本发明涉及尼克酰胺-N-甲基转移酶的检测，特别涉及尼克酰胺-N-甲基转移酶的ELISA试剂盒及其应用。(二)
背景技术：
：恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡率或提高治疗的效果，许多研究致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。尼克酰胺-N-甲基转移酶(NicotinamideN-methyltransferase，NNMT,EC2.1.1.1)是近年用蛋白组学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现的在癌组织中异常表达的酶蛋白，分子量约为29KD。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、乳腺癌、甲状腺乳头状癌、胰腺癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等肿瘤组织均存在过表达，并在多种肿瘤患者的血清中明显升高。NNMT在肿瘤中的表达可能受microRNA-1291、肝细胞核因子-1(HNF-1)、TGF-1因子、γ干扰素、STAT3、Ras和NF-κB等信号分子激活，其过表达也可能是翻译后调控异常所致。NNMT蛋白为四条肽链组成的不对称晶体结构蛋白，其主要功能是以S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)为甲基供体，催化尼克酰胺(NA)及吡啶类化合物的甲基化形成吡啶盐，主要产物是1-甲基尼克酰胺(1-methylnicotinamide，1-MNA)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。NA是NAD+分子的组成部分，可通过补救合成途径生成NAD+，而NAD+是细胞中200多种氧化还原酶促反应的辅因子，参与细胞多种基本功能如能量代谢、对应激和损伤的抵抗、细胞的寿命，故有理由推测NNMT的高表达可影响NA参与的细胞功能。NAD+在体内的含量能够维持稳定，主要归功于3种能够分解NAD+为尼克酰胺和ADP-核糖基的NAD+消化酶：ADP-核糖基转移酶(ADP-核糖转移酶ART和ADP-核糖聚合酶PARP)、CADP-核糖基合酶(CD38和CD157)和依赖NAD+的去乙酰化酶(Sirtuins，如沉默信息调控因子2，Sir2，在人类是SIRT1)，尼克酰胺作为代谢产物能抑制上述NAD+消化酶。此外，NNMT可通过消耗SAM的甲基，削弱癌细胞中其他生物大分子的甲基化水平，影响一些肿瘤相关基因的表达。Emanuelli研究组发现，NNMT过表达与口腔鳞状细胞癌分化和淋巴结转移有关，并伴有PI3K/Akt信号转导通路异常激活，故推测NNMT在细胞恶性转化的第一阶段起重要作用，RNA干扰NNMT表达可显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的成瘤性；本课题组研究结果已证实，NNMT的组织表达水平与肾细胞癌的组织类型有关，并可能是肾透明细胞癌预后的预测指标，Tang等还报道了NNMT能通过激活PI3K/Akt/SP1/MMP-2通路，促进肾透明细胞癌细胞株的增殖和侵袭；D'Andrea等的研究认为，NNMT能提高肿瘤细胞的放疗抗性，并推测与尼克酰胺参与肿瘤细胞DNA损伤后的修复有关；Parsons等的研究发现，NNMT表达上调能显著降低人多巴胺能神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞死亡，并认为这种细胞死亡与胞内ATP含量、ATP/ADP比值、复合物活性增加以及复合物的NDUFS3亚基降解减少相关；Ulanovskaya等研究表明，NNMT在多种侵袭性的肿瘤细胞系中过表达，NNMT作为代谢酶其活性与肿瘤细胞侵袭能力相关，NNMT通过消耗甲基供体SAM，可削弱肿瘤细胞甲基化的能力，并通过表观遗传修饰影响一些肿瘤相关基因的表达。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化，放疗效果，也说明NNMT是一个潜在的肿瘤标志物。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种检测尼克酰胺-N-甲基转移酶的酶联免疫试剂盒及其应用，用以检测血清、血浆、尿液等体液中尼克酰胺-N-甲基转移酶的含量。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种尼克酰胺-N-甲基转移酶的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒由尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品、对照缓冲液、尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液和辅助试剂组成；所述辅助试剂为底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液；所述底物溶液为含质量浓度3％过氧化氢和0.1mg/L的焦磷酸二氢钠的磷酸-柠檬酸缓冲液，pH7.4；所述反应终止液为2mol/L硫酸水溶液。进一步，所述尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A源自杂交瘤细胞株Zj/2D8(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCCNO：C2013149，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072，已在专利申请中2015100843562公开)，所述尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B源自杂交瘤细胞株1E7(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年8月31日，保藏编号CCTCCNO:C201167，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072，已在专利申请中2015100843562公开)。字母A、B本身没有含义，只是为了区分两者来源不同。进一步，所述对照缓冲液为pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液。进一步，所述显色液为0.1mg/ml四甲基联苯胺的甲醇溶液。进一步，所述清洗缓冲液为含质量浓度0.05％Tween-20的pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液。进一步，所述尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品用pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液配制成0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml的溶液。进一步，所述尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被的酶标板制备方法为：将尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A用0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释200倍体积后加入酶标板各孔，每孔100μl，25℃下吸附过夜，用含质量浓度0.05％Tween-20的0.02M、pH9.6磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板；所述封闭液为含2g/L的BSA、0.1g/L蔗糖的20mmol/L的PBS缓冲液，pH值为9.6。