专利名称：灭活的呼吸合胞体病毒疫苗的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，特别是灭活呼吸合胞体病毒疫苗。
相关申请本申请是于1993年8月6日提交的、共同未决的美国专利申请08/102,742号的部分继续申请。
背景技术：
人呼吸合胞体病毒是引起婴儿和幼儿下呼吸道感染的主要病因(ref.1至3-a，公开内容的末尾附有参考文献目录，而目录中的每篇文献都附有此中文献之外的参考文献)。全球每年发生6千5百万例感染，导致160,000例死亡(ref.4)。仅在美国一地，每年就有100,000名儿童因为RS病毒引起的肺炎和细支气管炎需住院治疗(ref.5至6)。美国每年用于为RS病毒感染儿童提供住烷和巡访治疗的花费超过3亿4千万美元(ref7)。由RS病毒引起的重下呼吸道疾病主要发生于2至6个月的婴儿(ref.8)。在美国每年大约有4千幼儿死于RS病毒和3型副感冒病毒(PIV-3)感染引起的重呼吸道疾病造成的并发症。世界卫生组织(WHO)及国立过敏及传染病研究院(NIAID)的疫苗咨询委员会已将RS病毒列为第二位疫苗制备对象仅次于HIV。
RS病毒是副粘液病毒科Pasamyxouilidae科肺病毒属的一个成员(ref.2)。两个主要保护性抗原是被膜融合(F)及附着(6)糖蛋白(ref.9)。F蛋白从68KDa前体分子(FU)形式合成。经蛋白水解分裂成二硫键连接的F1(48KDa)和F2(20KDa)多肽片段(ref.10)。G蛋白(33KDa)被严重的O-糖基化而生成表观分子量为90KDa的糖蛋白(ref.11)。已确定了RS病毒的二个主要的亚型A型和B型(ref.12)。这些亚型之间的主要抗原区别发现在G糖蛋白(ref.7，13)上。
尚无安全有效的RS病毒疫苗，因而这是迫切需要的。制备RS病毒疫苗的方法包括用甲醛灭活病毒、分离冷适应和/或温度敏感突变株病毒以及分离病毒的保护性抗原。临床试验结果表明减毒活疫苗和福尔马林灭活疫苗都不能适当地保护被接种者抵抗RS病毒感染(ref.14至16)。用冷适应的和/或温度敏感RS病毒突变株进行鼻饲麦理所遇到的问题包括临床发病、遗传不稳定性，以及过度减毒(refs 17至19)。皮下给药活RS病毒疫苗也无效(ref.20)。灭活的RS病毒疫苗的典型制备方法是使用甲醛为灭活剂。Murphy等人(ref.21)报道了关于经福尔马林灭活的RS病毒免疫的幼儿和儿童的免疫应答的资料(ref.21)幼儿(2至6个月)产生了高滴度的抗F糖蛋白抗体，但是对于G蛋白应答微弱。较年长的个体(7至40个月龄)生成了F和G抗体，其滴度可与感染了RS病毒的儿童体内抗体滴度相比。然而，幼儿和儿童产生的中和抗体的水平比感染了天然RS病毒的同样年龄的个体低。免疫应答是不平衡的对RS病毒的主要免疫原性蛋白-F(融合)和G(附着)蛋白有高滴度的抗体，但是中和抗体的滴度很低，部分原因也许是经福尔马林处理时，F和G糖蛋白的重要抗原决定簇改变了。而且，与未经免疫的个体相比，一些接种过福尔马林灭活疫苗的幼儿在此后感染天然RS病毒时，所患下呼吸道疾病更为严重(refs.15，16)。因此，福尔马要灭活的RS病毒疫苗确实不能用于人类。
不正常的免疫应答的迹象也在用福尔马林灭活的RS病毒免疫棉鼠中见到(ref.22)。而且，在棉鼠体内评价RS病毒的福尔马林灭活疫苗的工作表明。当活病毒侵袭时，经免疫的动物发生了进一步的肺部组织病变(ref.23)。
福尔马林灭活的RS病毒疫苗制剂的致病增强的机制有待确定，但是成为有效RS病毒疫苗制备的主要障碍。这种强化可能部分归因于福尔马林活化了F和G糖蛋白。此外，提出了一种非RS病毒特异的致病增强的机制针对疫苗制剂中出现的污染的细胞和血清的组分所发生的免疫应答，是加重的疾病的部分原因(ref 24)。确实，将接种过HEp-2细胞裂解物的小鼠和棉鼠，并用HEp-2细胞上生长的RS病毒侵染，发生了强化的肺炎反应。
