专利名称：外源基因整合动物胚胎的检测方法
技术领域：
本发明涉及在转基因动物研究工作中，检测移植前动物胚胎细胞基因组内整合外源基因的方法。
转基因动物技术是研究基因功能的一种重要途径；它还可以用于改造动物性状、研制人类疾病动物模型等。近年，以哺乳动物乳腺生物反应器为目的的转基因家畜研究更是吸引了众多科学家。哺乳动物乳腺生物反应器的经济潜能不可估量。
转基因动物研究面临的最大困难是工作效率低下。这在转基因家畜研制中更是如此。以转基因羊为例，外源基因显微注射入羊胚胎后，外源基因的整合率为0.2～0.5％。如果将所有成活的注射胚胎全部移植，势必要求提供大量的受体母羊，显然将造成人力、物力、财力的极大浪费。因而鉴定动物胚胎，选择有外源基因整合的胚胎(整合胚)进行移植是势在必行的事。
整合胚鉴定首先要求从完整胚胎内取出适量细胞，同时取细胞时要求对胚胎的损伤尽可能小，以保证部分细胞取出后，胚胎仍能成活，用于移植。经典的胚胎取细胞方法是显微切割法。但该方法破坏了胚胎透明带的完整性，可能造成取细胞后的胚胎碎裂。另一种方法是通过将显微注射针刺入胚胎内，用负压吸取细胞。该方法由于使用负压操作，可能造成取细胞后的胚胎负压损伤。
由于可用于鉴定的胚胎细胞数目有限，同时从整合胚的鉴定到胚胎移植仅有1～2天的时间，因而整合胚的鉴定必须要求快速、灵敏、准确。目前，聚合酶链式反应(PCR)是国内外最常用的检测方法。将取出细胞的DNA用作PCR反应的模版，用于整合胚的鉴定。单个细胞或数个细胞由于模版量太低，以单次PCR技术作为整合胚检测手段时，常常采用扩大PCR循环周期数，以期获得足够的扩增产物。但是，PCR循环数越大，非特异性DNA同时被扩增的几率越大，将严重影响对PCR结果的判定。同时，由于注射进入动物胚胎的外源基因在部分胚胎内以整合形式存在于基因组，在其它胚胎内则可能以游离、未整合状态存在。因而，以PCR扩增方法用于整合胚鉴定时，要尽量排除未整合的外源基因对结果判定的影响。有文献报道以甲基化修饰外源基因，然后用甲基化敏感的甲基化酶酶解未整合基因(参见WO-A-9222657，1992年)，这种方法要求甲基化酶酶解活力高，酶解完全。即使这样，该方法也嫌繁琐、不实用。还有报道通过胚胎细胞固定、洗涤方法，以降低未整合外源基因(参见WO-A-95143760，1995年)虽然简单，但影响因素较多。
为此，本发明的目的是提供一种外源基因整合动物胚胎的检测方法，该方法包括先采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分胚胎细胞，然后采用巢式PCR技术检测转基因动物胚胎细胞内外源基因的整合。该方法快速、灵敏、准确性高。
本发明外源基因整合动物胚胎的检测方法，包括先采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分细胞，然后采用巢式聚合酶链式反应(PCR)技术检测胚胎内整合的外源基因，即通过二次PCR扩增外源基因。在整合胚检测时，第一次PCR扩增加入的第一对引物，位于待检测外源目的基因的最外侧或其附近区域，第二次扩增加入的第二对引物位于第一对引物的内侧，同时设置多组阳性重复试验，并加入内对照基因的引物，以降低未整合的外源基因及有时由于PCR技术本身的错误对检测结果判定的影响，提高转基因整合胚检测的准确性。
显微注射进入受精卵的外源DNA是一个固定量。随着注射受精卵发育、细胞分裂数增加，每个胚胎细胞内的未整合外源基因将成倍地降低。因而本发明取桑椹期和囊胚期的动物胚胎作为检测对象。采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分胚胎细胞。该方法取出的细胞数可达4～20个。该方法适用于从任何胎生动物胚胎内取出部分细胞。与经典的切割法不同，该方法取样后不破坏胚胎透明带的完整性，使得取细胞后的胚胎保持良好的生长能力。该方法与显微注射针负压取样法也不同，由于使用正压，压迫胚胎取细胞时，胚胎上的洞口能释放胚胎内多余压力，到达内外压平衡，故胚胎取样后损伤小，胚胎成活率达90％。
为了克服一般PCR技术检测整合胚存在的缺点，本发明采用巢式PCR技术检测整合胚，用两次PCR扩增外源目的基因。
