专利名称：冠痉挛相关性疾病的诊断的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于诊断特定疾病的技术，具体地讲，涉及冠痉挛相关性疾病基因的筛选方法。
背景技术：
生物体内的一氧化氮(生物体内NO)是近年来在生物体内鉴定出的一种物质，能作为血管扩张物(18-25)、神经递质(11，12)或免疫反应物(13-17)而起作用。生物体内的NO由L-精氨酸合成，其合成至少与三种一氧化氮合成酶(nitric oxide synthasenos)，即神经型NOS，血管内皮型NOS及巨噬细胞型NOS中的一种类型相关。神经型NOS和血管内皮型均为构成型，依赖于细胞内钙浓度的升高活性增大。而巨噬细胞型NOS为钙非依赖性，炎症时活化。最近有些人证明了血管内皮型NOS(endothelial cell nitric oxide synthaseeNOS)的基因构造，报道eNOS基因位于第7号染色体的7q 35-36，有26个外显子，长度为21kb。(18-25)。
发明公开冠状动脉痉挛(冠痉挛)能引起冠痉挛性心绞痛或变异型心绞痛，对于其它广泛的缺血性心脏病，冠痉挛是引起发病的一主要因素(1-6)。但是冠痉挛的机制还不十分明确。
如若阐明冠痉挛的机制，就能早期诊断。治疗与冠痉挛相关的缺血性疾病，考虑到这些，于是进行了许多研究。作为冠痉挛的机制，目前的报道中，多侧重于平滑肌的过度收缩性(hyper-contractility)而非血管内皮损伤(35)。
乙酰胆碱作用到平滑肌能使之收缩，内皮正常时，内皮细胞分泌一氧化氮(NO)，分泌的NO作用于血管平滑肌能使之扩张。但是，在冠痉挛性心绞痛的病例中，冠状动脉内施与乙酰胆碱，血管没有扩张而诱发了冠痉挛(7，8)，着眼于该事实，本发明人已证明了这样一点，在冠痉挛性心绞痛的病例中，乙酰胆碱诱发的NO基础分泌低下(10)。
另外，硝酸甘油和亚硝酸制剂在生物体内形成NO，扩张血管，预先抑制了NO合成的血管对亚硝酸制剂的反应过度敏感(9)，冠痉挛性心绞痛的冠动脉对硝酸甘油的反应过度敏感(6)，由此认为冠痉挛性心绞痛的冠状动脉中NO的基础分泌低下。由以上结果我们认为冠痉挛与NO，具体讲，冠痉挛与分泌NO的内皮间有密切关系。到目前为止，从NO基础分泌低下这一事实来探讨冠痉挛和分泌NO内皮间关系的报道尚未见到。
另一方面，日本人冠痉挛的发病率比欧美人高(26，27)，因此认为其发病因素可能与遗传背景有关。
基于以上见解，本发明人着眼于合成生物体内NO的NOS中的血管内皮型一氧化氮合成酶(endothelial cell nitric oxide synthaseeNOS)基因，探讨它是否与冠痉挛的发病相关，得出结果完成本发明。发明概要本发明涉及冠痉挛相关性疾病基因的筛选方法，其特征在于判断血管内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因的核苷酸变化中有无下面1种或2种以上的变化eNOS基因cDNA的894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)以及774位的胞嘧啶变为胸腺嘧啶(T)，以及eNOS基因5′侧翼序列的核苷酸变化-786位的胸腺嘧啶(T)变为胞嘧啶(C)，-922位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G)及-1468位的胸腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A)，或者其互补链上出现相应的变化，优选的方法是判断eNOS有无出现这样2种以上的变化，eNOS基因内的变化的任何一种，以及至少一种5′侧翼序列的变化。最更优选的是冠痉挛性相关疾病为心绞痛的方法，最优选的是冠痉挛性相关疾病为冠痉挛性心绞痛的方法。
其它的方案中本发明涉及利用RFLP。通过判断有无限制性酶酶切片段筛选上述变化的方法，具体而言涉及这样的方法用PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子7的部分，用限制性酶Ban II和/或Mbo I处理其扩增片段，然后经酶处理的片段通过电泳来判断有无变化，在同样编码eNOS的cDNA上，用限制性酶FoK I处理外显子6上存在的变化、用限制性酶Msp I处理eNOS基因5′侧翼序列中-786位的变化，用限制性酶处理eNOS基因5′侧翼序列中-1468位的变化，判断是否有变化。
另外，本发明涉及实施本发明方法用的试剂盒，即涉及包含用PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子7部分用的寡核苷酸及限制性酶Ban II和/或Mbo I。用于诊断冠痉挛相关性疾病的试剂盒；包含用PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子6部分时应用的寡核苷酸和限制性酶FoK I、用于诊断冠痉挛性相关疾病的试剂盒；包含用PCR扩增eNOS基因5′侧翼序列中包括-786位部分时应用的寡核苷酸和限制性酶Msp I、用于诊断冠痉挛性相关疾病的试剂盒；包含用PCR扩增eNOS基因5′侧翼序列中包括-1468位部分时应用的寡核苷酸和限制性酶MboI、用于诊断冠痉挛性相关疾病的试剂盒。再者，本发明的试剂盒中所含扩增用寡核苷酸除用下面表1中所述的以外可用其它的，可参照eNOS基因组DNA的序列使用哪一种。
另外，本发明涉及诊断冠痉挛相关性疾病的方法，其特征在于判断有无伴随冠痉挛性相关疾病在eNOS基因上出现上述核苷酸变化中的1或2种。
附图简述
图1是用PCR-SSCP分析含eNOS基因的外显子7的DNA片段，其电泳结果转变为图面的照片。箭头表示。
图2是用含eNOS基因的外显子7的DNA片段的PCR-SSCP对变异的病例(变异型)和非变异的病例(正常型)进行直接测序的结果图。图中结果显示变异型为杂合体。
图3表示通过PCR-RFLP筛选含eNOS基因外显子7的DNA片段的结果，限制性酶用Ban II和/或Mbo I。图3A为限制性酶的示意图。图3B是将实际的电泳结果转化为图面的照片。
图4是通过PCR-RFLP筛选含eNOS基因外显子6的DNA片段，将表示其结果的电泳结果转变为图面的照片。限制性酶用FoK I。