而且，在酸性pH洗脱，经免疫亲和层析纯化的RS病毒糖蛋白是免疫原性的也是保护性的，但是却在棉鼠体内诱导免疫强化(refs.22，25)。
但依然明显地需要致免疫制剂。包括既能有效地提供保护抵抗RS病毒引起的疾病、而且也不产生不期望的副作用，例如免疫强化的疫苗。也需要用于诊断RSV感染的抗原和产生抗体(包括单克隆抗体)的免疫原，而该抗体特异性地识别RSV蛋白，可以用于，例如，诊断RS病毒引起的疾病。
最近综述文章总结了专业人员所承认的制备RSV疫苗的方法(refs.2、31至35)，没有一篇提议制备灭活的RSV疫苗。
发明概述本发明提供了新的通过灭活纯化的RS病毒制备这样一些抗原和免疫原的方法。
本发明的一个方面是提供一种制备致免疫组合物的方法，这种致免疫组合物能够在经过免疫的宿主，特别是人类宿主体内引起呼吸合胞体(RS)病毒特异的、由多个步骤组成的免疫应答。首先，把RS病毒生长在合适的细胞株上然后收集病毒。收获的病毒在非变性条件下纯化，以产生实质上无细胞和血清组分的纯化病毒。然后用灭活剂灭活纯化的病毒，以制备一种不感染的、无免疫强化的、致免疫的RS病毒。这种病毒被通称为致免疫组合物。
灭活剂可以是β丙酮酸内酯，这是一种非离子去垢剂，包括正辛基-α-D吡喃葡糖苷及正辛基β-D吡喃葡糖苷，或抗坏血酸。
对收获的病毒所进行的纯化步骤可以优选地用微过滤除去细胞碎片、切向流超滤，特别是采用一种大约100KDa至300KDa命名的分子量的阻断膜除去血清组分，通过超速离心沉淀经超滤的材料以进一步除去血清组分，将沉淀物进行蔗糖密度梯度离心实现。另一种方法是，切向流超滤的保留时间可以在离子交换层析之后，再进行凝胶过滤以进一步除去血清组分。
本方法提供了一种新的致免疫组合物。该组合物能在经构成本发明另一方面免疫过的宿主体内引起RS病毒特异的免疫应答。这样致免疫组合物包括纯化的、灭活的、实质上不含细胞和血清组分的RS病毒，而且它是非传染的、非免疫强化的，致免疫和保护的、因之也是一个载体。这种致免疫组合物被明确定义为对人类宿主体内给药以保护人类免于RS病毒引起疾病的疫苗。致免疫组合物的载体可以包括一种佐剂。这种致免疫组合物可以被明确地定义为一种可以以针剂、鼻饲或口服形式给药的疫苗。
本发明也提供了一种免疫宿主，特别是人类宿主抵抗RS病毒引起疾病的方法，包括对宿主给药以在此处提供的致免疫组合物的有效剂量。以这种方式免疫的宿主可以从幼儿、幼龄儿童、孕妇、育龄妇女、老年人、免疫损伤个体及其他敏感人群中选择。
此中规定的灭活病毒也可以用作诊断试剂检测RS病毒感染。所以，更进一步说，本发明包括确定与RS病毒蛋白起特异性反应的抗体在样品中出现的方法，包括以下步骤(a)将样品同本发明的致免疫组合物接触，以产生包含有非传染的、非致免疫的、和致免疫的RS病毒和任何在样品中出现的抗体起特异性反应的复合物，以及(b)确定复合物的产生。
另外，本发明提出了一种确定RS病毒蛋白在样品中出现的方法，包括以下步骤(a)用本发明的致免疫组合物免疫受试者以制造RS病毒蛋白特异的抗体；(b)将样品和抗体接触，以产生包含在样品中出现的任何一种RS病毒蛋白和RS病毒蛋白特异抗体的复合物；以及(c)确定复合物的产生。
本发明进一步提供了一种诊断试剂盒，用以确定样品中和RS病毒蛋白特异性反应的抗体的出现，包括(a)本发明的致免疫组合物；(b)将非传染的，非免疫强化的、非致免疫的RS病毒和样品接触，以生成包括非传染的、非免疫强化的、致免疫的RS病毒和样品中出现的任何一种所说的抗体的复合物的方法，以及(c)确定复合物生成的方法。
念及以前在RS病毒疫苗制备上的专业困难，令人惊讶的是此中叙述的方法规定的致免疫组合物既展现了免疫原性和保护能力，同时又是非感染的和非免疫强化的。
发明详述在某一方面，本发明涉及一种可被接受用作人疫苗的灭活的呼吸合胞体病毒的制备。把RS病毒的A亚型或B亚型，在受控制的发酵罐中组织培养的疫苗级细胞株上生长，特别可以是VERO细胞。在收获病毒之后，病毒被纯化然后被灭活以生成灭活RS病毒疫苗。
