检测猪蓝耳病病毒抗体的elisa试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本实用新型涉及一种检测猪蓝耳病病毒抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒包括：以纯化的重组N蛋白作为包被抗原的ELISA板条、样品稀释液、酶标兔抗猪抗体、底物A液、底物B液、终止液、猪蓝耳病病毒阳性血清、猪蓝耳病病毒阴性血清、浓缩洗涤液。本实用新型试剂盒采用间接酶联免疫吸附试验的原理来检测猪蓝耳病病毒的抗体。检测时，在相应的反应孔中加入阴阳对照和待测样品，若样品中含有特异性抗体，则与吸附板孔表面的抗原结合形成抗原抗体复合物，反之则不能结合，加入酶标抗体，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中抗体的含量成正相关。
【专利说明】检测猪蓝耳病病毒抗体的ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂研制领域，具体涉及一种检测猪蓝耳病病毒抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪蓝耳病又叫猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS ),是二十世纪八十年代出现的严重危害养猪业的一种传染病。该病的主要特征是引起妊娠母猪的早产、流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔猪，仔猪主要表现为咳嗽、呼吸困难、呼吸急促。1987年美国首先报道了该病的发生，随后加拿大、德国、荷兰等国家及地区也相继爆发了该病。
[0003]本病的病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus ;PRRSV), PRRSV 由荷兰学者 Wensvoort 于 1991 年首次分离并鉴定，命名为Lelystad病毒(LV)。1992年美国首次分离到一株PRRSV，并命名为VR2332。现在，本病在世界各养猪国家、地区都有发生，已越来越多地引起人们的关注。我国于1996年首次报道有该病的发生。我国是世界养猪大国，本病在我国发生、流行的现状不容乐观。
[0004]猪繁殖与呼吸综合征自出现至今，关于本病诊断方法与研究成果不断涌现。应用最为广泛的是以全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法，即美国IDEXX公司ELISA试剂盒。由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得，该试剂盒的检测费用过高使其推广和应用受到限制。编码核衣壳蛋白的N基因在两个基因型中相当保守，当猪受到PRRSV侵袭后，机体最先产生的抗体便是针对病毒核衣壳蛋白的。本公司通过前期研究已经表达得到纯化重组N蛋白，但是还没有利用蛋白建立检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其检测方法的技术。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的是提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒，用于猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测，试剂盒特异性好、敏感性高，检测成本低廉，适于推广。在本病的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别及采取有效防制措施方面提供重要方法。
[0006]本实用新型的技术方案是:本试剂盒是采用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)的原理来检测PRRSV的抗体。检测时，在相应的反应孔中加入阴阳对照和待测样品，若样品中含有特异性抗体，则与吸附板孔表面的抗原结合形成抗原抗体复合物，反之则不能结合。洗涤后，加入酶标抗体，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中抗体的含量成正相关。
[0007]为此，本实用新型提供了一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒，包括盒体、放置试剂的下凹瓶位、96孔酶标板、8瓶试剂和一张盖板膜。其中，酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在酶标板微孔中包被重组N蛋白制成的检测板，8瓶试剂分别为浓缩洗涤液、样品稀释液、底物A液、底物B液、酶标兔抗猪抗体、终止液、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征阴性血清，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致。盒体是硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，盖板膜是塑料硬膜。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔包被重组N蛋白；浓缩洗涤液I瓶，70mL ;样品稀释液I瓶，120mL ;酶标兔抗猪抗体I瓶，60mL ;底物A液I瓶，30mL ;底物B液I瓶，30mL ;终止液I瓶，60mL ;猪繁殖与呼吸综合征阳性血清I瓶，2mL ;猪繁殖与呼吸综合征阴性血清I瓶，2mL。
[0008]经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度，相对于其他猪繁殖与呼吸综合征抗体检测方法，本试剂盒所需仪器较少，且所需仪器同类实验室一般均有配备，所需成本较低。
[0009]本实用新型的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；
[0011]图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12.8cm)；
[0012]图3为本实用新型酶标板的俯视图；
[0013]图4为本实用新型盖板膜平面图；
[0014]图5为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；
[0015]图6为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:试剂盒组装
[0017]参见附图:酶标反应微孔条(2)上具有包被重组N蛋白的反应微孔(3)，固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);塑料泡沫模具(5)有8个瓶位，放置位置依次为:2mL猪繁殖与呼吸综合征阳性血清瓶位(6)，2mL猪繁殖与呼吸综合征阴性血清瓶位(7)，70mL浓缩洗涤液瓶位(8)，30mL底物A液瓶位(9)，30mL底物B液瓶位(10)，60mL酶标兔抗猪抗体工作液瓶位(ll)，60mL终止液瓶位(12)，120mL样品稀释液瓶位(13)，盒体(14)为是硬纸盒。
[0018]实施例2:试剂盒各材料制备
[0019]1、酶标抗体的制备
[0020](I)称取辣根过氧化物酶(HRP)2 mg溶解于0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/L Na14溶液，4°C避光作用30 min ；
[0021](2)加入 160 mmol/L 的乙二醇 0.5mL,室温作用 30 min ；
