一种阿胶的液质联用检测方法与流程

本发明涉及药材的检测方法，具体涉及阿胶的液质联用检测方法。

背景技术：

阿胶是脊索动物门哺乳纲马科动物驴的皮经煎熬、浓缩而成的干燥胶块。药用历史已有2000多年，从古至今，均作为滋阴润燥、补血止血的良药。但是，目前市场出现了许多用其他动物皮或混合皮制成的伪品，给医药市场带来了混乱，因此，如何鉴别阿胶的真伪非常重要。

中国药典上提供了一种阿胶的鉴别方法，该方法以多种氨基酸的含量作为阿胶的质量评价标准。但是，当阿胶中包含牛皮、猪皮等杂皮胶时，由于其成分、制备工艺与真品极为类似，给鉴别带来了很大的困难。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种阿胶的液质联用检测方法，它包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：取阿胶对照药材，酶水解，得到阿胶的酶水解溶液，作为对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：取阿胶供试样品，按照步骤(1)相同的方法，得到供试样品的酶水解溶液，作为供试品溶液；

(3)分别将对照品溶液和供试品溶液注入HPLC-TOF/MS液质联用仪进行检测：

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；

梯度洗脱条件为：

0～5min，5％乙腈；5～8min，5％～10％乙腈；8～32min，10％～20％乙腈；32～38min，20％～95％乙腈；38～38.1min，95％～5％乙腈；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

检测方式：正离子反应监测；

(3)将供试样品与对照品的提取离子流色谱图进行比对，即可检测出阿胶供试样品的质量状况；所述提取离子流色谱图为荷质比为536.7、765.9和834.9的提取离子流色谱图中任一种或多种。

进一步地，所述色谱条件中，色谱柱为Agilent肽柱-C18色谱柱，规格为2.1mm×100mm，2.7μm。

进一步地，所述色谱条件中，柱温为40℃。

进一步地，所述质谱条件中，毛细管电压为4kV。

进一步地，所述质谱条件中，氮气干燥气流量为10.0L/min，

进一步地，所述质谱条件中，雾化气温度为350℃。

进一步地，所述质谱条件中，喷雾压力为40Psi。

进一步地，所述质谱条件中，碎裂电压为150V。

进一步地，所述酶水解的方法如下：

取样品粉末，加入NH₄HCO₃溶液溶解，离心，取上清液，用10kDa的膜超滤，取截留液，以胰酶溶液水解，水解后，用3kDa的膜超滤，取截留液，即得酶水解溶液。

进一步地，所述NH₄HCO₃溶液的浓度为1％；水解的温度为37℃，水解的时间为12h。

本发明还提供了一种阿胶的鉴别方法，该方法是通过检测阿胶酶水解物中的特异性肽段或其组合进行鉴别的，所述特异性肽段的选自分子量为1071.5222、1529.7994或1667.8294的肽段，所述分子量为通过一级质谱的解卷积计算得到的分子量。

进一步地，所述检测阿胶酶水解物中的特异性肽段或其组合的方法，采用的是前述的液质联用检测方法。

试验结果显示，本发明的方法中，可以有效将阿胶水解出肽段分离检测出来，提取离子m/z 536.7653、m/z 765.9070、m/z 834.9236均能有效鉴别市场收集到的阿胶样品。并且，本发明中的酶水解方法，也在获取肽段方面表现出了很好的重现性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1～4依次为梯度洗脱程序1～4的色谱图。

图5～7依次为猪皮胶酶解产物、牛皮胶酶解、阿胶酶解的总离子流图。

图8为酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶13.4min一级质谱图，其中，A：酶解猪皮胶；B：酶解牛皮胶；C：酶解阿胶。

图9为酶解阿胶13.4min m/z 536.7653解卷积图。

图10为酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶27.8min一级质谱图，其中，A：酶解猪皮胶；B：酶解牛皮胶；C：酶解阿胶。

图11为酶解阿胶27.8min m/z 765.9070解卷积图。

图12为酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶35.8min一级质谱图，其中，A：酶解猪皮胶；B：酶解牛皮胶；C：酶解阿胶。