细胞的生长(黑体字)疫苗级细胞株，例如非洲绿猴肾细胞(VERO)，一般生长在微载体小株(Cytodea-1)上。这种小株一般在缓冲液中溶胀，例如pH大约在6.9至8.2的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)，在室温下轻柔振荡(30至50rpm)经2至4小时，洗过的小株在110℃至130℃灭菌30到60分钟，并置于细胞培养液中，例如CMRL 1969，放入摇瓶或小的(2至10升)或大的(20至2000升)控制发酵罐中。然后用培养液，例如补充了小牛血清的CMRL 1969培养液中的疫苗级细胞(例如0.5×105到2×105细胞/ml浓度)在容器里接种。
RS病毒的生长(黑体字)一旦细胞长满了大约80至90％(接种细胞3至5天后)，倾去培养上清液，用培养液例如CMRL 1969洗一遍，然后，用在不含FBS的CMRL 1969中的病毒感染细胞。在病毒吸附之后，被感染细胞用培养液洗涤，在感染之后的5至7天监测病毒的生长。
病毒的处理和浓缩(黑体字)收获的病毒在非变性条件下纯化使其在实质了无细胞组分和血清组分。这种纯化可以以任何便利的方法实现。在一种这样的方法中，RS病毒上清液经微滤(0.22至8μm孔径滤膜)除去细胞碎片。清亮的病毒液通过带有阻断分子量大约在100至300KDa之间的超滤膜的切向流超滤可以被浓缩以除去血清组分。
浓缩过的RS病毒经受进一步纯化，以作为抗原以及用于致免疫制剂。一种方法是浓缩过的病毒经超速离心而沉淀，超速离心的上清液被倾去，因而进一步除去血清组分。沉淀的病毒重悬于PBS或其他合适的基质中。浓缩过的病毒然后通过蔗糖密度梯度超速离心而纯化。另一种方法是，切向流超滤步骤中，保留物质在经凝胶过滤之后，进行离子交换层析以进一步除去血清组分。生成的RS病毒材料经超速离心而再次沉淀。沉淀纯化的RS病毒重悬于PBS中，储于-70℃备用。
病毒灭活(黑体字)下一步是灭活纯化RS病毒。这样的灭活通过使用能为纯化病毒提供一种非感染的、非免疫强化的和致免疫的形式的物质来实现。本步骤中采用的灭活剂一般包括β-丙酮酸内酯、抗坏血酸或非离子去垢剂。在灭活步骤中可采用的非离子去垢剂中有一些吡喃葡糖苷，包括正辛基-β-D吡喃葡糖苷及正辛基-α-D吡喃葡糖苷。
同提供一种非传染的、非免疫强化的以及致免疫的材料的愿望相一致的任何适合需要量的灭活剂以及任何一种期望的反应条件均可采用。
例如，RS病毒可以使用大约浓度为0.1％的β-丙酮酸内酯(BPL)溶液处理30至120分钟或抗坏血酸处理大约24小时，温度是37℃，要恒定振荡。残留BPL可以通过用PBS透析从灭活样品中除去，所采用的透析袋是10,000至20,000分子量膜。
棉鼠的免疫原性研究(黑体字)该方法所提供的经纯化和灭活的RS病毒材料是致免疫的保护性的同时又是非传染的。这个结论是通过免疫原性RS病毒物质在棉鼠体内的评价。包括如下报道的它们保护动物免受活的RS病毒侵染的能力得到的。此中规定的疫苗制剂引出RS病毒特异的中和抗体并保护棉鼠免受活病毒侵染。
显然对于本专业技术人员来说，本发明的多种实施方案在疫苗这一领域有着许多应用，诊断、治疗呼吸合胞病毒引起的疾病，以及生产免疫试剂。关于此类应用的不加局限的进一步讨论，将在下面进一步叙述。
疫苗制备和应用(黑体字)适于用作疫苗的免疫组分，可能如此中所公开的方法那样，从灭活RSV制备。疫苗在产生了抗RSV抗体的受试者中体内引出免疫应答。假如接种过的受试者被RSV侵染时，抗体和病毒结合并灭活病毒。