图5为分别通过PCR-RFLP筛选含eNOS基因5′侧翼区中-786位和-1468位的DNA片段，将其电泳结果转变为图面的照片。-786位的变化用限制性酶Msp I，-1468位的变化用Mbo I。
发明公开如上所述，本发明人从eNOS基因入手，探讨它是否与冠痉挛的发病相关，结果发现下面的事实。
A)eNOS基因外显子内的变异1)外显子7的变异在编码eNOS的cDNA上，894位的鸟嘌呤(G)转变为胸腺嘧啶(T)
用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构型多样性)和直接测序法可以看到冠痉挛性心绞痛患者eNOS基因的外显子7上有点突变。其变异为GAG变为GAT，氨基酸的变异为从谷氨酸变为天冬氨酸(Glu298Asp)。该变异是在96个冠痉挛性心绞痛患者和86对照中进行筛选的，其中冠痉挛性心绞痛患者群中有22人，对照组中有7人出现这种变异，2)外显子6的变异eNOS基因的cDNA上，774位的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)用PCR-SSCP法发现在10个冠痉挛性心绞痛患者中有4人出现这种碱基替换。而在对照组的9人中没有发现这种碱基替换(P＝0.03)。并且这种替换没有造成氨基酸的变化。
B)eNOS基因5′侧翼区中的变异发现eNOS基因5′侧翼区中有几个变异，对这些变异与冠痉挛疾病的相关性进行了评价，得到以下结果。1)5′侧翼区(-786)的胸腺嘧啶(T)转变为胞嘧啶(C)用PCR-SSCP法发现123名冠痉挛性心绞痛患者中有34人(27.6％)出现这种碱基替换。而对照组的86人中只有4人(4.7％)出现这种碱基替换(P＜0.0001)2)5′侧翼区(-922)的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G)用PCR-SSCP法发现104名冠痉挛性心绞痛患者有31人(29.1％)出现这种碱基替换。而在对照组的83人中只有3人(3.6％)出现这种碱基替换(P＜0.0001)3)5′侧翼区(-1468)的胸腺嘧啶(T)腺嘌呤变为胞嘧啶(A)用PCR-SSCP法，在98名冠痉挛性心绞痛患者中发现有26人(26.5％)出现这种碱基替换。而在对照组26人中没有发现这种碱基替换(0％)。(P＜0.0006)以上所发现的eNOS基因的变异有利于冠痉挛性相关疾病的诊断。
本说明书中“冠痉挛性相关疾病”指心绞痛，尤指冠动脉痉挛性心绞痛。变异型心绞痛、不稳定型心绞痛、劳力型心绞痛、安静心绞痛、急性心梗或微小血管疾病(microvasculor disease)等。
根据本发明所证明的冠痉挛与eNOS基因的相关性，从怀疑患有冠痉挛相关性疾病的患者入手，如若确定在eNOS基因及其5′侧翼区出现上述变异，则可判定该患者存在患冠痉挛相关性疾病的很大的危险因素。这些变异中任何一个均可为冠痉挛相关疾病的指标，但若出现2个以上的变异，则为更确切的指标。此外，发现若在eNOS基因区及其5′侧翼区均出现变异，则可发生重症冠痉挛相关性疾病。
由此，本发明涉及冠痉挛相关性疾病基因的筛选方法，其特征在于判断血管内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因的核苷酸有无出现下面的1种或2种以上的变化其cDNA的894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶，774位的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，以及eNOS基因5′侧翼区核苷酸的变化为-786位的胸腺嘧啶(T)变为胞嘧啶(C)，-922位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G)，及-1468位胸腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A)，或者其互补链出现相应的变化。其互补链出现相应的变化“指，如eNOS基因核苷酸的变化中，其cDNA上894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)的时候，第894位鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)变为腺嘌呤(A)。
首先，对从患者eNOS基因及其5′侧翼序列入手的方法进行简要说明。
作为获取基因的样品，可用所有的活检样品，经典地用白细胞、肝组织活检物。用蛋白酶K-SDS对样品进行蛋白质分解、变性，之后用酚/氯仿抽提，得到基因组DNA(+RNA)。如果需要，可用RN ase去除RNA。
然后用下面的任一引物通过PCR对所得基因组DNA进行扩增。然后用以下检测核酸变异的方法证实有无变异。1)RFLP法(限制性片段长度多态性)2)PCR-SSCP(单链DNA高级构象多态性分析)3)ASO杂交法(等位基因特异的寡核苷酸杂交)将PCR产物斑点印迹于尼龙膜等支持物上，与具有待检测变异部位碱基序列，18聚体程度的合成寡核苷酸探针(要得到信号有必要进行放射性同位素或生物素标记)后，按探针Tm值洗净后可检测出1个碱基的错配(如若有错配，不发生杂交)。这是用PCR检测特定碱基替代的最典型的方法。4)测序法5)Southern印迹法这是用限制性酶处理DNA，通过电泳展开，与探针进行杂交的普通方法。基因组Southern法，PCR Southern法均可使用。后者与上面(3)的原理相同，但后者能获得迁移度的情况，因此具有精确度上的优点。6)ARMS(扩增折射突变系统)在PCR中，引物变性后，用DNA聚合酶可从5′- 3′合成模板DNA的互补链DNA，但如果引物3′末端碱基有错配，PCR的效率降低，也就是说是利用电泳中不可能观察到的物质的方法，用在引物3′末端碱基希望检测出的变异碱基的互补序列进行PCR，可以检测有无扩增产物。7)DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis，变性剂浓度梯度凝胶电泳法)该方法是利用具有PCR产物中错配的杂合子较纯合子容易解离而进行的。随着解离的进行，凝胶电泳的迁移度降低，所以展开的聚丙烯酰胺凝胶中尿素和甲酰胺的密度呈梯度分配，由此，尤需强调的是含错配的双链DNA的存在，即变异的存在就可检测出来。8)RN aseA切断法RN aseA(RNA裂解酶)的特性是不能裂解双链RNA或RNA/DNA复合体，只能裂解单链RNA。因此，如32p标记的RNA探针与单链变性的样品DNA杂交，RN aseA处理后，如若用电泳展开，由于与变异型杂交的RNA探针在错配部位被切断，所以能检测出2条带。9)化学切割法双链DNA的错配部位的“C”“T”分别用羟胺、四氧化修饰后，经哌啶处理，切断糖。利用标记的探针可形成双链，本处理后，电泳，若探针的大小变短则可检测出变异。在检测Glu 298 Asp时，若探针为正常型反向链的序列，错配为C-T，所以哪种修饰均可使用。10)连接酶法原理是用DNA连接酶连接2个寡核苷酸时，若在结合位置与模板DNA间出现错配则不能进行结合。