图13为酶解阿胶35.8min m/z 834.9236解卷积图。

图14-24为11组阿胶样品的总离子流图。

图25-35为11组阿胶样品提取离子m/z 536.7下的色谱图。

图36-46为11组阿胶样品提取离子m/z 765.9下的色谱图。

图47-57为11组阿胶样品提取离子m/z 834.9下的色谱图。

具体实施方式

样品：前期酶解产物，包括酶解猪皮、酶解牛皮、酶解驴皮以及酶解东阿阿胶。

试剂：乙腈、水、甲醇购自美国赛默飞世尔(中国)公司，色谱纯；甲酸购自成都科龙化工试剂厂，分析纯。

仪器：安捷伦1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司在线脱气机G1322A型、G1311A型四元泵，G315C1260型DAD检测器；液质联用仪(HPLC-TOF/MS)：1200SL系列HPLC系统联合Agilent 6210A液相色谱质谱飞行时间质谱仪；Agilent SB-C18色谱柱(3.0mm×100mm,1.8μm)1Z2N3L型；Agilent SB-C18色谱柱(3.0mm×100mm,1.8μm)4Z5N6L型；Angilent 300A型C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；Agilent肽柱-C18色谱柱(2.1mm×100mm,2.7μm)；DP-D501普通型冷冻干燥机(无锡德普仪器制造有限公司)；天津津腾GM-0.20型无油隔膜真空泵。

实施例1本发明的检测方法

样品制备条件为：称取1g样品粉末，加入40mL 1％NH₄HCO₃溶液置于50mL锥形瓶中，密封后放入水浴锅中以60℃加热30min，溶解后取出样品溶液，8000r/min离心20min，取上清液置于10kDa的超滤管中8000r/min离心40min将小分子杂质除去。然后将上述离心管滤层上的蛋白样品取出，加入1mg/mL胰酶溶液(1％NH₄HCO₃配制)。再将上述溶液在37℃水浴锅中持续反应12h。反应完后分别吸取上述样品到3kDa超滤管中，以3000r/min离心50min。这样可以除去多余的胰蛋白酶，终止酶切反应。最后将上述离心管下部的滤出液收集到一个Ep管中，置于冰箱中4℃保存备用。

质谱条件：所有样品在1200SL系列HPLC系统联合Agilent 6210A液相色谱质谱飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)下进行，采用正离子(ESI+)模式进行检测。毛细管电压(capillary voltage)4.0kV，氮气干燥气(Nitrogen drying gas)流量为10.0L/min，雾化气温度(drying gas temperature)为350℃；喷雾压力(Nebulizer)设为40Psi；碎裂电压(Fragmentor)设为150V。

液质联用条件：色谱柱为Agilent肽柱-C18色谱柱(2.1mm×100mm,2.7μm)。选用0.1％甲酸水溶液作为流动相A，选用乙腈作为流动相B。梯度0～5min，5％乙腈；5～8min，5％～10％乙腈；8～32min，10％～20％乙腈；32～38min，20％～95％乙腈；38～38.1min，95％～5％乙腈。流速0.30mL/min。柱温30℃。进样量1.0μL。在此条件下对胶原蛋白进行液质联用分析。

提取离子荷质比(m/z)为536.7(双电荷)、765.9(双电荷)、834.9(双电荷)情况下，若样品呈现与对照药材一致的明显色谱峰且杂峰含量较少，则证明为正品驴皮阿胶。反之，若荷质比(m/z)为536.7(双电荷)、765.9(双电荷)、834.9(双电荷)情况下，样品不呈现与对照药材一致的明显色谱峰且杂峰含量较多，则证明为伪品或掺伪品阿胶。

实施例2本发明梯度洗脱条件以及差异性肽段的筛选

一、梯度洗脱条件的筛选

样品为阿胶酶解产物，色谱柱选用Angilent 300A型C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，检测波长为230nm，采用流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈洗脱样品，摸索液相条件，筛选的部分梯度洗脱程序如下。

(1)梯度洗脱程序1

0～38min，5％～95％乙腈，流速0.80mL/min；柱温30℃，进样量10μL。结果如图1所示。

(2)梯度洗脱程序2

流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。0～20min，5％乙腈；20～30min，5％～10％乙腈；30～100min，10％～95％乙腈；流速0.80mL/min；柱温30℃，进样量10μL。结果如图2所示。

(2)梯度洗脱程序3

流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。0～20min，5％乙腈；20～30min，5％～10％乙腈；30～50min，10％～20％乙腈；50～100min，20％～95％乙腈；流速0.80mL/min；柱温30℃，进样量10μL。结果如图3所示。

(2)梯度洗脱程序4

流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。0～20min，5％乙腈；20～30min，5％～10％乙腈；30～50min，10％～20％乙腈；50～80min，20％～50％乙腈；80～100min，50％～95％乙腈；流速0.80mL/min；柱温30℃，进样量10μL。结果如图4所示。