致免疫组分包括可能制备成液体溶液或乳剂形式的针剂的疫苗。灭活的RSV可与药学上能接受的匹配的赋形剂混合。这些赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇，及其复合物。另外致免疫组分及疫苗还可以包含辅助物质，例如保湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或用于提高其有效性的佐剂。实现佐剂效果的方法包括使用一些试剂，如氢氧化铝或磷酸盐(铝)，通常以百分之0.05至0.1浓度溶于磷酸盐缓冲液中。致免疫组分可以通过皮下或肌肉注射肠胃外给药。另一种方法是，按本发明所产生的致免疫组分，可以被明确定义为以及可以采用粘膜表面给药引起免疫应答。因此，致免疫组分可以通过，例如，鼻腔或口腔的途径而在粘膜表面给药。此外，其他给药方法包括栓剂，或口服配方也都是可取的。对于栓剂、粘合剂或载体来说，包括，例如，多聚(亚烷基)二醇和甘油三酯。口服药方包括通常采用的赋形剂例如，药用级的糖精，纤维素以及碳酸镁。这些组分可以采用溶液，悬液、片剂、药丸、胶囊、持续释放的成方的或粉末的形式，可以含有1％至95％的此中规定的灭活RSV。致免疫制剂和疫苗以与剂量中规定相匹配的情况给药，以这样的量给药在药学上将是有效的，保护性的和致免疫的，给药的量取决于受试者，包括，例如，个体的免疫系统合成抗体的能力，以及，假如必需的话，产生细胞介导的免疫应答的能力。所要求的给药的精确的活性成分的量取决于操作者的判断。然而，本领域的专业人员可以容易地确定合适的剂量范围。初次给药及辅助注射的合适的方式也是变化的，但是可以包括初始给药然后有随后给药。剂量也可以取决于给药途径并随宿主的大小而变化。
据本发明所载，一般在致免疫组分中灭活RS病毒的浓度大约是1％至95％。一种含有仅有一种病原体的抗原性物质的疫苗是一种单价疫苗。含有几种病原体的抗原性物质的疫苗是复合疫苗，也属于本发明的范畴。这种复合疫苗含有例如来自于不同病原体的、或来自于同一病原体的不同变异株、或来自于不同病原体的组合的物质。
免疫测定(黑体字)本发明的灭活RSV制剂可以用作免疫原，以产生与RSV蛋白起特异性反应的抗体(包括单克隆抗体)，在此RSV蛋白是免疫测定的抗原，免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫吸附测定(RIA)以及其它非酶联抗体结合测定或本专业所公知的检测细菌抗体的方法。在ELISA测定中，灭活的RSV被固定到选择的表面上，例如，能够结合蛋白的表面比如聚苯乙烯微滴度板的小孔。在经过洗涤以除去不完全吸附的病毒之后，非特异性蛋白例如已知针对测试样品为抗原性中性的牛血清白蛋白(BSA)溶液结合到选择过的表面上。这样封闭了固定化表面的非特异吸附位点，因而减弱了由表面的非特异结合引起的背景。
固定化表面然后和样品，例如临床材料或生物学材料相接触，以一种引导免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式进行测试。这可以包括以稀释剂，如BSA溶液，牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸盐缓冲液(PBS)/Tween，稀释样品。将样品在25℃至37℃范围内温孵2至4小时。温孵之后，洗涤接触过样品的表面以除去非免疫复合物物质。洗涤步骤包括用溶液洗涤，例如PBS/Tween或硼酸缓冲液。在测试样品和结合的灭活RSV形成特异性免疫复合物、随之洗涤之后，免疫复合物形成的发生甚至其数量，都可以通过将免疫复合物和对第一抗体特异的第二抗体相反应而测定。如果测试样品是人来源的，第二抗体则是对人免疫球蛋白特异的抗体，通常是ZgG。为了提供测试方法，第二抗体可以有相连的活性如一种酶活性，可以在与合适的发色底物共孵育时，产生发色反应。通过测定发色的程度，例如使用可见光分光光度计，可以进行定量。
实施例以上公开内容概括地描述了本发明。参阅下面特定的实施例将会获得更全面的理解。描述这些实施例的唯一目的是说明本发明，而不是企图限制本发明的范围。形式的改变及等价物的替代被认为是环境使然或出于权宜。尽管此中采用特定的用语，这种用语的目的是为了描述而不是为了限制。