i)LMGD(连接酶介导的基因检测)法一边的寡DNA用如32P标记，另一边的用生物素标记，连接后，通过链霉抗生物素蛋白吸附进行回收，如若进行了连接，(即没有错配)，32P的放射量以高值显示，由此可检测出变异。
ii)LCR(连接酶链反应)用耐热性连接酶反复进行上述的连接反应，由于对与PCR同样产生的DNA链，寡DNA也发生变性，所以可高敏感度地检测变异。发明的优选实施方案1.外显子7上的变异外显子7上的变异，即编码eNOS的cDNA上，894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)，能造成从GAG到GAT的变化，形成各种不同的限制性酶部位。因此，用限制性酶也可知道有无变异。具体而言，用限制性酶Ban II、Mbo I的任一个消化所得扩增产物，可知道有无上述变异。详细地讲，若能用限制性酶Ban II酶切，可判断不存在变异，或能用限制性酶Mbo I进行酶切，可判断存在变异。
或者eNOS的cDNA上存在这样的变异，894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)，氨基酸从谷氨酸变为精氨酸(Glu 298 Asp)。因此，eNOS氨基酸序列的变化，即eNOS氨基酸序列上，298位的谷氨酸变为精氨酸，也可作为一指标。
2.外显子6上的变异外显子6上的变异，即编码eNOS的cDNA上，774位的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，形成各种不同限制性酶部位。因此，可利用限制性酶判断有无变异。具体而言，用限制性酶FoK I消化所得的扩增片段，可判断有无上述变异。详细地讲，若能用FoK I进行消化，可判断存在变异，若不能消化，则知道不存在变异。
3. 5′侧翼区的-786位的变异eNOS基因5′侧翼区的核苷酸变化，即-786位的胸腺嘧啶(T)变为胞嘧啶(C)，也可形成不同限制性酶部位。因此，用限制性酶也可判断有无变异，具体而言，用限制性酶Msp I消化所得扩增产物，可判断有无上述变异。详细地讲，用限制性酶Msp I能切割1个部位，则可知道不存在变异，若Msp I能切割2个部位，则判断存在变异。
4. 5′侧翼区-1486位的变异eNOS基因5′侧翼区核苷酸的变化，-1486位的胸腺嘧啶(T)变为腺嘌呤(A)，也可形成不同的限制性酶部位。因此，用限制性酶可知道有无变异，具体而言，用限制性酶Mbo I消化所得扩增产物，可知道有无上述变异。详细地讲，若用限制性酶Msp I能切割1个部位的话，可判断不存在变异，若Msp I能切割2个部位，则存在变异。
实施例实施例1检测eNOS基因外显子7上的变异试验对象为96例冠痉挛性心绞痛病例和86名对照病例。冠痉挛性心绞痛组的病例全部在安静时有过自然发作(男性53人、女性43人，平均61岁、33-86岁)。在所有的病例中进行心导管检查，在冠动脉造影上识别乙酰胆碱和麦角新碱诱发的冠痉挛，同时在心电图上观察到有意义的ST-T改变(7，8)。另外，在这些病例中未观察到有意义的冠动脉狭窄(＞75％)。
86名对照病例中，61人有胸痛症候群，12人有心电图异常，另外13人有轻微的瓣膜病(男性35人，女性51人，平均年龄61岁，13-83岁)。对照病例也全部进行冠动脉造影，结果，未观察到冠动脉有有意义的狭窄，将乙酰胆碱或麦角新碱冠动脉内施用给对照病例中的61名胸痛症候群和12名心电图异常者进行冠痉挛的诱发试验，均呈阴性。另外，对照病例中除外心梗，X综合症、心肌病、心功能不全。(1)用PCR-SSCP检测eNOS基因的变异(i)DNA的分离从10名典型的冠痉挛性心绞痛病例和9名对照病例的末梢采静脉血，从白细胞抽提DNA(28)。DNA的提取用DNA提取药盒DNAQUICH[大日本制药]进行。ii)PCR工程参照已报道的eNOS基因的构造(18-25)进行PCR-SSCP法(29)，对eNOS基因所有的外显子轮流施行PCR-SSCP法。
所有的引物以间夹各个外显子的形式制备到内合子中。下面表1显示了应用的所有引物。
PCR-SSCP中应用的与eNOS基因26个外显子对应的引物
1. 5′-CAGCAGAGTGGACGCACAGTAAC 15. 5′-GTGACAACCTTGTCTTTGTCC5′-TTGTTGCCCACCTGCTCCTAGCTG 5′-TCGTCAGTGGAGCTCCCTTT(217)(231)2. 5′-AACCCTTCCTGATGACCCTATCCC 16. 5′-AAAGGGAGCTCCACTGACGA5′-CTTACCCACCCTTTCCCTGGAGAC 5′-AGAATCAGGGCAGAGTGAGG(200)(284)3. 5′-TCCTGACCTTTGCACTCCCTCGA 17. 5′-AGCAAGACGCAGTGAAGCCG5′-ATGGGAAGGTCGTCACGGGGTTTC 5′-TGGCCCCAGAGTGCTTTAGT(250)(275)4. 5′-ACAACTTCCTGCTTGTCCCCTTCC 18. 5′-ACTAAAGCACTCTGGGGCCA5′-ACCCCGCTCCCCTTTTGGTA 5′-AGGGTCAGGGTGTTCAGGACA(259)(203)5. 5′-TCTGGAGCTGATACTCAAGACCCC 19. 