自体免疫疾病的诊断方法

专利名称：自体免疫疾病的诊断方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及一种诊断自体免疫疾病的新方法。具体地说，本发明涉及通过免疫检测存在于人类和动物组织或细胞中的抗微管组织中心(下文称之为“MTOC”)、和/或从MTOC延伸出的微管和/或伴随蛋白的抗体，来诊断自体免疫疾病的新方法。
2.现有技术的描述自体免疫疾病是一种引起抗内源性物质而不是异源物质的抗体形成的免疫系统紊乱。可将这种疾病划分为两类全身性风湿病和器官特异性自体免疫疾病。所述的全身性风湿病可被再划分成许多种类，包括全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎等等。
类风湿性关节炎是一种极为常见的疾病，发现在全世界1-5％的人中患有这种病。这种疾病的典型症状包括清晨四肢僵硬、手和脚的关节疼痛。
因为人们至今对类风湿性关节炎的病因还不了解，因此难以确切诊断并成功治疗该病。
直到如今，人们一直依靠检测类风湿因子来诊断类风湿性关节炎。然而，并不是在所有患有该疾病的患者中能检测到类风湿因子，而且有约5-20％的正常人显示阳性结果。(ARA辞典委员会，类风湿性关节炎字典11，诊断检验，17页，1985)为解决这些问题，人们研制开发出了抗-角质素抗体、抗-核周因子抗体和抗-RA-33抗体。这些抗体提高了类风湿性关节炎诊断的特异性。然而，敏感性仍然很低，难以在实际中应用。
具体地说，ANA试验(抗-核抗体试验)一直是用来诊断自体免疫疾病的最广泛的试验。但是，采用HEp-2细胞系的传统的ANA试验主要针对于全身性红斑狼疮的检验。因此，为诊断类风湿性关节炎，必需对类风湿因子进行独立的检测。
本发明的发明人曾经发现在诊断自体免疫疾病方面，巨噬细胞比传统的HEp-2细胞更为有用，并成功地构建了巨噬细胞系。该构建成的细胞系被命名为“IT-1”，并根据布达佩斯条约保藏于位于韩国汉城的Yonsei大学的韩国微生物保藏中心，保藏号为KFCC10772。
本发明的发明人继续深入研究的结果是，他惊奇地发现患有类风湿性关节炎患者的体液中特征性地含有抗微管组织中心(“MTOC”)和/或自该中心延伸出的微管(“MT”)的抗体。
本发明概述因此，本发明的目的在于为诊断自体免疫疾病提供一种具有高度特异性和敏感性的方法。
本发明的另一目的在于提供一种诊断自体免疫疾病的新方法，该方法包括下列步骤使怀疑患有自体免疫疾病个体的体液样品和任意的活组织或细胞系接触；以及检测MTOC和/或MT和/或伴随蛋白是否已经与体液内的抗-MTOC-MT抗体发生了反应。
本发明也提供了一种通过采用组织或细胞，同时检测抗-核抗体、抗-细胞质抗体和抗-MTOC-MT抗体的方法。
本发明还进一步提供了一种包括下列步骤的诊断自体免疫疾病的方法制备在其上固定有组织或细胞的载玻片；制备怀疑患有自体免疫疾病个体的体液样品；使该体液样品和载玻片上的组织或细胞接触并在一定的温度下温育一定的时间；以及检测对所述组织或细胞内的MTOC、MT或伴随蛋白产生应答的抗-MTOC-MT抗体的存在。
附图的简要描述结合附图对本发明作进一步详细的描述，在所述的附图中

图1是一幅荧光显微镜照片，该照片显示了采用IT-1细胞的间接免疫荧光技术检测到的抗-MTOC-MT抗体。MTOC位于IT-1细胞核的附近，并且可以看到从该MTOC延伸长出线样的MT。
对于本领域的技术人员而言，本发明的上述和其他目的、特征和应用通过下文的阐述将是显而易见的。本发明的详细描述本发明基于发明人的令人吃惊的发现，即患有类风湿性关节炎患者的体液中特征性地含有抗微管组织中心(“MTOC”)和/或自该中心延伸出的微管(“MT”)和/或伴随MTOC和MT的蛋白质的抗体。MTOC、MT和伴随蛋白质存在于动物(包括人在内)的所有的组织和细胞中。而且，认为MTOC、MT和伴随蛋白很可能也存在于昆虫体内。
在本申请的上下文中用的术语“抗-MTOC-MT”抗体的意思是指并包括抗MTOC、MT、伴随MTOC的蛋白质和伴随MT的蛋白质的所有抗体。这一点是基于这样一个事实，即患有自体免疫疾病患者的体液中的自体抗体可与MTOC、MT和伴随蛋白中的一种、两种或所有蛋白发生免疫应答反应。在此，所述的抗体是自体抗体，并存在于患有自体免疫疾病患者特别是患有类风湿性关节炎患者的体液内。
本发明对用来作为MTOC、MT和伴随蛋白源与患有自体免疫疾病的患者的抗-MTOC-MT抗体发生反应的组织和细胞的来源和种类没有特别的限制。MTOC、MT和伴随蛋白存在于人、动物如大鼠、小鼠、兔子、牛和昆虫的所有组织和细胞中。至于组织和细胞的种类，为了简单和容易使用的目的，可采用任何已建立的组织和细胞系。例如，可优先采用IT-1细胞系(KFCC 10772)--本发明人建立的一种巨噬细胞系。或者采用人癌细胞如HEp-2(保藏于ATCC，保藏号为CCL 23，并可自市售购得)。特别是最好采用IT-1细胞系，因为该细胞系能够更为准确和清楚地检测出自体免疫疾病患者的MTOC和MT。