测定半数组织培养物感染剂量(TCID50/mL)，空斑及中和滴度的方法在公开内容中没有详尽描述，但在科技文献中有详尽的报道并为本领域专业人员所熟知。蛋白质浓度以双辛可宁酸法(BCA)测定，正如Pierce Manual(23220，23225；Pieice Chemical Company，U.S.A.)所描述，此中附有参考文献。
CMRL 1969培养基用于细胞培养和病毒生长。此项工作中所用细胞是疫苗级非洲绿猴肾细胞(VERO lot M6)，从Institut Mésieux获得。所用RS病毒是亚型ARS病毒(Long and A2Stsains)，从American Type Cultase Collection获得，以及被称为Tracy andRSV-3-DiT的新近从临床分离的亚型A。在下面的实施例中用每种RSV都获得了可以比较的结果。
实施例1本实施例描述了非洲绿猴肾细胞(VERO，Lot，M6)的生长。
非洲绿猴肾细胞生长在微载体小珠上(Cytodex-1，Phasmacia)，小珠浓度是2.5g/L，在pH 8.0的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液中室温轻柔振摇(sorpm)膨胀。温孵之后，倾去PBS液再用1.5L PBS冲洗小珠。倾去上清，用PBS定容至2L。微载体小珠于121℃，蒸汽消毒45分钟，用CMRL 1969细胞培养基在大发酵罐(40L)平衡。在培养容器中接种VERO，M6细胞，培养基是补充了胎牛血清(终浓度是5％)的CMRL 1969。
实施例2本实施例描述了RS病毒在组织培养物上的生长。
细胞一旦长满了90％，倾去培养上清用CMRL 1969培养基洗涤细胞。细胞在无外加FBS的培养基中被RS病毒感染，其感染频率是0.001。37℃轻柔振摇1小时使病毒吸附在细胞上。吸附之后，细胞用CMRL 1969培养液洗涤一遍，用CMRL 1969培养基温孵。感染之后十天，收集培养液(Haruesr I)，按照实施例3所描述的处理，加入20％蔗糖贮于-70℃。往发酵罐内加入CMRL 1969，将感染病毒的细胞继续温孵4天以收获第二批病毒(Haruest II)。第二批病毒收集物按实施例3中的描述处理。液体中感染病毒的滴度用空斑测定法检测。
实施例3本实施例描述了RS病毒的处理把在感染后的10天和14天收集的、来自于感染RS病毒的VERO细胞的病毒液体(Haruest I和II)分别处理。每一批病毒收集物用5μm孔径滤膜(终端过滤)微滤以除去细胞碎片。澄清的病毒上清液通过切向流超滤(Sartorius)得到进一步浓缩，所用的膜是100KDa分子量阻断膜。RS病毒保留物贮于-70℃。
实施例4本实施例描述了通过超速离心浓缩RS病毒。
把RS病毒保留物于4℃，用45,000rpm离心2小时，所用转头是50.2 Ti Beckman的固定角度转头。弃去上清，将沉淀的病毒重悬于pH 7.3的磷酸盐缓冲液中。
实施例5本实施例描述了通过蔗糖密度梯度离心而纯化病毒。
把重悬沉淀的病毒在10-60％(w/v)线性蔗糖梯度上通过速度区带离心(24,000rpm.2小时，Beckman SW 28转头)，进行进一步纯化。从35-40％区带收集弥散的病毒带，用PBS稀释到10％蔗糖浓度。纯化的病毒用Beckman 50.2 Ti转头，45,000rpm离心90分钟而进行进一步浓缩。弃去上清。沉淀病毒重悬于PBS。使其蛋白浓度为大约1mg/mL，并贮于-70℃。纯化的RS病毒用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并用抗-RSV特异抗体进行免疫印迹分析，发现其纯度至少是60％，可以认为是充分地去除了细胞和血清组分。