5′-TGTCCTGAACACCCTGACCCT5′-CGCATGGGGAAAGAGCTGGTCAGA 5′-GCTGGTGTGCCCTGTTGCTT(246)(322)6. 5′-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG 20. 5′-CTCCCTGTGCACTATCCCCA5′-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC 5′-TCTAGCCCCTGTGCCTCATT(232)(329)7. 5′-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA 21. 5′-TCCAACCCACTGCATCCTGC5′-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA 5′-TGCTCCTGCTTGTTGCCTCA(248)(259)8. 5′-GCTGATCCCACACCCCAACA 22. 5′-TGAGGCAACAAGCAGGAGCA5′-TGCCTTGGACAGGTGCATTC 5′-CACCAAGTCTTCCATCTCAC(250)(202)9. 5′-TGATCACCTCTGTCCCTACCGA 23. 5′-ATGGAGTGTCTCTCCTGCCA5′-ATGCAAACCCTTTGCCTTCCTG 5′-TTCAGGCAGTCCTTTAGTGC(189)(173)10. 5′-AAGAATGGGCGAGGTCTGTGGGT 24. 5′-AGAAGAGCCTTCCCAACCCG5′-CAGGGGCTGCTTAGAATTAGAGC 5′-ATCTTCAGGTTACCATTGCG(311) (219)11. 5′-TCCCTCCCAACCCATCATCTCTCT25. 5′-CAGACCTACGTGCAGGACAT5′-AGTGGTAGGCCCAGAACACTGCT 5′-ACCTTAGCAGGAACCCCGCA(208) (276)12. 5′-CAGGACACCCTCACACCTTCCTCT26-1. 5′-GTTCTGATCCACTGTGCTCT5′-TCTTTCTAGCTCCCTGCTCCC 5′-TCTCCCGGAACTGGAAGGGA(210) (226)13. 5′-ACAGCACCCAGGACATCTGTCTTC26-2. 5′-ACACCAACAGCCCCTGAGAG5′-AGCCCCTTTCCTGGAAGTTCTCA 5′-TGGCAGTAGGCCCTGGGGTA(163) (273)14. 5′-TGATGTCAAACACTCCCCTCG 26-3. 5′-TTAATCTGGAAGGCCCCTCC5′-AAAACGGACTTGAGGCACAG 5′-GAGGGAGACTCCGTTTCAAA(178) (267)注)各引物组中上段为有义引物，下段为反义引物。
括弧内为扩增片段的碱基长度。
外显子26的分析中用3个引物对各管中制备5μl这样的溶液，包含50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-盐酸(pH8.4)、0.75mmol/L MgCl2、0.1mmol/L dNTPs、α-[32P]dCTP(0.2ml)、各种引物(5P mo1)及0.01 U Taq聚合酶(GIBCOBRL，Life Technologies Inc.，MD USA)，然后加入患者的DNA 30ng。
PCR如下进行。首先，94℃2′进行1个循环，接着94℃30″、55-58℃30″及72℃1′为1循环，进行30个循环，在4℃保存PCR扩增产物。外显子7的扩增在57℃进行。iii)SSCP步骤电泳在如下3个条件下进行室温5％的甘油凝胶，4℃5％和10％的甘油凝胶。
甘油凝胶如下制备1)丙烯酰胺和N，N′亚甲基双丙烯酰胺以49∶1进行混和的溶液5％；2)0.5×TBE(10×TBE三(羟甲基)氨基甲烷108g+硼酸55g+0.5M EDTA 40ml+水(总量至500ml)稀释到20倍)。3)在配制的5％或10％甘油溶液60ml中加入10％APS(过硫酸铵)160μl和60μl TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)，制成凝胶。iv)结果扩增外显子7的结果如图1所示。根据该结果可以看到含外显子7的片段中，在冠痉挛性心绞痛组的10人中有3人出现带位移。而在对照组中完全没有改变。(2)用直接测序法检测变异基因将在工程(1)的PCR-SSCP中判断的变异病例和正常病例的DNA再次在工程(1)的(ii)条件下进行扩增，用Wizard PCR DNA纯化系统(Wizard PCR Preps DNA Purification System，Promega，USA)进行纯化。用ABI的(USA)自动测序仪，通过直接测序法确定碱基序列。
对变异型DNA和正常DNA通过直接测序法进行分析的结果，在外显子7上可以看到eNOS cDNA的894位发生点突变，由鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)。这在变异的3例中均可证实。这种变异在eNOS氨基酸的序列上可引起从谷氨酸到精氨酸变化的错配变异(Glu 298Asp)。图2为直接测序的结果。这里显示没有变异的正常型为纯合体。(3)用PCR-RFLP筛选从G到T的变异如步骤(2)中所示，由于eNOS基因的外显子T上可发现引起Glu298 Asp突变的错义突变，所以其筛选均用冠痉挛性心绞痛病例和对照病例，即对96名冠痉挛性心绞痛病例和86名对照病例进行。该筛选用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)法。为了防止限制性酶不完全切割的错误识别，使用Ban II和Mbo I两种限制性酶[均购自宝酒造]。
根据步骤(I)和(ii)中描述的方法，扩增所有病例的eNOS基因外显子7。含外显子T的PCR扩增片段为248bp。然后将所得扩增片段按厂家的说明用Ban II和Mbo I中的任一种进行消化，将所得消化产物进行4％Nusieve GTG琼脂糖凝胶电泳，判断泳带。
