专利名称：一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法，用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的检测。
由于黄曲霉毒素具有毒性大，致癌力强，含量低(通常0-200μg/Kg，即0-200PPb)和结构相似等特点，这就要求检测方法灵敏度高，特异性强，集分离与检测为一体，目前黄曲霉毒素的测定方法有多种，概括起来有化学分析法，仪器分析法，生物鉴定法及免疫分析法等。上述这些分析方法也是紧密相联的，它们之间没有绝然的分界线。免疫分析法中的酶联免疫吸附法(ELISA)是70年代出现的新的免疫测定技术。正如1994年《粮食与饲料工业》杂志中已报道，酶联免疫吸附法其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。这一技术应用于黄曲霉毒素的测定大体为二类一是用双抗体夹心法检测样本中的黄曲霉毒素，如Sashidha将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白涂覆于酶标板孔穴中，经初步培养后，加兔的AFB1抗体和游离AFB1，用磷酸4-硝基苯酯作基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合二是用竞争法检测样本中的黄曲霉毒素，如在涂抗体的孔穴中，用乙烷萃取黄曲霉毒素B1，并与结合辣根过氧化物酶的黄曲霉素B1交联物混合，37℃下培养10分钟后，用水洗除去未结合的黄曲霉毒素B1交联物，再加底物，在波长405nm进行检测。为得到特异性更强的ELISA法，发展了AFB1单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法，Kawamura用间接和直接竞争ELISA法分析AFB1检出限小于1ng。上述所讲的黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(酶标抗原)的中间体是用Adsorbosil-柱层析法来提纯，部分材料需进口，操作要求较严格，费用也较高。如采用薄层层析制备来提纯，其中的硅胶吸附能力较强，在层析分离产物AFB1-Oxime和原料AFB1时，洗脱比较困难，其产率低，而且洗脱时间较长。
本发明的目的在于提供一种结构简单，使用方便，廉价，携带方便的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。
本发明的另一个目的是克服上述不足之处，从而提供一种样品前处理简单，提取后就可直接测定，不需要净化过程；一次可测定大量样本，而且简便，快速、灵敏、准确、廉价的检测黄曲霉毒素B1的方法。
本发明试剂盒主要由盒体(1)，酶标板(2)，A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)，E试剂瓶(含吐温20的PBS缓冲液)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂)(8)、G试剂瓶(H2O2溶液)(9)，H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)、海棉托架(12)所组成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶安装在海棉托架(12)的孔和凹槽内，海棉托架(12)酶标板(2)安装在盒体(1)内。
本发明主要采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法来检测AFB1。采用ELISA竞争法的技术主要有两个方面。特异性抗体(多克隆或单克隆)的制备，利用抗原免疫家免，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，抗原-酶交联物(即酶标抗原)的制备。由于AFB1(黄曲霉毒素B1)不脂直接与酶结合，必须先将AFB1修饰，引入一个-COOH修饰基团，然后和酶的氨基反应，使其具有酶的活性，即能催化底物的显色反应。
首先将多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃左右冰箱过夜。再进行试剂及酶底物混合液的配制，在B试剂(标准AFB1中)加20-30mlA试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(无酶标抗原稀释液)，溶解、混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液，用E洗涤液洗酶标板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔0.5-1.5分钟，放在吸水纸上拍干，在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃放置28-35分钟，再用洗涤液洗板4-6次，每次间隔1-2分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃放置13-18分钟，显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定。
黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(B1-Oxime)的制备(中间体)(1)合成取20-30mg黄曲霉毒素B1，30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂，回流2-4小时，再室温搅拌15-20小时，减压挥干溶剂，得固体。
(2)、提纯
在上述固体中加入5-10ml蒸馏水，采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性，转移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，静置分层，得水相层，再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性，用4-8ml氯仿萃取，得氯仿层，用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏，挥干溶剂，得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(1)、合成取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中，混匀，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶，慢速搅拌15-30分钟，再加150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐，在2-8℃搅拌15-18小时，并在5000-10000转/分钟，离心5-10分钟，取上清液。