实施例6本实施例描叙了通过凝胶过滤和层析以纯化和浓缩RS病毒。
实施例3中描叙的来自于RSV-3-SiT的病毒保留物通过凝胶过滤和柱层析纯化和浓缩如下来自于实施例4的病毒保留物过一个凝胶过滤柱(SephacryeS-500)，该柱已用含有10mM氯化钠和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸钠缓冲液平衡，以除去主要的污染物，牛血清蛋白(BSA)。病毒在用上述缓冲液平衡的离子交换柱(DE-52，Whatman)上进一步纯化。树脂用平衡液洗后，然后，用五倍柱体积和含有100mM氯化钠和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸钠缓冲液洗脱。在此步骤中，在经过纯化的病毒分级部分中仍然出现的非病毒组分，主要是BSA，通过凝胶过滤被洗脱了。再用50mM磷酸钠和1.5M氯化钠溶液从柱上洗脱病毒。
实施例7本实施例描述了用正辛基-β-D吡喃葡糖苷(OG)灭活RS病毒。
按实施例5和6的描述而制备的RS病毒，用正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(1％wt/vol)室温下处理两个小时灭活。将病毒样品对磷酸缓冲盐透析，以从蛋白混合物中消除去垢剂。灭活病毒的感染力通过TCID50测试而测定，没有检测到感染病毒。
实施例8本实施例描述了正辛基-β-D吡喃葡糖苷灭活的RS病毒制剂的免疫原性。
取六周龄棉鼠用肌肉注射30μg/kg按实施例6中所描述的方法制备的、磷酸铝吸附的OG灭活的RS病毒，或不相关抗原(安慰剂)。一组动物被鼻内接种100μl的大约100倍棉鼠半数感染剂量(CRID50)的活RS病毒。在第28天，所有动物都被抽血，除被接种了活病毒的之外的所有动物，都用和初次接种相同剂量的辅助抗原加强免疫。加强免疫一周后(35天)，采集血清样品。测定了RS病毒特异的中和滴度，并在下面所列表I中描述。(表在说明书的末端)。
从表中可看出，初次血清样品的数据说明了OG灭活的RS病毒制品引发了强的初次免疫反应在4周时，用等价剂量的辅助OG灭活RS病毒加强免疫的动物血清，其35天的中和抗体滴度和接种了活病毒的动物血清的中和抗体滴度是可比的。在此提供的数据说明了OG灭活RS病毒是高度致免疫的。
实施例9本实施例描述了OG灭活RS病毒制剂引出免疫棉鼠的保护性应答，又不引起增强的肺病理学的能力。
为了评价正辛基-β-D吡喃葡糖苷灭活RS病毒制剂的保护能力，把棉鼠接种以活的RS病毒或用两个30μg剂量的灭活RS病毒或不相关抗原(安慰剂)，然后鼻内感染(加强剂量后7天)大约以100倍棉鼠半倍感染剂量(CRID50)的、生长于Hep2细胞的RS病毒的A2株。病毒感染后的第4天，杀死半数动物。取肺，洗灌肺，生成的液体用来分析肺部病毒滴度和白细胞计数。病毒侵染后的第7天，处死存活动物，取其肺以分析病毒水平。同时确定肺支气管洗出细胞的出现。通过苏木精和曙红染色石蜡切片进行肺切片的组织病理学研究。
感染后第4天的肺RS病毒滴度在表2中得到总结。用那些注射了不相关蛋白制剂的安慰剂对照动物，其每克肺组织中持有6.610gTCID50单位病毒的复制。以OG灭活的RS病毒制剂免疫的动物，其肺部没有检测到病毒。这些结果说明了OG灭活RS病毒的保护能力。在所有测试的动物肺中，其第7天的RS病毒肺部滴度都很低(未展示数据)。这并非是不期望的结果，因为通常在感染后7天RS病毒从肺中清除出去。
用OG灭活的RS病毒制剂免疫的动物的肺的洗灌出细胞计数(表3)，比用不相关蛋白制剂(placebo)接种的动物的肺的细胞计数明显降低。进一步说，在第7天。OG灭活RS病毒接种动物的细胞计数并不明显高于安慰剂对照组计数，可以推断OG灭活RS病毒制剂，在免疫动物遭受活病毒侵袭之后，并不引起肺部炎症的加剧。