结果如图3所示，可分为3类带。图3A为限制性酶图，图3B为实际电泳的照片。
如图3B所示，在非突变的野生型中用Ban II酶切形成长度为163bp和85bp的2个片段，用Mbo I酶切时可看到未切割的248bp的带型。由此可证明，非突变的野生型中有一个Ban II部位而不存在Mbo I位点。
eNOS的cDNA 894位为T/T纯合体的病例中，用Ban II不能使用进行切割(248bp)，用Mbo I可形成长度为158bp和90bp的2个片段。因此可证明纯合体病例中不存在Ban II位点，只存在一个Mbo I位点。
存在这样的病例，用Ban II时可看到形成248bp、163bp和85bp的3个带，用Mbo I时可看到形成248bp、158bp和90bp的3个带。这表明无论用Ban II和Mbo I哪个进行消化，分别在一条带上只存在一个切割位点，所以是杂合体(G/T)。
以上述3种类型为基础，对冠痉挛性心绞痛组和对照组的所有病例进行eNOS基因Glu 298 Asp突变程度的探讨。对每一病例，用上述2种酶分别进行消化，其结果，用这2种酶进行消化的结果在所有的病例中均一致。
可以看到96名冠痉挛性心绞痛病例中有22人(23％)发生Glu 298Asp突变，其中纯合体1人，杂合体21人。而在86例对照组中，有7人发生突变(8％)，均为杂合体。(4)统计分析冠痉挛与Glu 298 Asp突变及其它危险因素的关系根据Fisher′s平方概率(exact probability)，用开平方检验和非配对-t检验比较冠痉挛性心绞痛病例组和对照组病例间在步骤(3)中所得变异程度、及年龄、性别、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、肥胖度和烟草等冠痉挛危险因素的程度。另外，通过多变量分析(多元对数回归分析)探讨哪个因素与冠痉挛最相关。用SPSS Advanced Statistics 6.1fbrthe Macintosh(SPSS日本公司，日本)进行分析。如下所示单独变量用哑(dummy)变量。所有的数值用均值±SD表示。
性别；0男性， 1女性年龄；0不满60岁， 160岁以上肥胖度(body mass Index)；0不满26， 126以上胆固醇血症；0正常，1高胆固醇血症(阈值，260mg/dl)烟草； 0不吸烟者， 1吸烟者高血压；0正常血压， 1高血压(阈值160/95mmHg)糖尿病；0无糖尿病， 1有糖尿病(阈值，空腹血糖140mg/dl或OGTT为200mg/dl)开平方检验结果如下面表2所示，用fbrward stepwise selection(Wald)的检验结果如表3所示。所有的统计中P＝0.05为有意义。统计分析的结果Glu 298 Asp突变及其它危险因素年龄、性别、血压、糖尿病、高胆固醇血症、肥满度、吸烟与冠痉挛的关系亦如表2所示，性别(P＝.035)、吸烟(P＝.00001)及Glu 298 Asp突变(P＝.005)有显著性差异。表2被检患者的临床特性对照 冠痉挛p值年龄61±12 61±11.97*男性∶女性 35∶51 53∶43.035**肥满度 23.4±3.723.1±3.0 .48*高血压 29/8535/94 .39**糖尿病 15/8410/93 .13**高胆固醇血症31/8231/93 .32**烟草17/8450/95 .00001**Glu 298 Asp突变7/86 22/96 .005***非配对t-检验、**Fisher′s平方概率开平方(chi-square)检验多变量分析(多元对数回归分析)的结果如下面表3所示。与冠痉挛最相关的因素为吸烟(P＝.0005)，其次为Glu 298 Asp突变(P＝.0272)。在多元对数回归分析中未看到性别与冠痉挛的关系。
表3多元对数回归分析的结果变量 β SE Wald df 显著性差异 R Exp(β)烟草 1.2342 .3529 12.2316 1 .0005 .2120 3.4355Glu298Asp 1.0746 .4866 4.87711 .0272 .1124 2.9288常数 -.4371 .2139 4.17471 .0410 -- --
实施例2eNOS检验外显子6的变异的检测如实施例1中所描述的，从10名冠痉挛性心绞痛病例和9名对照病例中分离基因组DNA，用表1中的引物进行PCR，通过SSCP方法判断外显子6的变异。然后，进行外显子6的直接测序，可以发现eNOS基因的cDNA上774位的胞嘧啶(C)替换为胸腺嘧啶(T)。
在10名冠痉挛性心绞痛患者中有4人出现这种碱基替换，而在9名对照病例中没有发现这种碱基替换(P＝0.03)。再者，该碱基替换没有造成氨基酸的变化。
实施例3eNOS基因5′侧翼区变异的检测(1)除使用下面的引物外，实际上可按照实例1中描述的方法发现5′侧翼区(-786)的胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)。
引物-5′侧5′-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3′引物-3′侧5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′可以看到123名冠痉挛性心绞痛患者中有34人(27.6％)发生这种碱基替换，而在对照病例中，86人中只发现4人(4.7％)。(P＜0.0001)。
实施例4eNOS基因5′侧翼区变异的检测(2)除使用下面的引物外，实际上可按照实施例1中描述的方法可发现5′侧翼区(-922)的腺嘌呤(A)替换为鸟嘌呤引物-5′侧5′-TCAGTCTCTGAGGTCTCAA-3′引物-3′侧5′-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3′可看到104名冠痉挛性心绞痛患者中有31人(29.1％)出现两种碱基替换，而在对照病例中，83人中只发现3人(3.6％)。(P＜0.0001)。
实施例5eNOS基因5′侧翼区变异的检测(3)除使用下面的引物外，实际上可按照实施例1中所描述的方法发现5′侧翼区(-1468)的胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)引物-5′侧5′-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3′引物-3′侧5′-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3′