而且，为了应用起来更便捷，可将组织和细胞固定在载玻片上。将人组织或细胞固定在载玻片上可通过采用常规的方法进行。本领域的技术人员可毫不费力地选择出时间、温度和固定液等参数，并且这些参数并不限制本发明。关于固定液，可采用有机溶剂如乙醇、丙酮或甲醇以及交联剂如聚甲醛或戊二醛，这些试剂可单独使用或混合使用。
在将组织或细胞固定到载玻片上的时侯，为了容易和清楚地得到结果可对组织或细胞进行处理以去掉其细胞壁。为达到该目的，可采用表面活性剂如Triton-XTM。
组织或细胞内的MTOC、MT和/或伴随蛋白和患者的抗MTOC-MT抗体之间的免疫反应的结果，可通过采用用来检测免疫反应的任何常规技术来检测。例如，可采用间接免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析技术来检验。
直到如今，还必须进行两项或两项以上的试验例如ANA(抗-核抗体)试验和类风湿因子试验，才能获得自体免疫疾病诊断的可靠结果。与此相反，本发明允许采用已建立的细胞系如人巨噬细胞IT-1或人癌细胞HEp-2，将它们用作人组织或细胞不仅来检测抗-MTOC-MT抗体而且还可同时检测抗-核抗体，因此使该方法能检测包括类风湿性关节炎在内的更宽范围的自体免疫疾病。
患有自体免疫疾病的患者的体液包括(但不限于)血液样品如全血、血清、血浆、滑液、脑脊液或胸膜渗液。
下文将对采用组织或细胞系诊断类风湿性关节炎的方法进行更为详细的描述。
制备组织或细胞系被固定在其上的载玻片。将一系列两倍稀释的类风湿性关节炎患者的体液(从1∶20～1∶1280倍稀释)(每滴30微升)滴到载玻片上。在室温和高湿度下反应约30分钟后，将载玻片置于含有磷酸盐(PBS)缓冲液的Copran罐中，在振摇器上以200 rpm的速率振荡，洗涤并干燥该载玻片。将结合有荧光素的多价抗-人免疫球蛋白(Dako)按1∶40的稀释液30微升滴加到载玻片上，然后使之在室温和高湿度下反应约30分钟。载玻片在用PBS洗涤后，用0.2％的伊凡斯蓝(Sigma)对载玻片进行复染并用PBS洗涤。
用吸水纸将过量的缓冲液除去，将PBS-甘油溶液加到载玻片上，并置于荧光显微镜下观察。
在细胞核附近观察到圆形或环形的MTOC的荧光图象。还观察到从所述的MTOC延伸出的线样的MT(图1)。这样的图象分别是MTOC和MT的形态学特征。(细胞的分子生物学，第三版，Garland，789-795页)。
在自体免疫疾病特别是类风湿性关节炎患者的体液中检测到的抗体被认为是抗MTOC、MT和伴随蛋白的抗体。本发明人将图1中的荧光图象命名为“核周带有骨架的单个大颗粒”，该图象是类风湿性关节炎的特征。
本发明的优选实施方案本发明将由下列实施例来体现。然而，提供这些实施例仅是为了描述本发明的目的而不能将它们看成是对本发明范围的限制，所附的权利要求对本发明的范围做了适当的描述。实施例中的份数或百分数均是重量份或重量百分数，除非另有说明。实施例1将培养在补加有10％牛血清的RPMI-1640中的IT-1细胞(KFCC10772)2×104个细胞/毫升加到载玻片的孔中。细胞在5％CO2的气氛下于37℃在培养箱中培养24小时。将载玻片孔中的培养基去除，载玻片用PBS洗涤并将之浸入丙酮-甲醇(1∶1)的混合物中，固定5分钟。
对采自269名类风湿性关节炎患者储存在-70℃的血清样品进行1∶20～1∶1280的相继两倍稀释。各稀释液取30微升滴加到载玻片上，在室温和高湿度下反应30分钟。
然后将载玻片置于含有磷酸盐(PBS)缓冲液的Copran罐中，采用振荡器以200 rpm的速率振摇，洗涤并干燥该载玻片。将结合有荧光素的按1∶40稀释的多价抗-人免疫球蛋白(Dako)30微升滴加到载玻片上，然后使之在室温和高湿度下反应约30分钟。载玻片在用PBS洗涤后，用0.2％的伊凡斯蓝(Sigma)对载玻片进行复染并用PBS洗涤。用吸水纸将过量的缓冲液吸去，将PBS-甘油溶液加到载玻片上，并置于荧光显微镜下观察。
结果示于图1。在细胞核附近观察到圆形或环形的MTOC的荧光图象。从MTOC延伸出的线样的MT也观察到了。也就是说，观察到了“核周带有骨架的单个大颗粒”图象。比较例1通过类风湿因子试验对类风湿性关节炎的诊断将与实施例1中所用的血清同样的血清样品0.05毫升滴加到载玻片上，并向该血清样品中加入同样量的人γ球蛋白乳液(Iatron)。将该混合物充分混合并使之静置1分钟。然后，在水平方向轻轻摇晃该载玻片，观察出现的任何凝集。结果本发明试验(实施例1)和类风湿因子试验(比较例1)中，269例样品中有148例(55％)显示阳性。有62例(23％)样品在类风湿因子试验中是阴性而在本发明试验中是阳性；有42例(16％)样品在类风湿因子试验中是阴性而在本发明试验中是阳性。有17例(6％)的样品在两项试验中都是阴性。