通过比较，图4能呈现最佳分离效果。高效液相色谱法虽能够将酶解后阿胶多肽基本分离，但是效果较差，不能得到分离度较好的指纹图谱。但其结果为液质联用技术(HPLC-TOF-MS)的分离条件提供基础。故发明人进一步采用液质联用技术(HPLC-MS)对胶原蛋白进行分离，以寻求差异性肽段。

二、差异性肽段的筛选

(1)总离子流图比对

选用0.1％甲酸水溶液作为流动相A，选用乙腈作为流动相B。液质联用梯度条件为：0～5min，5％乙腈；5～8min，5％～10％乙腈；8～32min，10％～20％乙腈；32～38min，20％～95％乙腈；38～38.1min，95％～5％乙腈。流速0.30mL/min；柱温30℃，进样量1.0μL。

由于液质联用检测器采用了高真空，有别于高效液相，因此这里的梯度程序在筛选得到的梯度程序4基础上进行优化得到。

在此条件下对猪皮胶酶解产物、牛皮胶酶解产物、阿胶酶解产物进行液质联用分析，得到总离子流图依次如图5-7所示。

由图可见，不同皮类胶原蛋白酶解产物液质联用总离子流图较为相似。这主要是由胶原蛋白的同源性造成的，具有特征性肽段的数量在胶原蛋白序列中所占比例小，需进一步放大差异。

(2)一级质谱比对

选取三组样品中含有差异片段的时间点：13.4min、27.8min、35.8min，取该情况下的样品进行一级质谱对比，如下图。选取阿胶中高响应值特异性质荷比(m/z)肽片段做解卷积计算，再比对前期生物信息学软件预分析结果。

酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶13.4min一级质谱图如图8所示。选取此时酶解阿胶中高响应值特异性m/z 536.7653做解卷积计算，结果如图9所示。

酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶27.8min一级质谱图如图10所示。选取此时酶解阿胶中高响应值特异性m/z 765.9070做解卷积计算，结果如图11所示。

酶解猪皮胶、酶解牛皮胶、酶解阿胶35.8min一级质谱图如图12所示。选取此时酶解阿胶中高响应值特异性m/z 834.9236做解卷积计算，结果如图13所示。

上述一级质谱图的比对结果表明，酶解后的猪皮胶、牛皮胶、阿胶总离子流图及其相似，仅存在细小差异。存在差异的阿胶中特异性肽段质荷比为536.7653、765.9070、834.9236，做解卷积计算等到特异性肽段分子量为1071.5222、1529.7994、1667.8294。

因此，前述分子量的大肽段可以作为鉴定阿胶真假或掺伪的指标性成分。解卷积结果如下表1所示。

表1

用生物信息学软件Peptide Cutter模拟酶解，ExPASy PeptideMass软件系统进行胰酶酶切，本发明中仅分子量为1071.5222接近驴皮I型胶原蛋白alpha-1链中生物信息学软件酶解特异性肽段，可与另外2个分子量同时作为鉴定依据做不同胶类来源胶原蛋白酶解产物验证，择优选取特异性分子量。

三、验证实验

取下述11组不同批次的药材，按照本发明的方法进行检测

A：1号东阿阿胶；B：2号福胶；C：3号石峰阿胶；D：4号石峰阿胶；E：5号同仁堂阿胶；F：6号田雨阿胶；G：7号田雨阿胶；H：8号阿谷阿胶；I：9号阿谷阿胶；J：10号贡真堂阿胶；K：11号贡真堂阿胶。

图14-24为前述样品的总离子流图。

图25-35为提取离子m/z 536.7下的色谱图。

图36-46为提取离子m/z 765.9下的色谱图。

图47-57为提取离子m/z 834.9下的色谱图。

经验证，提取离子m/z 536.7、m/z 765.9、m/z 834.9能有效鉴别收集到的11组阿胶样品，提取离子m/z 536.7、m/z 765.9、m/z 834.9能够特异性地鉴别阿胶。

综上所述，本发明的方法有效将阿胶的各肽段分离检测出来，并且通过提取离子m/z 536.7653、m/z 765.9070、m/z 834.9236，可以有效鉴别正品阿胶与伪品，从而有效监控阿胶的质量。同时，本发明中的酶水解方法，也在获取肽段方面表现出了很好的重现性。