可以看到，98名冠痉挛性心绞痛患者中有26人(26.5％)出现这种碱基替换，而在对照组26名病例中未发现这种替换(0％)。(P＜0.0006)实施例6变异的筛选对上述所得5种变异，如可用ASO杂交法(单位基因特异的寡核苷酸杂交)进行大规模筛选。以下举例说明大规模筛选用的ASO杂交法1)与SSCP同样地进行PCR。该情况下最终达到20μl。反应液的组成及循环条件与实施例1中外显子7的情况相同。
2)取10μl PCR反应液于0.5M NaOH(1.5M NaCl+25mM EDTA2Na)200μl中，100μl固定于野生型用尼龙膜上，剩余的100μl固定于变异型用尼龙膜上。
3)将固定的尼龙膜分别放置到各自的杂交袋中，加入预杂交液(3×SSPE，5×Denhart′s试剂，0.5％SDS，1μg/μl鲑鱼精DNA)，65℃培养2小时。
4)加入32P标记的正常型探针(5×106dpm/ml)和5倍量的非标记异常型探针，或在另一袋中加入32P标记的异常型探针(5×106dpm/ml)及5倍量的非标记正常型探针。
5)在60℃温育各袋30′，然后温度从60℃降低到X℃(实施例3中53℃、实施例4中50℃、实施例5中46℃)。边降低边温育1小时。
6)从袋中取出尼龙膜，在2×SSPE(0.1％SDS)中室温下温育10分钟，2次，然后在5×SSPE(0.1％SDS)中X℃温育10分钟，1次。
7)将尼龙膜包于聚乙烯包装纸中，覆盖X光胶片，显影(放射自显影)。
实施例7eNOS基因外显子6和5′侧翼区上变异的筛选用实施例2、3和5中所示的直接测序法，可以发现eNOS基因的cDNA上，外显子6的774位胞嘧啶(C)替换为胸腺嘧啶(T)，或其5′侧翼区的-786位胸腺嘧啶(T)替换为(C)，同样5′侧翼区的-1468位由胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)。按照下面的条件用PCR-RFLP法筛选这些变异。另外，PCR中应用的寡核苷酸和扩增条件如下表4、表5所示。表4PCR扩增时应用的碱基序列特异的寡核苷酸(a)外显子65′-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG-3′(有义)5′-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC-3′(有义)(b)侧翼区(-1468)5′-CTCCAGCCCCTCAGATGA-3′(反义1)5′-TCCAGCCCCTCAGATGG-3′(反义2)5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′(有义)(c)5′侧翼区(-786)5′-AATGAGTCATCCTTGGTCATG-3′(反义)5′-GGGTTTGTAGTTCTGTGT-3′(有义1)5′-GGGTTTGTAGTTCTGTGC-3′(有义2)表5PCR扩增条件扩增区域温度(℃) 时间(秒) 循环变性退火延伸 变性退火延伸外显子6 94 63 72 60 60 60 325′侧翼区 94 58 72 45 75 60 325′侧翼区 94 60 72 45 75 60 32PCR缓冲液组成10mM Tris-HCl pH9.0，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.1％Triton X-100，0.5mM各PCR引物，200mM脱氧核苷酸及0.5U Taq聚合酶达25μl。
用PE公司制造的DNA热循环仪480控制温度。(1)外显子6上的变异基本上依照实例(1)中步骤(2)描述的方法应用表4中的引物和表5中的扩增条件来扩增样品eNOS基因的外显子6。按照厂家说明用FoK I消化所得扩增片段(232bp)、之后，进行10％聚丙烯酸胺凝胶电泳。确认类型。因为只有变异型基因可用FoK I消化，所以可分别证实C/C纯合体为232bp带，C/T杂合体为232bp、133bp、99bp的带，T/T纯合体为133bp、99bp的带。由PCR-RFLP筛选的结果如图4所示。
(2)5′侧翼区域-786位的变异基本上依照实施例(1)中步骤(2)描述的方法，用表4的引物和表5的扩增条件来扩增样品5′侧翼区含-786位变异的部分。按照厂家的说明用MSPI消化所得扩增片段(354bp)，之后，经10％聚丙烯酸胺凝胶电泳，确认带型。正常型基因(T)的纯合体中Msp I在一个位点进行消化，产生196bp和158bp两条带。而变异型基因(G)的纯合体中Msp I在2个位点进行消化，所以产生158bp、154bp、44bp三条带。由PCR-RFLP进行筛选的结果如图5所示。
(3)5′侧翼区-1468位的变异基本上按实施例(1)中步骤(2)描述方法，用表4的引物和表5中的扩增条件对样品中含5′侧翼区-1468位变异的部分进行扩增。按照厂家说明用Mbo I对所得扩增片段进行消化，之后，经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认带型。正常型基因(T)的纯合体中，Mbo I在1个位点消化，产生515bp和112bp 2条带。而变异型基因(A)的纯合体中，Mbo I有两个消化位点，产生515bp、61bp、41bp三条带。由PCR-RFLP进行筛选的结果如图5所示。
(4)5′侧翼区-992位的变异该变异的检测用PCR-SSP(序列特异的引物)法进行。以-922位的A或G作为3′方向延伸的起点，上下游方向各设计2种引物(共4种)。该引物与表4中的(b)和(c)相同。使与这些引物配对的有义或反义引物(2种)分别在扩增区域包含-1468位、-786位的变异部位。这些PCR的时候，-922位为A/A纯合体时只能用3′侧起点为A或T(互补序列)的引物进行扩增，A/G杂合体时能用所有的引物进行扩增，G/G的纯合体时只能用3′起点为G或C(互补序列)的引物。
