专利名称：径向色谱柱用金属螯合亲和膜色谱介质的合成方法
技术领域：
本发明提供一种以短棉纤维为基质，通过某种活性高分子聚合物与纤维接枝后，再引入可螯合过渡金属离子的配体---亚氨二乙酸，制成适于生物大分子分离纯化用的金属螯合膜色谱介质的方法。
生物工程和基因工程的迅速发展为社会提供了越来越多的生物产品，然而只有经过分离纯化并达到一定纯度的生物产品才能为人们所利用，特别是用于临床的生化药品。以软凝胶为基质的经典的生物大分子分离纯化技术由于流速慢、压降大、分离时间长、大规模处理时不易放大等缺点，已远远不能适应当今发展的需要。80年代中期推出了径向膜色谱技术，它是将膜色谱技术与色谱分离原理结合起来，采用径向流动技术，克服了传统色谱技术的缺点，可以在较小床层高度时，获得较大的处理量，还可以达到较大流速，另外，它可以进行线性放大，即在保持柱径不变而只增加柱长时，可按比例增加样品的处理量，因此，径向膜色谱技术是一种较理想的生物工程大规模分离提纯的有效工具。
亲和色谱技术是分离纯化生物大分子的重要手段，其特点是选择性好、纯化倍数高。以过渡金属离子为通用性配体的金属螯合亲和色谱以其制造成本低、通用性好、纯化倍数较高而被广泛用于生物产品的分离纯化。把亲和色谱技术与上述径向膜色谱技术结合起来将会形成一种新型的分离技术，我们称之为径向亲和膜色谱技术，它兼有径向膜色谱技术流速快、处理量大、易线性放大和亲和色谱技术高选择性的优点。是一种非常有潜力的分离技术。纤维素的非特异性吸附较小，有合适的孔径结构，它可以通过酯化、醚化、氧化等方法，把活性基团或亲和配基引入纤维素骨架上而制成纤维素亲和介质，但这几种方法只能在不破坏纤维素结构的情况下得到很有限的结合容量，使得相应的柱子的柱容量很小，给这类介质在径向色谱柱中的应用带来困难。
本发明的目的是提供一种适于生物大分子的选择性分离纯化采用的径向色谱柱填料一金属螯合型亲和介质的合成方法，该合成方法利用的原料便宜易得、反应条件简单，易控制。
本发明的径向色谱柱用金属螯合色谱介质的合成方法，是采用以甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到聚合物，再与纤维素进行接枝反应，然后加入亚氨二乙酸作为螯合配基进行开环反应，最后加入金属离子溶液进行反应的过程，自聚和接枝反应在水介质中进行，反应温度为50～90℃。并在上述反应中加入引发剂，例如偶氮二异丁腈，正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为聚合单体重量的1～5％。此外，上述反应中螯合配基亚氨二乙酸酸开环反应控制在pH为8～13，反应温度为40～80℃，并可通过加入无机盐，例如氯化钠或硫酸钠作为开环反应促进剂来提高开环反应的转化率，以提高所合成的螯合介质上的配基浓度。开环反应的母液可循环套用。上述反应过程中的其它过程，匀可参照公知的技术进行。具体地说，本发明的合成方法按下步骤进行1.甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应合成聚合物；2.纤维素与聚合物进行接枝反应3.加入螯合试剂进行开环反应；4.加入过渡金属离子(如Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ni2+等)溶液进行螯合反应。
在上述1，2反应中，控制反应温度为50～90℃，自聚反应时间0.5～2小时，接枝反应时间为0.5～2.5小时。反应在去离子水中进行。在反应过程中，为提高聚合产物与纤维素的接枝反应产物上的环氧含量，(甲基)丙烯酸环氧丙酯的用量应当过量，反应物按(重量)纤维素(甲基)丙烯酸环氧丙酯＝1∶2～10加入。同时为加速反应，可加入引发剂以诱发反应，如可采用阴离子聚合反应的引发剂偶氮异丁腈、正丁基锂或硫代硫酸钠与过硫酸铵，引发剂的加入量为聚合单体的1～5％。开环反应温度控制在40～80℃，反应时间可根据所需获得的配基浓度控制在0.5～8小时。开环反应在弱碱性介质中进行，pH值控制在8～13。开环物即螯合配基，如亚氨二乙酸(IDA)的加入量应超过聚合接枝后改性纤维素上的环氧基团的量，以1～5∶1为宜。为进一步提高连接到改性纤维素上的螯合配基的浓度，可向反应混合物中加入适量的无机盐，如氯化钠，硫酸钠等，无机盐的加入重量为纤维素量的1～10％，反应后的母液经过滤后可循环套用，以降低成本。下面通过实例对本发明的合成反应给予进一步的说明。
实例1.亚氨二乙酸型(IDA)金属螯合介质的制备亚氨二乙酸型金属螯合介质的合成过程按下述化学反应进行