进一步，所述辣根过氧化物酶标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液是将HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B用含0.2mg/LPEG200的pH8.5、20mmol/LPBS缓冲液配制成0.5mg/L溶液。进一步，所述试剂盒组成：尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被酶标板，96孔；辣根过氧化物酶标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液1瓶，5ml/瓶；对照缓冲液1瓶，5ml/瓶；尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品1瓶，5ml/瓶；底物溶液1瓶，5ml/瓶；显色液1瓶，5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(10×浓缩)1瓶，50ml/瓶。本发明还提供一种所述酶联免疫检测试剂盒在检测尼克酰胺-N-甲基转移酶中的应用，具体所述应用为：在尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被酶标板的微孔中加入50μl待测样品，37℃水浴保温1小时，清洗缓冲液洗板操作3次，加入100μl辣根过氧化物酶标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液，37℃水浴保温1小时，清洗缓冲液重复洗板操作3次；再依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温30分钟，然后加入50μl反应终止液，结束反应；用酶标仪在450nm测定OD值，同样条件下以对照缓冲液代替待测样品作为空白对照，以pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液配制的0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml和5ng/ml的尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品溶液分别代替待测样品制作标准曲线，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标；计算标准曲线回归系数R2，当R2>0.99时，本次测定有效；计算待测样品与空白对照的OD值比值，当比值大于2时，检测结果阳性，说明待测样品中含有尼克酰胺-N-甲基转移酶，当比值小于等于2时为阴性结果；根据标准曲线，获得待测样品中尼克酰胺-N-甲基转移酶含量。本发明所述尼克酰胺-N-甲基转移酶的酶联免疫试剂盒利用一对配对良好的单克隆抗体对尼克酰胺-N-甲基转移酶进行双抗体夹心法检测其含量，比现有的多克隆夹心法具有更高的特异性，比原先的间接法检测具有更高的灵敏性，最低检测限可以达到0.05ng/mL尼克酰胺-N-甲基转移酶，并且稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4℃下可保存3年。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1试剂盒组成：尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被酶标板(96孔)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液1瓶，5ml/瓶；对照缓冲液1瓶，5ml/瓶；尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品(购自sigma，货号SRP6282)1瓶，25ng/瓶；底物溶液1瓶，5ml/瓶；显色液1瓶，5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(10×浓缩)1瓶，50ml/瓶。尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A包被酶标板的制备过程为:将50μl浓度为1mg/mL的包被用尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体A(命名为Zj/2D8，抗体的制备参照专利申请2015100843562)用0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液10ml稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，25℃下吸附过夜，用含质量浓度0.05％Tween-20的0.02M、pH9.6磷酸盐缓冲液洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含2g/L的BSA、0.1g/L蔗糖的20mmol/L的PBS缓冲液，pH值为9.6。HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B溶液是将HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B用含0.2mg/LPEG200的pH8.5、20mmol/LPBS缓冲液配制成0.5mg/L溶液。具体过程为:以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度15mg/ml。尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B(抗体命名为1E7，抗体的制备参照专利申请2015100843562)和氧化后的HRP在pH9.5的碱性碳酸盐缓冲液中透析9小时(25℃)，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再用pH7.4的PBS透析过夜。用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体B。再用含0.2mg/LPEG200的20mmol/LPBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品(购自sigma，货号SRP6282)用pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液配制成0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml的标准品溶液；对照缓冲液为pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液；底物溶液为含质量浓度3％过氧化氢和0.1mg/L的焦磷酸二氢钠的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)；显色液为0.1mg/ml四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液；反应终止液为2mol/L硫酸水溶液；清洗缓冲液(1X)为：含质量浓度0.05％Tween-20的pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液。