所得扩增片段与上面(2)和(3)中所得到扩增片段相同。在检测所得扩增片段时，在某种检测体中可发现-922位为A(正常型)等位基因(ァレル)来源的上述(2)的扩增片段(354bp)，只能是786位的碱基为T的正常型，而-922位为G(异常型)的等位基因来源的上述(2)的扩增片段(354bp)，只能是-786位的碱基为G的异常型。同样，-922位为A(正常型)的等位基因来源的上述(3)的扩增片段(627bp)，只能是-1468位碱基为T的正常型，而-922位为G(异常型)的等位基因来源的上述(3)的扩增片段(672bp)，只能是-1468位碱基为A的异常型。由此可以证实，5′侧翼区内的上述变异，以某种形式全部连锁在同一等位基因上，这表明只要能检测出3个部位中的任一部位的突变，就有可能预测出其它两个部位有无突变。讨论如上所述，本发明人建立这样的假设，eNOS基因变异NOS活性下降，这是否与冠动脉痉挛相关呢？对此进行了实验。假若这一观点成立，与冠痉挛大多由一枝发展到多枝的事实相符合(8)。另外，虽然Marsden等已报道了实例1中发现的Glu 298 Asp突变(24)，但他们根本没查明其意义。
实施例1中可看到，Glu 298 Asp突变在冠痉挛性心绞痛组中为23％、而对照组为8％，冠痉挛性心绞痛组与对照组比较，其程度呈显著性增高，另外多变量分析的结果也表明冠痉挛与Glu 298 Asp突变间有显著性相关。
但是这种突变率占冠痉挛病例的23％，而对与冠痉挛病例的剩余77％来说，其它因素可能与其成因密切相关。实施例1中是以eNOS外显子7中的突变为指标的，但与该变异不同的、eNOS其它区域(启动子区域和内含子区域等)是否也有变异，在这一假设之下重复了实验，查明了这一事实(实例2～5)。因此，如果详细研究调查这些变异的相关性，那么冠痉挛性相关疾病就能更准确地诊断。
或者还不仅eNOS基因，还可能有其它的基因为冠痉挛的成因，进一步讲，除基因这一重要因素之外，应考虑到环境因素与冠痉挛的关系。这是由于家族性冠痉挛病例较少。在实施例1中也表明吸烟是冠痉挛的危险因素。该经验与其它的报道一致(30，31)。这次，多元对数回归分析的结果显示，在包含突变在内的所有实验因素中，吸烟是冠痉挛的最重要因素，这表明环境因素在冠痉挛的成因上是极其重要的。其中的研究者也指出吸烟能引起内皮损伤(32，33)。
对照组中有8％的病例出现Glu 298 Asp突变(786人，实施例1)。其具体的理由尚不明确，但发现突变的7人中有6人为非吸烟者，因此这些病例中吸烟不是带来严重影响的危险因素。还有一个理由我们认为冠痉挛的诊断有困难。总之，有一些理由看漏了冠痉挛，有可能将冠痉挛病例列入对照组。理由如下1)发作大多在深夜-早晨发生，通常在白天不发生的就容易漏诊。
2)即便冠动脉内施与乙酰胆碱，通常不限于能诱发冠痉挛，乙酸胆碱诱发的冠痉挛大多依赖与冠痉挛性心绞痛的“disease activity”(疾病的活动性)。
3)2/3以上的冠痉挛发作为静止的(无症状)4)即便检查结果判断是不是冠痉挛心绞痛，但将来有可能出现冠痉挛。相反，冠痉挛性心绞痛的诊断为通过进行冠动脉造影，确实证实为冠痉挛，达到确切诊断的病例。
本发明的初衷是不仅说明环境因素而且说明遗传的重要因素与冠痉挛病因的关系，以提供更好地冠痉挛型相关疾病的诊断。
以下列出了本发明说明书中引用的文献名。参考文献1)Hillis LD，Braunwald E，冠状动脉痉挛。新英格兰医学杂志。1978；299695-7022)Conti CR.冠状动脉痉挛和心肌梗塞。新英格兰医学杂志。1983；309238-2393)Yasue H，Omote S，Takizawa A，Nagao M.局部缺血性心脏病中的冠状动脉痉挛及其病理学。循环研究综述。1983；52(Supple 1)147-1524)Maseri A，Davies G，Hackett D，Kaski JC.冠状动脉痉挛和血管收缩。区别事实。循环。1990；811983-19915)Yasue H，Nagao M，Omote S，Takizawa A，Miwa K，Tanaka S.冠状动脉痉挛和由换气过度及tris缓冲液灌注引起的prinzmetal氏变异型心绞痛。循环。1978；5856-626)Yasue H，Omote S，Takizawa A，Nagao M，Miwa K，Tanaka S.Prinzmetal氏变异型心绞痛患者锻炼容量的周期性心脏变化(Circadianvariation)。锻炼诱导的冠状动脉痉挛的作用。循环。1979；59938-9487)Yasue H，Horio Y，Nakamura N，Fujii H，Imoto N，Sonoda R，Kugiyama K，Obata K，Morikami Y，Kimura T.在变异型心绞痛患者中用乙酸胆碱诱导冠状动脉痉挛副交感神经系统在冠状动脉痉挛病理机制中的可能作用。循环。1986；74955-9638)Okumura K，Yasue H，Horio Y，Takaoka K，Matsuyama K，Kugiyama K，Fujii H，Morikami Y.变异型心绞痛患者中的多心管冠状动脉痉挛，冠内乙酰胆碱注射研究。循环。1988；77535-5429)Moncada S，Plmer RM，Higgs EA.一氧化氮，生理学，病理生物学和药理学。药理学综述。1991；43109-14210)Yasue H.冠痉挛的病理学和临床特征。JJap Soc InternMed.1995；841407-141511)Bredt DS，Hwang PM，Glatt CE，Lowenstein C，Reed RR，SynderSH.与细胞色素P-450还原酶结构相似的一氧化氮合成酶的颗粒和表达。自然。1991；351714-71812)Nakane M，Schmidt HHW，Pollock JS，Forstermann U，Murad F.克隆的人脑一氧化氮合成酶在骨骼肌中的高表达。FEBS Let。1993；316175-18013)Lyons，CR，Orloff GJ，Cunningham JM.从小鼠巨噬细胞系分子克隆和功能表达可诱导的一氧化氮合成酶。1992；2676370-637414)Xie Q，Cho HJ，Calaycay J，Mumford RA，Swiderek KM，Lee TD，Ding A，Troso T，Nathan C.