先将细胞放入小试管，并用冻融法破坏细胞膜，释放出细胞DNA。以此DNA为模版，进行第一次PCR扩增，加入与外源目的基因配对的第一对PCR引物。根据未整合外源基因在胚胎细胞内的存在形式胚胎细胞内游离的外源基因越长，越容易受到细胞内DNA酶的攻击而断裂降解，本发明设计了合适的PCR引物，以避免未整合外源基因同时被扩增的可能。PCR引物设计时，除考虑它们与模版DNA结合的特异性外，尚考虑到外源目的基因与内对照基因各自PCR扩增得到的片段大小要合适，不但要使两者在凝胶电泳板上可分开、易于辨认，而且要使两者PCR反应要求条件相当，效率相当。第一对引物位于待检测外源目的基因的最外侧或其附近区域(如实施例中的引物A和B，引物序列见表1)。反应管内同时还加入Taq酶以及PCR标准缓冲液。将试管内的溶液混匀，并放入PCR热循环仪进行扩增。第一次PCR采用低扩增(循环)周期(10～20个)，以求降低非特异性片段扩增。将第一次PCR反应扩增产物分为数份，并以此产物为模版，进行第二次PCR扩增，加入与外源目的基因配对的第二对PCR引物。该对引物位于第一对引物的内侧(如实施例中的引物C和D，引物序列见表1)。同时加入内对照基因的引物(如实施例中与羊β珠蛋白基因配对的引物BG1和BG2，引物序列见表1)，以及Tag酶、PCR标准缓冲液。同第一次PCR操作，在PCR仪上进行循环扩增。可用作内对照的基因还可以有碱性磷酸酶基因，次黄嘌呤磷酸核苷酸转移酶基因等。PCR反应本身也偶尔会出现不可预测的错误，所以同时选择动物细胞内本身存在的一个基因(如珠蛋白基因)作为PCR扩增的靶基因，也就是设置内对照，将有助于判断PCR假阴性错误。同样，待检测的外源目的基因设置多组重复管对照，有助于判断PCR假阳性错误。
表1引物名称 引物序列A5’GATCATGGCAGAATCACCAG3’B5’GTATCCCGGTATGTCAACTG3’C5’ATTCTGTGGAGGCTCTATCG3’D5’CAACCATGACATTGCCCTTC3’BG1 5’CACCTGACTCAATGCTCAAC3’BG2 5’CCTTGAGATTTGAATTGCAC3’扩增反应结束后，取部分反应产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳板上进行电泳分析。
本发明所述的巢式PCR技术，可用于所有胎生动物整合胚的检测。该技术不但适用于检测胎生动物胚胎细胞内的外源基因，例如人血清白蛋白基因，人凝血FVIII、FIX因子基因，人乳铁蛋白基因，α-抗胰蛋白酶基因，促血小板生成素基因，促红细胞生成素基因，转铁蛋白基因等，也适用于胎生动物胚胎细胞内所有内源基因(如地中海贫血，苯丙酮尿症，血友病，囊性纤维化病等遗传性疾病基因)的检测鉴定。
本发明优点本发明提供了一种快速、灵敏、准确的外源基因整合动物胚胎的检测方法，包括先采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分胚胎细胞，对胚胎损伤小，胚胎成活率可达90％。然后采用巢式PCR技术检测整合胚，二次PCR扩增外源目的基因，设计合适的PCR引物，避免未整合外源基因同时被扩增的可能。第二次扩增时，同时设置多组重复试验，有助于判断PCR假阳性错误，并加入内对照基因，有助于判断PCR假阴性错误，提高转基因整合胚检测的准确性，进一步提高转基因动物研制的效率。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围
图1显示本发明巢式PCR技术鉴定整合羊胚胎的凝胶电泳图。M1、M2是标准分子量；第1泳道为阳性对照；第2泳道为内对照；第3、4、6泳道为阳性整合胚；第5泳道为未整合胚。
本发明实施例中所用的试剂均为Gibco和Sigma公司生产的胚胎培养级试剂实施例1“打洞压迫法”取胚胎细胞显微注射了人凝血FIX因子基因5pg的羊受精卵共200枚，经体外培养6天后，发育至囊胚后期。每次取一枚胚胎放入一张预先盛有约1mL胚胎成熟培养液(TCM199培养液，含5％胎牛血清和0.12微克的丙酮酸钠)的凹孔玻片的凹孔内。将玻片移至显微注射仪的操作台上。显微操作在胚胎的透明带上打两个洞，然后挤压胚胎，挤出10个细胞。取细胞后的胚胎移入39℃、5％CO2及饱和湿度的二氧化碳培养箱内继续培养。共对100枚羊胚胎进行了操作。取细胞后的胚胎成活率为90％。