(2)、提纯将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱，并用该缓冲液洗脱，部分收集器收集，洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天，得含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分装冷冻干燥，得粉状固体。
实施例1本发明主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测黄曲霉毒素B1的含量。具体操作步骤如下一、多克隆抗黄曲霉毒素B1抗体的制备1、免疫用抗原首次免疫用5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml完全福氏佐剂混合后作为免疫抗原，加强免疫时取5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml不完全福氏佐剂混合作为免疫抗原。
2、免疫程序先将购买的新西兰大白免饲养数周后，在背部脊柱两侧脱毛区取5-10个接种点，每点内接种完全佐剂抗原0.2-0.3ml，然后每隔4周四肢肌肉加强接种不完全佐剂抗原1ml，共加强免疫2次。
3、采血首先免疫前可取耳缘静脉采血，以后每次加强免疫前各采血1次，第二次加强免疫后第四周再采血一次，测定血清抗体效价后颈动脉放血。
4、分离血清分别以30％和60％的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白与抗体免疫球蛋白，离心后得含有抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的溶液。
二、单克隆抗黄曲霉毒素B1的制备1、抗原制备通过黄曲霉毒素B1的肟化反应和交联反应制备免疫用人工抗原黄曲霉毒素B1-羧甲基肟-牛血清白蛋白人工抗原(AFB1-Oxime-BSA)。
2、免疫动物采用BALB/C小白鼠作为免疫动物，免疫抗原剂量为10-100ng，经腹腔注射，在4-6周后静脉加强免疫2-4次，取脾细胞。
3、细胞融合取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞在聚乙二醇(4000)的溶剂中进行细胞融合，在HAT培养液中作选择培养。
4、杂交瘤细胞克隆化采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
6、单克隆抗体的保存在液氮-20℃下保存，37℃水浴快速解冻，使细胞存活率保持80％以上。
7、单克隆抗体大量生长及提纯在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹水，经HPLC提纯后小瓶分装待用。
三、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备(1)合成称取20mg黄曲霉毒素B1(AFB1)和30mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)放在30-50ml圆底蒸馏瓶中，再加入10ml吡啶∶甲醇(1∶3-1∶6)的反应溶剂，回流2小时，再室温搅拌15小时。当黄曲霉毒素B1(AFB1)已大部分转化为其衍生物羧甲基黄曲霉毒素肟时，停止反应，减压挥干反应溶剂，得黄色固体。
(2)、提纯在含上述黄色固体的圆底蒸馏瓶中，加入5ml蒸馏水，用0.1N碳酸氢纳(NaHCO3)调PH至碱性，使固体全部溶解，然后转移至分液漏斗中，用2ml氯份(CHCl3)萃取，静置分层，弃氯仿(CHCl3)层，得水相层，再用0.1N盐酸(HCl)调水相层至酸性，出现沉淀，用4ml氯仿(CHCl3)萃取，沉淀溶解在氯仿(CHCl3)层中，得氯仿(CHCl3)层，用0.5ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏挥干溶剂得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)(酶标抗原)的制备。
(1)、合成
称取上述0.5mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)固体溶于10ml的乙醇溶液中，混匀，依次加入150mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和5.0mg的辣根过氧化物酶(HRP)混匀，慢速搅拌15分钟，再加入150ml乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，在2℃温度下搅拌15小时，在转速为5000-10000转/分下离心5分钟，取上清液。
(2)、提纯将上清液通过pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的Sephadex层析柱，再用该缓冲液洗脱，采用BS-100A自动部分收集器收集。洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，见图3所示。收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透折3天，得含AFB1-HRP的溶液，小瓶分装冷冻干燥得粉状固体，为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)。
图4为酶标抗原合成原理反应式可以看出，其反应分两步进行，即AFB1-Oxime的肟化反应和AFB1-O-HRP交联反应。
具体检测步骤如下将多克隆(或单克降)抗黄曲霉毒素B1抗体包装在酶标板上，然后进行样品的处理。
1、先将样品粉碎至20目，称取5g样品于磨口的50ml试管中，加入提取液25ml(甲醇∶水为7∶3)，加塞振荡5-10min，过滤。滤液按下表用A试剂适当稀释。