从小鼠巨噬细胞克隆和特征描述可诱导的一氧化氮合成酶。科学。1992；25625-22815)Lowenstein CJ，Glatt CS，Bredt DS，Synder SH.与大脑酶相比克隆和表达的巨噬细胞一氧化氮合成酶。美国国家科学院院刊。1992；896711-671516)Geller DA，Lowenstein CJ，Shapiro RA，Nussler AK，Di Silvio M，Wang SC，Nakayama DK，Simmons RL，Snyder SH，Billiar TR.来自人肝细胞的可诱导的一氧化氮合成酶的分子克隆和表达。美国国家科学院院刊。1993；903491-349517)Chartrain N，Geller D，Koty P，Sitrin N，Nussler A，Hoffmann E，Billiar T，Hutchinson N，Mudgett J.人可诱导的一氧化氮合成酶基因的分子克隆，结构，和染色体定位。生物化学杂志。1994；2696765-677218)Lamas S，Marsden PA，Gordon KL，Tempst P，Michel T.内皮一氧化氮合成酶不同的组成型酶异构体的分子克隆和特征描述。美国国家科学院院刊。1992；896348-635219)Sessa，WC，Harrison JK，Barder CM，Zeng D，Durieux ME，DAngelo DD，Lynch KR，Peach MJ.编码内皮细胞一氧化氮合成酶的cDNA的分子克隆和表达。生物化学杂志。1992；26715274-1527620)Nishida K，Harrison DG，Navas JP，Fisher AA，Docery SP，Uematsu M，Nerem RM，Alexander RW，Murphy TJ.组成型牛主动脉内皮细胞一氧化氮合成酶的分子克隆和特征描述。临床研究杂志。1992；902092-209621)Janssens SP，Shimouchi A，Quetermous T，Bloch DB，Bloch KD编码人内皮来源的松弛因子/一氧化氮合成酶的cDNA的克隆和表达。生化杂志。1992；26714519-1452222)Marsden PA，Schappert KT，Chen HS，Flowers M，Sundell CL，Wilcox JN，Lamas S，Michel T.人内皮一氧化氮合成酶的分子克隆和特征描述。FEBS Letter 1992；307287-293
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1.冠痉挛性相关疾病基因的筛选方法，其特征在于判断有无出现选自下组的任一种或二种以上伴随冠痉挛性相关疾病的血管内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因核苷酸的变化其cDNA 894位的鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)，以及774位的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，以及eNOS基因5′侧翼区核苷酸的变化-786位的胸腺嘧啶(T)变为胞嘧啶(C)，-922位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G)，及-1468位的胸胞嘧啶(T)变为腺嘌呤(A)，或者其互补链上出现相应的变化。
2.权利要求1的方法，其特征在于判断有无eNOS基因内的任一种变化及有无其5′侧翼区的至少一种、二种以上变化。
3.权利要求1或2的方法，其中冠痉挛性相关疾病为心绞痛。
4.权利要求3的方法，其中冠痉挛性相关疾病指冠痉挛性心绞痛。
5.权利要求1的方法，其特征在于通过PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子7的部分，用限制性酶Ban II和/或Mbo I处理其扩增片段，然后将经酶处理的片段进行电泳，由此来判断有无变化。
6.用于诊断冠痉挛相关疾病的试剂盒，它包括用PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子7部分时用的寡核苷酸和限制性酶Ban II和/或Mbo I。
7.权利要求1的方法，其特征在于通过PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子6的部分，用限制性酶FoK I处理扩增片断，然后将经酶处理的片段进行电泳来判断有无变化。
8.用于诊断冠痉挛性相关疾病的试剂盒，它包括用PCR扩增编码eNOS的cDNA上相当于外显子6部分时应用的寡核苷酸和限制性酶FoKI。
9.权利要求1的方法，其特征在于通过PCR扩增eNOS基因5′侧翼区中包含-786位的部分，用限制性酶Msp I处理扩增片段，然后将经酶处理的片段进行电泳来判断有无变化。
10.用于诊断冠痉挛相关疾病的试剂盒，它包括用PCR扩增eNOS基因5′侧翼区中包含-786位部分时应用的寡核苷酸和限制性酶Msp I。
11.权利要求1的方法，其特征在于通过PCR扩增eNOS基因5′侧翼区中包含-1468位的部分，用限制性酶Mbo I处理其扩增片段，然后将经酶处理的片段进行电泳，以此来判断有关变化。
12.用于诊断冠痉挛相关疾病的试剂盒，它包括用PCR扩增eNOS基因5′侧翼区中包含-1468位部分时应用的寡核苷酸和限制性酶MboI。
13.冠痉挛性相关疾病的诊断方法，其特征在于判断有无权利要求1中伴随冠痉挛相关疾病的任一种或二种以上的eNOS基因核苷酸的变化。
全文摘要
一种筛选冠痉挛相关疾病基因的方法,它包括判断内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因中特异核苷酸替代的发生。该方法有利于冠痉挛相关性疾病,如冠状动脉痉挛性心绞痛的诊断,而这用现有的方法尚不能方便地进行诊断。
文档编号G01N33/48GK1202205SQ96198281
公开日1998年12月16日 申请日期1996年11月13日 优先权日1995年11月13日
发明者泰江弘文, 吉村道博 申请人:盐野义制药株式会社