[0022](3)加入兔抗猪抗体2 mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000 mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4°C过夜；
[0023](4)透析液吸至10 mL的离心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混匀后置4°C 2h ；
[0024](5)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4°C作用30 min后4°C下3000 r/min离心25min,弃上清；
[0025](6)将沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4°C过夜(中途更换PBS 3次)；
[0026](7)将透析袋中液体吸至微量离心管中，4°C下10000r/min离心30min,将上清液吸出，加等量甘油，混匀，_20°C保存备用。
[0027]2、包被有重组N蛋白的酶标板及其制备
[0028](I)用0.05M的碳酸盐溶液将重组N蛋白稀释至2.5ng/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔ΙΟΟμ L，37°C温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150 μ L封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0029](2)包被缓冲液:pH9.6,0.05mol/L的碳酸钠缓冲液；
[0030](3)封闭液:每I升封闭液按照如下方法配制:将5mL马血清、Ig叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至100mL,得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为 0.02M, pH 值为 7.2。
[0031]实施例3:样本的前处理
[0032]1、配液:
[0033]洗涤工作液:用去离子水将20X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。
[0034]2、猪血清或血浆样品处理:
[0035](I)样品制备:取猪血，按常规方法制备血清或血浆，要求清亮无溶血；
[0036](2)用样品稀释液在血清稀释板或离心管中将猪血清或血浆按1:40 (I份猪血清或血浆+39份样品稀释液)稀释，混匀；
[0037](3 )取100 μ L进行检测。
[0038]注:稀释系数:40 ;阴性对照和阳性对照无须稀释。
[0039]实施例4:使用试剂盒的操作步骤
[0040]1、酶标板上对照和待测样品添加模式如附图所示；
[0041]附图酶标板上对照和待测样品添加模式
[0042]I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AX SI S 2 S3 S 4
3X
CP
DP
F
?rr
[0043]注:N-表示加阴性对照；P-表示加阳性对照；SI，S2, S3, S4等表示加各种被检样品。
[0044]2、在Al和BI抗体包被孔中加入阴性对照100 μ L ;在Cl和Dl抗体包被孔中加入阳性对照10yL;
[0045]3、在各样品孔中加入处理好的被检样品100 μ L ;
[0046]4、盖上盖板膜，于37 °C恒温培养箱下，孵育30 min ；
[0047]5、开盖板膜，甩去孔内液体，用洗涤工作液洗涤酶标板，300 μ L/孔，洗涤4次，拍干;
[0048]6、立即在各孔中加入酶标抗体，100 μ L/孔；
[0049]7、盖上盖板膜，于37 °C恒温培养箱下，孵育30 min ；
[0050]8、揭开盖板膜，甩去孔内液体，用洗涤工作液洗涤酶标板，300 μ L/孔，洗涤4次，拍干;
[0051 ]9、将底物A液与底物B液按1:1混合，加入孔中，100 μ L/孔，盖上盖板膜，室温(25士 2 0C)下，避光反应15 min ；
[0052]10、揭开盖板膜，每孔中加入100 μ L终止液；
[0053]11、在酶标仪上读取OD65tl值(应在加入终止液后5 min内完成读数)。
[0054]实施例5:结果判定
[0055]1、NC值〈0.200且0.500 < PC值彡2.000，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。
[0056]2、如果被检样品孔OD值〈0.45，说明样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体；如果被检样品孔OD值>0.45，说明样品中有猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。
[0057]实施例6:注意事项
[0058]1、本品仅供体外检测使用。
[0059]2、不同批号试剂盒中的组份不可混用。
[0060]3、勿使用过期的试剂盒，已开封的组份应在有效期内使用。
[0061]4、在每次使用时，酶标板上均应分别设立阳性对照和阴性对照各2孔。
[0062]5、必须使用符合药典规定的水(如蒸馏水、去离子水或纯水)稀释洗涤液。
[0063]6、试剂盒各组份在使用前应预先平衡至室温(25±2°C)，否则将直接影响实验结果O
[0064]7、末使用的酶标板应放回铝箔袋并封口，2?8 °C保存。
[0065]8、应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。
[0066]9、浓缩洗涤液和终止液在低温(2?8°C)储存时可能出现结晶，须室温完全溶解混匀后使用。
[0067]10、勿将底物溶液暴露于强光下。
[0068]11、本品终止液为硫酸，避免终止液同眼、皮肤接触。
[0069]12、移液系统应保证准确清洁，应提供准确溶液体积的同时不造成交叉污染。
[0070]13、样品的运输须按国家的有关规定进行。
【权利要求】
1.一种检测猪蓝耳病病毒抗体的ELISA试剂盒，包括盒体、放置试剂的下凹瓶位、96孔酶标板、8瓶试剂和一张盖板膜，其特征在于:酶标板是米用96孔试剂板作为固相载体,在酶标板微孔中包被重组N蛋白制成的检测板，8瓶试剂分别为浓缩洗涤液、样品稀释液、底物A液、底物B液、酶标兔抗猪抗体、终止液、猪蓝耳病病毒阳性血清、猪蓝耳病病毒阴性血清，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于:所属的盒体是硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，盖板膜是塑料硬膜。
3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于:酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔包被重组N蛋白；浓缩洗漆液I瓶,70mL ;样品稀释液I瓶,120mL ;酶标兔抗猪抗体I瓶，60mL ;底物A液I瓶，30mL ;底物B液I瓶，30mL ;终止液I瓶，60mL ;猪蓝耳病病毒阳性血清I瓶，2mL ;猪蓝耳病病毒阴性血清I瓶，2mL。
【文档编号】G01N33/68GK204008662SQ201420201362
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】胡蒙蒙, 王世恩, 吴小平, 赵杰, 樊宇飞, 姚琳, 许舒婷 申请人:北京维德维康生物技术有限公司