样品 滤液量(ml) A试剂量(ml)稀释倍数豆类发酵食品，其它粮食0.1 0 0大米食用油、肉鸡、生长0.1 0.11∶1鸡饲料玉米(食品用)、混合、0.05 0.15 1∶3配合饲料玉米(饲料用)、花生饼、粕0.02 0.18 1∶92、试剂的配制(1)标准黄曲霉毒素B1(AFB1)B试剂中加入稀释液A试剂20ml混匀；(2)酶标抗原(AFB1-HRP)C试剂中加入10ml酶标抗原稀释液D试剂，溶解，混匀，在2-8℃下保存；(3)在含0.05％吐温-20(Tween-20)的磷酸盐(PBS)的E试剂中加入200ml蒸馏水配制洗涤液；(4)底物混合液配制根据每次测定所需底物混合液用量，用醋酸钠-柠檬酸缓冲液H试剂四甲基联苯胺F试剂按H∶F＝7-9.5∶3-0.5的比例稀释F试剂，再按每毫升此稀释液需加入14μl的双氧水G试剂配成底物混合液(临用前半小时内配制)。
3、将试剂盒平衡至室温4、用E洗涤液洗酶板2次，洗液不得溢出，每次间隙0.5分钟，放在吸水纸上拍干。
5、反应物组成按下表所列，依次加入配制好的试剂及待测样品稀释液。1-3号孔为标准对照孔。4-12号孔为样品孔。
>6、反应按上表所列加入各试剂在38℃放置28分钟。
7、洗涤显色用E洗涤液洗酶标板4次，加入50μl底物混合液，混匀，在38℃放置13分钟。
8、中止加底物液I试剂50μl中止反应。
9、测定先比较1-3号孔颜色，若1号最深，2号孔次之，3号孔按近无色，说明标准准确。
(1)、目视法比较样品孔与2号孔颜色，若浅者，则为阳性，反之为阴性，若颜色接近，则用仪器法或国标法验证。
(2)、仪器法用酶标仪(通用)测定吸光度值，通过标准曲线确定样品中黄曲霉毒素B1的含量(定量)。
10、结果判读若样品经目视法为阳性则AFB1含量如下表稀释倍数AFB1含量(PPb)0 ＞51∶1＞101∶3＞201∶9＞50本发明试剂盒体(1)内装有海棉托架(12)，酶标板(2)，有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，孔及凹槽内放有A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB，试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6)，E试剂瓶(含吐温20的PBS固体)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺)(8)，G试剂瓶(H2O2溶液)(9)，H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)。试剂盒放在2-8℃贮存，忌0℃下冻存，有效期12个月。详见
图1、图2实施例21、多克隆(或单克隆)抗黄曲霉毒素B1抗体的制备与实施例1相同，略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备(1)、合成称取25mg黄曲霉毒素B1(AFB1)，35mg羧甲基羟胺半盐酸醇盐(CMO)回流3小时，室温搅拌18小时，其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯蒸馏水取7.5ml，0.3N碳酸氢钠(NaHCO3)，3ml氯仿(CHCl3)萃取，0.3N盐酸(HCl)再取6ml氯仿(CHCL3)萃取，用1.2ml蒸馏水洗氯仿层，其它工艺流程条件操作步骤相同于实施例1。
2，黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。
(1)、合成取0.75mg上述固体，乙醇溶液15ml175mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)7.5mg辣根过氧化物酶(HRP)，搅拌25分钟再加入175mg(EDC·HCL)乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸胺，4℃搅拌16.5小时，离心7.5分钟，其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯pH7.5透析4天，其它工艺条件、操作步骤同实施例1。
检测步骤样品处理同实施例1。
试剂配制B试剂中加入A试剂25mlC试剂中加入15mlD试剂，洗涤液洗酶板3次，每次间隔1分钟，在37.5℃下放置30分钟，第二次洗酶板5次，每次间隔1.5分钟，在37.5℃下放置15分钟，其它工艺条件操作步骤同于实施例1。
实施例3一、多克隆(或单支隆)抗黄曲霉毒素B抗体的制备同实施例1，略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(试剂盒中C试剂瓶)1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备(1)、合成称取30mg黄曲霉毒素B1(AFB1)，40mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，回流4小时，室温搅拌20小时，其它工艺条件操作步骤相同实施例1(2)、提纯蒸馏水取10ml，0.5N碳酸氢钠(NaHCO3)，5ml氯仿(CHCl3)萃取，0.5N盐酸(HCl)，再取6ml氯仿(CHCl3)萃取，用2ml蒸馏水洗氯仿层，其它工艺条件制作步骤相同于实施例1。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备1、合成取1.0mg上述固体，乙醇溶液20ml，200mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC· HCl)、10mg辣根过氧化物酶(HRP)，搅拌30分钟，再加入200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，8℃搅拌18小时，离心10分钟，其它操作步骤同于实施例1。
(2)、提纯pH8.0透析5天，其它工艺条件制作步骤相同于实施例1检测步骤样品处理同于实施例1试剂配制B试剂中加入A试剂30ml，C试剂中加入20mlD试剂，洗涤液洗板4次，每次间隔1.5分钟，在37℃下放置35分钟，第二次洗酶板6次，每次间隔2分钟，在37℃下放置18分钟，其它操作步骤同于实施例1。
本发明与已有技术相比具以下优点1、试剂盒结构简单，携带使用配制方便，2、灵敏度高，特异性好，操作简单、方便，3、检测结果易判读，4、试剂来源方便，价格低廉，尤其适用于粮食、食品、饲料中黄曲霉毒素B1的检测。