实施例2配对抗体的优化选择用pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液分别配制尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品浓度为0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml的标准品溶液；用4株尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体包被酶标板(1E7，1F8，2F8和Zj/2D8，抗体的制备参照专利申请2015100843562)，操作方法如实施例1；用HRP标记4株(1F8、1E7、2F8、Zj/2D8)尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体，操作方法如实施例1；单抗两两交叉配对(1号组：1E7包被，1F8标记；2号组：1F8包被，1E7标记；3号组：1E7包被，2F8标记；4号组：2F8包被，1E7标记；5号组：1E7包被，Zj/2D8标记；6号组：Zj/2D8包被，1E7标记；7号组：1F8包被，2F8标记；8号组：2F8包被，1F8标记；9号组：1F8包被，Zj/2D8标记；10号组：Zj/2D8包被，1F8标记；11号组：2F8包被，Zj/2D8标记；12号组：Zj/2D8包被，2F8标记)检测0.5ng/ml的尼克酰胺-N-甲基转移酶标准溶液，具体方法如下：1)抗原-抗体反应：在1号组到12号组包被尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体酶标板的微孔中分别加入50μl浓度为0.5ng/ml的尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品溶液，以对照缓冲液为空白对照，37℃水浴保温1小时。清洗缓冲液洗板操作3次。2)根据1号组到12号组，将HRP标记的4株尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体溶液分别加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温1小时。清洗缓冲液重复洗板操作3次。3)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温30分钟，每孔再加入50μl反应终止液，结束反应。4)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录，结果如表1。表1：两两配对检测尼克酰胺-N-甲基转移酶标准溶液OD值结果结合原先4株单抗对抗原表位识别的鉴定(具体方法参照专利申请2015100843562)，只有组合5，6，9，10，11和12可以检测尼克酰胺-N-甲基转移酶，可以判断Zj/2D8对抗原识别的表位与其它3株不同，而其它3株识别的抗原表位应该相同，所以只有Zj/2D8可以与其它3株单抗配对。而配对结果中可以发现5和6组合效果较好(最低检测浓度更低和线性更好)，尤其以组合5即1E7包被，Zj/2D8标记组合效果最好，故本试剂盒选择组合5。实施例3试剂盒灵敏度考察用pH7.4、20mmol/L的PBS缓冲液分别配制尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品浓度为0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml的标准品溶液，采用实施例1试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，具体操作方法如下：1)抗原-抗体反应：在包被尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体(1E7)酶标板的微孔中分别加入不同浓度50μl各尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品溶液及对照缓冲液，37℃水浴保温1小时。清洗缓冲液洗板操作3次。2)将HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体(Zj/2D8)溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温1小时。清洗缓冲液重复洗板操作3次。3)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温30分钟，每孔再加入50μl反应终止液，结束反应。4)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。5)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2>0.99时本次测定有效；6)计算尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果见表2。表2为0.01ng/ml、0.05ng/ml，0.10ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml尼克酰胺-N-甲基转移酶标准品及对照缓冲液OD450吸光度值根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y(OD值)＝0.399x(NNMT浓度ng/mL)+0.016；R2＝0.999。上表数据表明本发明试剂盒在0.05ng/ml浓度下，灵敏度良好，并且线性极佳。实施例4试剂盒稳定性考察将实施例1试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对数据进行回归分析，计算R2值。本实施例中对比例设定如下:对比例1:试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体((Zj/2D8))溶液中不添加PEG200。对比例2:试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体(Zj/2D8)溶液中PEG200替换为胎牛血清(FBS)，浓度同PEG200。对比例3:试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含2g/L的BSA的20mmol/L的PBS缓冲液，pH值为9.6。对比例4:试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含2g/L的BSA和0.1g/L的蔗糖的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.5。稳定性结果见表3。表3各个试剂盒稳定性比较另外，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度(<0.05ng/ml)及线性良好(R2＝0.995)，与刚制备的试剂盒无明显差别。实施例5应用本发明制备尼克酰胺-N-甲基转移酶酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测精密度:随机抽取50盒不同批次试剂盒，用同一份乳腺癌阳性质控血清按实施例2操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于2％。实施例6应用本发明对临床未知样品的检测收集10例大肠癌病人的血清标本，按照实施例2的操作步骤进行测定。根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y(OD值)＝0.401x(NNMT浓度ng/mL)+0.012；R2＝0.999。空白对照缓冲液的OD值为0.005，病人血清的OD值与空白对照缓冲液的比值均大于2，为阳性结果，具体NNMT浓度可以根据标准曲线和相应OD值计算所得。表4病人血清OD值计算NNMT浓度(ng/mL)10.0430.07720.0530.10230.0830.17740.1220.27450.1250.28260.1550.35770.1810.42180.2080.48990.2790.666100.5621.372本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案,其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合,这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内,就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页1 2 3