配体-活性化合物融合蛋白或配体-酶融合蛋白的基因，所述配体选自细胞因子，生长因子，抗体，抗体片段，肽激素，介体和细胞粘附分子。
20.前述权利要求中任一个所要求的核酸构建体，其中核酸是DNA。
21.前述权利要求中任一个所要求的核酸构建体，其中核酸构建体被插入载体。
22.权利要求21所要求的核酸构建体，其中载体是质粒载体。
23.权利要求21所要求的核酸构建体，其中载体是病毒载体。
24.权利要求1至23中任一个所要求的核酸构建体，其中通过下列方式施用所述核酸构建体以预防或治疗疾病外部，经口，囊内，经鼻，支气管内，或施用至胃肠道内，或注射至器官内，体腔内，肌肉系统内，皮下施用或注射至血液循环中。
25.含有权利要求1至24中任一个所要求的核酸构建体的分离的细胞。
26.权利要求1至24中任一个所要求的核酸构建体或权利要求25中所要求的细胞用于生产治疗疾病的药物的用途，所述疾病选自感染，肿瘤，白血病，自身免疫病，变态反应，关节炎，炎症，器官排斥，移植物抗宿主反应，血凝固疾病，循环系统疾病，贫血，激素病和CNS损害。
27.制备权利要求1至24中任一个所要求的核酸构建体的方法，其中逐步将各个元件连接在一起。
28.权利要求25所要求的细胞用于生产治疗权利要求26所要求的疾病的药物的用途，其中通过下列方式施用至少一种细胞以预防或治疗疾病外部，囊内，经鼻，支气管内，口服或施用到胃肠道内，或注射至器官内，体腔内，肌肉系统内，皮下施用或注射至血液循环中。
全文摘要
本申请公开了用于疾病的基因疗法的核酸构建体，所述构建体含有编码蛋白质的核酸，所述蛋白质可抑制细胞蛋白质p27，因而可解除由p27引起的对细胞增殖的抑制作用，本申请还涉及所述构建体的突变体，其中一些突变体具有显性干扰性状，本申请还涉及这些核酸用于预防和治疗疾病的用途。
文档编号G01N33/15GK1227871SQ98125350
公开日1999年9月8日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月20日
发明者M·艾勒斯, A·布尔吉恩, H－H·塞德拉克 申请人:德国赫彻斯特马里奥罗塞尔有限公司