在上述开环反应3中，开环反应物为亚氨二乙酸(IDA)，反应中以2mol/1的碳酸钠溶液控制反应混合物的pH＝8～13，反应温度控制在40～80℃，无机盐的加入量为反应液总体积的1～5％。实验过程为，在装有搅拌器，温度计及冷凝器的5立升三口烧瓶中加入65克短棉纤维，3000毫升去离子水，搅拌下升温至80℃，充分搅拌均匀，随后加入300毫升的甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌10分钟后，再加入含过硫酸铵和硫代硫酸钠各10克的混合溶液作引发剂，保温反应2小时，然后降温至70℃，加入亚氨二乙酸溶液进行开环反应，并用碳酸钠溶液调节反应混合物的pH＝8～13，保温反应1～8小时，停止反应后，用大量去离子水洗至中性，然后用丙酮或乙醇浸泡，洗去改性纤维素表面的残余物，再用大量去离子水洗。加入2％(重量/体积)的硫酸铜溶液，搅拌～2小时，过滤，用大量去离子水洗至无铜离子。真空干燥，所得改性纤维素的接枝率为140％(重量)，用氮元素分析法或原子吸收光谱法测定金属螯合介质的配基浓度为150μmol/g干介质。螯合反应4也可以在纤维素介质做成膜以后再进行。
实例2金属螯合介质的应用将实例1中所制备的IDA型铜离子螯合介质用造纸技术制成纸状膜，填充到径向(或轴向)色谱分离柱中，用含1mol/l氯化钠的0.05mol/l磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)平衡柱子，对牛肝过氧化氢酶粗品溶液(1000U/mg蛋白)上样进行分离，用含1mol/l氯化钠的0.01mol/l咪唑洗脱，纯化后的牛肝过氧化氢酶的纯度提高了7倍，回收率达70％。螯合介质经0.005mol/l EDTA-NaCl再生后，可多次反复使用，分离性能保持稳定。
由上述实例，采用本发明提供的合成方法可以方便地制备径向(或轴向)色合成的螯合介质对蛋白质或酶的结合容量大，易于再生，可反复多次使用。应用该螯合介质填充的径向(或轴向)色谱柱可对许多表面富有组氨酸、半光氨酸、色氨酸等残基的蛋白质或酶，例如，血清白蛋白，免疫球蛋白、尿激酶、过氧化物酶等进行选择性分离纯化，不仅处理量大、流速快、保持活性好，而且选择性较好，纯化倍较高。本发明为径向色谱介质增添了新的种类，所提供的径向金属螯合亲和膜色谱介质的合成方法是一种很有工业应用前景的生化分离技术。
权利要求
1.一种径向色谱柱用金属螯合色谱介质的合成方法，其特征在于是采用以甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到聚合物，再与纤维素进行接枝反应，然后加入亚氨二乙酸作为螯合配基进行开环反应，最后加入金属离子溶液进行反应的过程，自聚和接枝反应在水介质中进行，反应温度为50～90℃。
2.按权利要求1所述的合成方法，其特征在于反应物甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的用量应当过量，反应物重量按甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯，纤维素＝2～10∶1比例。
3.按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于反应中加入引发剂，偶氮二异丁腈、正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为聚合单体重量的1～5％。
4.按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于螯合配基亚氨二乙酸酸开环反应控制在pH为1～13，反应温度为40～80℃。并可通过加入无机盐，例如氯化钠或硫酸钠作为开环反应促进剂来提高开环反应的转化率，以提高所合成的螯合介质上的配基浓度，开环反应的母液可循环套用。
5.按照权利要求4所述的合成方法，其特征在于螯合配基亚氨二乙酸的加入量应超过聚合按枝后改性纤维素上的环氧基的量，其比值为1～5∶1。
6.按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于开环反应加入无机盐氯化钠或硫酸钠作开环反应促进剂，其加入重量为纤维素量的1～10‰。
7.按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于加入过渡金属离子Cu2+，Zn2+，Fe3+或Ni2+溶液进行螯合反应。
全文摘要
径向色谱柱用金属螯合亲和膜色谱介质的合成方法是利用甲基丙燃酸环氧丙酯进行自聚反应制得聚合物后与棉纤维进行接枝反应,然后与亚氨二乙酸进行开环反应,最后过渡金属离子进行螯合反应。该方法利用的原料便宜易得,反应条件简单,易控制,制得的螯合介质的结合容量大。应用该介质填充的径向色谱柱对人血清白蛋白、过氧化氢酶、尿激酶等生物大分子进行分离纯化处理,具有处理量大、流速快、纯化倍数高、便于线性放大等优点。
文档编号G01N30/38GK1188681SQ9710505
公开日1998年7月29日 申请日期1997年1月24日 优先权日1997年1月24日
发明者杨利, 贾凌云, 郭玉夙, 邹汉法, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所