苏木精和曙红染色切片显示，被给予不相关蛋白制剂(安慰剂)的动物的肺具有最大的感染和炎症的指征。而以活病毒或OG灭活RS病毒制剂免疫的棉鼠肺则有微弱的感染和炎症的迹象。结果总结在表8中。
基于这些结果，可以推断OG灭活的RS病毒制剂可以引发保护性免疫应答，而并不促使肺部病理加剧。
实施例10本实施例描述用β丙酮酸内酯(BPL)灭活RS病毒。
把灭活剂β丙酮酸内酯(0.1％w/v，溶于蒸馏水)用通过0.22Am孔径滤膜过滤而除菌。按实施例5描述制备的纯化RS病毒，和灭活剂以1∶1(v/v)比例混合，并在37℃持续振荡孵育两个小时。然后将病毒样品于4℃对PBS透析过夜以除去残留BPL，所用的透析膜是12000分子量阻断膜，处理过的病毒样品的感染力以空斑测试法评估。没有检测到具有感染力的病毒。透析过的样品贮于-70℃。
实施例11本实施例描述了β丙酮酸内酯灭活RS病毒的免疫原性和保护能力，以及不引起肺病理加重。
取六周龄雌性棉鼠用肌肉注射10μg/kg BPL灭活的、吸附了磷酸铝的RS病毒。安慰剂对照动物则用PBS加磷酸铅免疫。一组动物鼻内灌注100CRID50的RS病毒。在28天将动物取血，除用活病毒免疫的棉鼠外，并都用同一剂量抗原制剂加强免疫。在84天取血清样品测定RS病毒特异性中和滴度。为评价灭活RS病毒制剂保护动物免受活病毒侵袭的能力，将棉鼠鼻内感染以大约100CRID50的收获于棉鼠肺的RS病毒Tracy(特尔西氏)分离物。感染4天之后，处死动物，取肺，洗涤过的和生成的液体用以测试肺RS病毒滴度。
表4中总结了在用BPL-灭活病毒免疫动物血清中，RS病毒特异中和滴度。初次采血(28天)的结果证明BPL灭活RS病毒制剂引发了良好的初次免疫应答。而且，在4周时用同等剂量的灭活RS病毒加强免疫的动物血清所具有的中和抗体的滴度，与接种了活病毒的动物的可以相比。
BPL灭活病毒制剂也能有效地保护棉鼠免受RS病毒侵袭，正如表5所示肺RS病毒滴度。因此，用两倍剂量的BPL灭活RS病毒制剂免疫的动物可以得到保护免受活病毒侵袭。肺病毒滴度的降低可以与以活病毒免疫的棉鼠体内见到的降低(0.6 log 1g/1μng)，可以相比。
按上面实施例9的方法，确定了β丙酮酸内酯灭活的RSV制剂的增强的肺病理。
这些研究的结果表明BPL灭活RS病毒是高度致免疫的和保护性的。
实施例12本实施例描述了用抗坏血酸灭活RS病毒。
抗坏血酸(10mg/mL)和硫酸铜(0.5mg/mL)溶液通过经0.22μm孔径滤膜过滤而除菌。按实施例5纯化的病毒和溶液混合，使得抗坏血酸的终浓度为1mg/mL，硫酸铜的终浓度为50μg/mL(4份病毒和0.5份各种溶液)，混合物于30℃，保持振荡温孵24小时。
公开内容概要在这公开内容摘要中，本发明提供了一种能在其免疫宿主中产生对RS病毒有特异性免疫应答的新的致免疫组分，包括纯化的灭活的病毒和制备及使用它们的方法。在本发明的范畴内，有些修正是有可能的。
表1在用OG灭活RS病毒免疫棉鼠血清中的RS病毒中和抗体滴度
1.4个样品的GMT值，标准差在括号()中。表2在用OG灭活RS病毒免疫棉鼠的肺中RS病毒滴度
1.4个样品的GMT值，标准差在括号()中。表3在用OG灭活RS病毒免疫的，再经RS病毒侵袭的棉鼠的支气管洗灌液体的肺细胞计数
1.4个样品的GMT值，标准差在括号()里。表4在用β丙酮酸内酯灭活RS病毒免疫棉鼠的血清的RS病毒中和抗体滴度
1.4个样品的GMT值，标准差在括号()里。表5β丙酮酸内酯灭活RS病毒免疫棉鼠肺中的RS病毒滴度
1.GMT值。标准差在括号()内。表6抗坏血酸灭活RS病毒免疫棉鼠血清的RS病毒中和抗体滴度
1.4个样品的GMT，标准差在括号()内。表7抗坏血酸灭活RS病毒免疫棉鼠肺的RS病毒滴度
1.6个样品的GMT值，标准差在括号()里。
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Pediatrics 121，503-510.