实施例2巢式PCR技术鉴定试验挤出的细胞小心移入一支0.5mL无菌离心管内。以冻融法破碎细胞。融破的细胞溶液直接作为DNA模板。然后加入第一次PCR引物各6pmol(A和B，引物序列见表1)及1.5个单位Tag酶和标准10×PCR反应缓冲液1微升，反应体系总体积为10微升。在PE-9600循环仪上，按下述条件94℃变性1分钟后，以55℃退火45秒，72℃延长1分钟为条件经15个PCR循环扩增。扩增结束后，试管在台式离心机上离心。分别吸取2微升反应产物作为第二次PCR反应的模板，加入到3个新的0.5mL无菌离心管，然后加入第二次PCR引物各10pmol(C和D，引物序列见表1)、作为内对照的羊β珠蛋白基因片段引物各10pmol(GB1和GB2，引物序列见表1)、1.5单位的Tag酶及标准10×PCR反应缓冲液2.5微升，反应体系总体积为25微升，按下述条件进行PCR扩增，94℃变性1分钟后，以55℃退火45秒，72℃延长1分钟为条件经40个循环扩增后终止反应。从各反应管内取反应产物5微升进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。分析结果见图1，第1泳道为阳性对照，可见205bp的条带(人FIX基因)；第2泳道为内对照，可见121bp的条带(羊β珠蛋白基因)；第3、4、5、6泳道为胚胎细胞巢式PCR检测结果，其中第3、4、6泳道可见有205bp和121bp扩增产物条带，可确定为整合胚，第5泳道仅见121bp扩增条带，则为未整合胚。
以该巢式PCR技术对动物胚胎进行鉴定，符合要求的整合胚进行受体移植。结果表明，出生的子代动物百分之百与整合胚的结果相符合。
权利要求
1.一种外源基因整合动物胚胎的检测方法，包括从动物胚胎中取出部分胚胎细胞，及采用聚合酶链式反应(PCR)技术检测胚胎细胞内整合的外源基因，其特征在于该方法先取桑椹期和囊胚期的动物胚胎，在该胚胎的透明带上打洞，挤出部分细胞，然后采用巢式PCR技术检测胚胎细胞内外源基因的整合，即通过二次PCR扩增外源基因。
2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述巢式PCR技术检测时，第一次PCR扩增，加入的第一对引物位于待检测外源基因的最外侧或其附近区域。
3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述巢式PCR技术检测时，第二次PCR扩增，加入的第二对引物位于第一对引物的内侧，同时设置多组重复试验，并加入内对照基因。
4.按权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于当转基因羊的外源基因是人凝血FIX因子基因时，所述第一对引物的序列如下引物A5’GATCATGGCAGAATCACCAG3’引物B5’GTATCCCGGTATGTCAACTG3’
5.按权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于当转基因羊的外源基因是人凝血FIX因子基因时，所述第二对引物的序列如下引物C5’ATTCTGTGGAGGCTCTATCG3’引物D5’CAACCATGACATTGCCCTTC3’
6.按权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于当转基因羊整合胚胎检测时，所述内对照基因是羊β珠蛋白基因，碱性磷酸酶基因、次黄嘌呤磷酸核苷酸转移酶基因。
7.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法中动物是指所有的胎生动物。
8.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述方法也适用于胎生动物胚胎细胞内所有内源基因的检测。
全文摘要
一种外源基因整合动物胚胎的检测方法,包括采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分细胞,对胚胎损伤小,胚胎成活率可达90%。又采用巢式PCR技术检测整合胚,二次PCR扩增外源目的基因,设计合适的PCR引物,加入内对照基因,同时设置多组重复试验,提高转基因整合胚检测的准确性。本发明是一种快速、灵敏、准确性高的检测方法。
文档编号G01N33/50GK1203366SQ98110828
公开日1998年12月30日 申请日期1998年5月8日 优先权日1998年5月8日
发明者黄淑帧, 曾溢滔 申请人:上海市儿童医院上海医学遗传研究所