权利要求
1. 一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒由盒体(1)，酶标板(2)、A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6)，E试剂瓶(含吐温-20的PBS固体)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂(8)，G试剂瓶(H2O2溶液)(9)、H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)，海棉托架(12)所组成，海棉托架(12)内装有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶，海棉托架(12)及酶标板(2)均安装在盒体(1)内。
2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于所述的海棉托架(12)上制有孔和凹槽。
3.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成。
4.一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及用该试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法，先进行样品处理，将样品粉碎至20目，取样品。放在50ml试管中，加入提取液(甲醇∶水为7∶3)。加塞振荡5-10分钟，过滤，滤液采用A试剂液适当稀释，其特征为首先采用多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃冰箱过夜，然后进行试剂及酶底物混合液的配制在B试剂(标准AFB1)中加20-30mlA试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(酶标抗原稀释液)，溶解混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温-20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液，用E洗涤液洗酶板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔0.5-1.5分钟，放在吸水纸上拍干，在酶板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃放置28-35分钟，再用洗涤液洗板4-6次，每次间隔1-2分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃放置13-18分钟显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定。
5.根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征是C试剂为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原，(酶标抗原)分二步进行制备①黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)(中间体)的制备(1)、合成取20-30mg黄曲霉毒素B1、30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底蒸馏瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂，回流2-4小时，再室温搅拌15-20小时，减压挥干溶剂，得固体。(2)，提纯在上述固体中加入5-10ml蒸馏水，采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性，转移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，静置分层，得水相层，再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性，再用4-8ml氯仿萃取，得氯仿层，用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏，挥干溶剂得淡桔黄色固体②黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。(1)、合成取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中，混匀，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶，混匀，慢速搅拌15-30分钟，再加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐，在2-8℃搅拌15-18小时，并在5000-10000转/分钟，离心5-10分钟，取上清液。(2)、提纯将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱，再用该缓冲液洗脱，部分收集器收集，洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天，将含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分装冷冻干燥得粉状固体。
6.根据权利要求4所述的的检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述的底物混合液，采用H试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)和F试剂(四甲基联苯胺)按H∶F＝7-9.5∶3-0.5和每毫升此稀释液加14μlG试剂(H2O2)混合配制而成。(临用前半小时内配制)。
全文摘要
一种检测黄曲霉毒素B
文档编号G01N33/53GK1153908SQ9611680
公开日1997年7月9日 申请日期1996年1月4日 优先权日1996年1月4日
发明者成恒嵩, 潘中华, 宓晓黎, 赵晓联, 袁建兴, 杨焱, 殷旭仁, 余传信, 徐燕芳, 葛其德 申请人:江苏省微生物研究所