这些结果表明与传统的类风湿因子试验相比，本发明方法是高度敏感的，从而假阳性的概率大大降低。实施例2采用125名正常人的血样，完成实施例1和比较例1的实验过程。
在1∶20的稀释度时，本发明试验给出4％的阳性结果(125例中有4例阳性)，类风湿因子试验给出了9.6％的阳性结果(125例中有12例是阳性)。因此，这一点可证实采用抗-MTOC-MT的本发明方法降低了假阳性的概率。所以本发明方法能提高特异性。实施例3制备在本发明试验和类风湿因子试验中都显示阳性结果的12名患者的血液样品。以从Kallestad(美国)或MBL(日本)购得的HEp-2细胞代替IT-1细胞，采用同样的血样进行实施例1的步骤。
两项试验都得到了阳性结果。然而，来自这两个公司的HEp-2细胞所显出的荧光比实施例1中的IT-1细胞系显出的弱。而且，采用HEp-2细胞的试验仅显示出极小的抗-MTOC抗体。实施例4除了用4％聚甲醛/0.2％Triton-X的混合物来固定或用0.5％的Triton-X来处理IT-1细胞系之外，其余重复实施例1的步骤。当用0.5％的Triton-X处理时，结果显示更加清晰的荧光图象。实施例5类风湿性关节炎的患者经常患有关节浮肿并伴有滑液增多。因此，滑液可用来检测抗-MTOC-MT的抗体。
除了采用的样品是来自10名类风湿性关节炎患者的滑液之外，其余重复实施例1的步骤。结果，所有的滑液样品均显示阳性结果。实施例6除了用鼠源的McCoy细胞(ATCC CRL 1696)和巨噬细胞系(RAW细胞，ATCC TIB 71)来代替IT-1细胞之外，其余重复实施例1的步骤。这些细胞用来与加在载玻片上的已知抗-MTOC-MT为阳性的12名患者的血清反应。这些小鼠细胞系显示出的抗-MTOC抗体与用IT-1细胞看到的相比要小得多，但抗-MT抗体却显示出阳性结果。
权利要求
1.诊断自体免疫疾病的方法，包括对怀疑患有自体免疫疾病个体的体液中的自体抗体进行免疫检测的步骤，所述的自体抗体(抗MTOC-MT抗体)是抗微管组织中心(MTOC)、从MTOC延伸出的微管(MT)和伴随蛋白的抗体。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
3.根据权利要求1的方法，其中免疫检测自体抗体的步骤是通过将体液与组织或细胞接触来完成的。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的组织或细胞来源于人、动物或昆虫。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的组织或细胞是经培养或已建成细胞系的组织或细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的细胞是HEp-2、巨噬细胞、巨噬细胞系或McCoy细胞。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的巨噬细胞系是IT-1细胞系(KFCC 10772)。
8.根据权利要求4至7中任一权利要求的方法，其中所述的人组织或细胞被附着于载玻片上或经培养后被固定在载玻片上。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的附着或固定通过采用有机溶剂或交联剂来完成。
10.根据权利要求4至7中任一权利要求的方法，其中所述的组织或细胞用表面活性剂处理。
11.根据权利要求1的方法，其中所述的免疫检测通过间接免疫荧光技术来完成。
12.根据权利要求3至7中任一权利要求的方法，包括检测抗-MTOC-MT抗体以及抗-核抗体和抗-细胞质抗体。
13.根据权利要求11的方法，其中间接免疫荧光技术给出在核周带有骨架的单个大颗粒的荧光图象。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的体液是血液或滑液。
全文摘要
本文公开了诊断自体免疫疾病的方法。该方法包括对怀疑患有自体免疫疾病的个体的体液内的自体抗体进行免疫检测的步骤。所述的自体抗体(抗－MTOC－MT抗体)是抗微管组织中心(MTOC)、从MTOC延伸出的微管或伴随蛋白的抗体。本发明提供了一种简单、高度特异性的和高度可靠的自体免疫疾病(包括类风湿性关节炎)的诊断方法。
文档编号G01N33/564GK1192807SQ96196128
公开日1998年9月9日 申请日期1996年8月6日 优先权日1995年8月7日
发明者金伸圭 申请人:金伸圭