权利要求
1.一种能够在其免疫宿主体内产生对呼吸合胞体(RS)病毒特异免疫应答的致免疫组合物，包括纯化的、灭活的病毒和其载体，这种病毒基本上去除了细胞和血清组分，是非感染的、非免疫强化的、致免疫的和保护性的。
2.权利要求1的组合物，它被明确定义为对人类宿主活体给药的疫苗，保护人类不受RS病毒引起的疾病。
3.权利要求2的组合物，其中所说的载体也包括一种佐剂。
4.权利要求2的组合物，它被配制成以针剂形式，鼻内、口服、或粘膜表面给药。
5.一种制备能够在其免疫过的宿主体内产生对呼吸合胞体(RS)病毒特异免疫应答的、非免疫强化的致免疫组合物的方法，包括RS病毒在细胞株里生长以产生生长成熟的病毒；收获所说的生长病毒以产生收获的病毒；在非变性条件下纯化所说的收获的病毒；以制造在实质上去除了细胞和血清组分的纯化病毒；用灭活剂灭活所说的纯化病毒，以提供一种非感染的、非免疫强化的、致免疫的RS病毒，以及明确定义所说的非感染的、非免疫强化的RS病毒为所说的致免疫组合物。
6.权利要求5所说的方法，其中所说的灭活剂是β丙酮酸内酯。
7.权利要求5的方法，其中所说的灭活剂是一种非离子的去垢剂。
8.权利要求7的方法，其中所说的非离子去垢剂选自正辛基-α-D-吡喃葡糖苷和正辛基-β-D吡喃葡糖苷组成的类群中。
9.权利要求5中的方法，其中所说的灭活剂是抗坏血酸。
10.权利要求5中的方法，其中所说的细胞系是疫苗级连续细胞系。
11.权利要求10中的方法，其中所说的连续细胞系是VERO细胞系。
12.权利要求5中的方法，其中所说的完成的纯化步骤微滤去除细胞碎片，切向流超滤去除血清组分，通过超速离心沉淀超滤物，以进一步去除血清组分，将沉淀物进行蔗糖密度梯度离心。
13.权利要求12中的方法，其中所说的切向流超滤通过采用一种约100至300KDa命名分子量阻断膜而完成。
14.权利要求5中的方法，其中进行的纯化步骤包括微滤去除细胞碎片，切向流超滤去除血清组分，凝胶过滤进一步去除血清组分，离子交换层析再一步去除血清组分。
15.一种免疫宿主抵抗呼吸合胞体病毒引起疾病的方法，包括将有效剂量的权利要求1中致免疫组合物对宿主给药。
16.权利要求15中的方法，其中所说宿主选择自幼儿、幼龄儿童、孕妇、育龄妇女、年长个体、免疫缺损个体及敏感人群。
17.一种测定样品中存在的与呼吸合胞体病毒蛋白特异反应的抗体的方法，包括以下步骤(a)将样品和权利要求1的致免疫组合物接触，以生成一种复合物，包括非感染的、非免疫强化的、致免疫的RS病毒和任何所说的样品中出现的与之特异反应的抗体，以及(b)确定该复合物的产生。
18.一种确定呼吸合胞体(RS)病毒蛋白在样品中出现的方法，包括下列步骤(a)用权利要求1的致免疫组合物免疫受试者，以产生对RS病毒蛋白特异抗体(b)将样品和抗体接触，以产生由任一样品中出现的RS病毒蛋白和所说RS病毒蛋白特异性抗体构成的复合物，以及(c)确定复合物的产生。
19.一个诊断试剂盒，用于测定一个样品中，与RS病毒蛋白特异性反应的抗体的出现，包括(a)权利要求1的致免疫组合物；(b)将非感染的，非免疫强化的和致免疫的RS病毒和样品接触，以产生由非感染的、非免疫强化的、致免疫的RS病毒和任一所说的样品中出现的抗体构成的复合物的方法，以及(c)确定复合物产生的方法。
全文摘要
一种能在其免疫宿主体内引起呼吸合胞体病毒特异的免疫应答的免疫组分，它包括纯化的，灭活的，在实质上是去除了细胞和血清组分的RS病毒，是非感染的、非免疫强化的、致免疫的和保护性的。病毒生长在疫苗级细胞系，收获的病毒在非变性条件下纯化，在实质上是去除细胞和血清组分。这纯化的病毒用β-丙酮酸内酯、一种非离子去垢剂、特别是正辛基-α-D吡喃葡糖苷，或正辛基-β-D-吡喃葡糖苷，或抗坏血酸灭活。这种致免疫组分可被明确定义为一种对人类宿主体内给药的疫苗，这种致免疫组分也可在诊断上应用。
文档编号G01N33/569GK1133013SQ94193703
公开日1996年10月9日 申请日期1994年8月4日 优先权日1993年8月6日
发明者S·E·桑休兹, M·E·伊瓦西辛, M·H·克莱恩 申请人:康诺特实验室有限公司