一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，其中，该检测试剂盒包括：凝集素、封闭液、生物素标记的抗体、辣根过氧化物酶标记的链亲和素、3',3',5',5'-四甲基联苯胺底物显色液、终止液以及清洗缓冲液；检测方法包括如下步骤：基于凝集素与寡糖链的特异性识别，将凝集素固定于聚苯乙烯固相载体上用于识别并结合样本中的糖蛋白，再通过蛋白质与其抗体的特异性结合，识别出所需检测的糖蛋白，并实现对该糖蛋白的半定量分析。本发明不仅可以实现单一蛋白质糖基化亚型的半定量检测，同时操作简便，成本较低。
【专利说明】一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质及其翻译后修饰检测【技术领域】，具体涉及一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]糖基化(Glycosylat1n)是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，约一半以上的哺乳动物蛋白质都发生了糖基化。通过影响蛋白质的溶解度、折叠、定位以及构象的维持，它可以调节蛋白质的功能和降解，从而介导分子与分子之间、分子与细胞之间、细胞与细胞之间的相互作用。近年来，蛋白质糖基化在肿瘤方面的研宄日益兴起。大量研宄表明，蛋白质糖基化在肿瘤细胞恶性转化、迀移、侵袭的过程中会发生改变并有相应的功能性作用。在临床诊断领域，蛋白质糖基化亚型是一种重要的恶性肿瘤标志物。在多种肿瘤，如肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌等，的肿瘤组织或患者血清中，一些糖蛋白糖基化亚型被发现与正常或良性对照组之间存在显著性差异。因此，建立高灵敏度、选择性强、操作简便的蛋白质糖基化检测方法，对于癌症的早期诊断及治疗具有十分重要的意义。
[0003]目前，对于蛋白质的糖基化检测主要是通过凝集素(Lectin)与糖链的特异性结合。简强等建立的凝集素芯片技术通过将多种特异性识别不同糖链结构的凝集素固定在环氧化片基上，再与待测样本反应，实现了对糖蛋白快速、高通量的分析。Jung-Hyun Rho等利用高效液相色谱技术(High performance liquid chromatography，HPLC)与串联质谱技术(MS/MS)联用，可实现糖肽的分离和鉴定。此外，凝集素印迹、凝集素组织化学等方法也可用于组织或体液样本中蛋白质糖链的检测。但这些方法操作复杂，反应步骤多，耗时长，需要配备价格昂贵的实验设备；此外，这些技术均不能实现生物样本中特定蛋白质的某种糖基化修饰亚型的检测，不适用于临床肿瘤标志物的实时、快速检测。对于已经发现的一些可用作肿瘤诊断标志物的蛋白质糖基化亚型，如岩藻糖基化的甲胎蛋白等，开发适用于临床的实时、快捷、较高灵敏度的检测方法是非常有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决生物样品中蛋白质糖基化亚型的检测问题，提供了一种蛋白质糖基化亚型检测的试剂盒及其检测方法，其不仅可以实现单一蛋白质糖基化亚型的半定量检测，同时操作简便，成本较低。
[0005]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现:
[0006]一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒，包括:
[0007]凝集素:固定在聚苯乙烯固相载体上后，利用其糖识别域特异性识别并结合糖蛋白上的寡糖链，凝集素包被浓度为3?30 μ g/mL ；
[0008]封闭液:含0.025 ?0.05g/mL 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS,pH = 6?8)，用于封闭未与凝集素结合的固相载体位点，降低背景值；
[0009]生物素标记的抗体:用于特异性结合凝集素捕获的糖蛋白中的目标蛋白，且生物素-亲和素系统有级联放大作用，使用时用含体积分数为0.02?0.1% Tween-20的PBST (pH = 6 ?8)稀释至 100 ?2000 倍；
[0010]辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的链亲和素:结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子发生反应，起到了级联放大作用，且辣根过氧化物酶在遇到催化底物后显色，达到检测目标糖蛋白糖基化亚型的目的，使用时用含体积分数为 0.02 ?0.1 % Tween-20 的 PBST (pH = 6 ?8)稀释至 2000 ?10000 倍；
[0011]3，，3，，5，，5，-四甲基联苯胺(3，，3’，5’，5’ -Tetramethylbenzidine, TMB)底物显色液:在辣根过氧化物酶催化下可形成可溶性蓝色产物，用于半定量检测目标糖蛋白；
[0012]终止液?2mol/L硫酸，用于终止上诉催化反应；
[0013]清洗缓冲液:含体积分数为0.1 %?0.2% Tween-20的PBST，pH = 6?8。
[0014]一种蛋白质糖基化亚型的检测方法，包括以下步骤:
[0015]I)将凝集素用pH = 9?9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3?30 μ g/mL后，包被于96孔板的每个聚苯乙烯反应孔内，每孔中加入凝集素50?200 μ L，2?6°C静置12?18h ；
[0016]2)将封闭液加入反应孔内，每孔加200?300 μ L，封闭未与凝集素结合的部位，室温孵育I?3h ;
[0017]3)用清洗缓冲液清洗96孔板4次；
[0018]4)将生物样品(组织裂解液、细胞裂解液或血清等)用含0.005?0.015g/mLBSA的PBS (pH = 6?8)稀释后加入96孔板，加50?200 μ L于上述已包被的各反应孔中，室温孵育I?3h ;待反应结束后，用清洗缓冲液清洗96孔板4次；
[0019]5)用含体积分数为0.02?0.1 % Tween-20的PBST稀释生物素标记的特异性抗体100?2000倍，加50?200 yL至各反应孔内，室温孵育I?3h ;反应结束后，用清洗缓冲液洗板子4次；其中，含Tween-20的PBST的pH = 6?8 ;
[0020]6)用含体积分数为0.02?0.1 % Tween-20的PBST稀释HRP标记的链亲和素2000?10000倍，加50?200 μ L至96孔板，室温孵育0.5?1.5h，用清洗缓冲液洗板子4-5 次；
[0021]7)各反应孔中加入50?200 μ LTMB底物显色液，室温孵育15?20min;
[0022]8)各孔中加入50?100 μ L终止液终止反应；
[0023]9)待反应完成后，利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值，对待测样本中的目标蛋白质糖基化亚型进行半定量检测。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0025]1、本发明提供的蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，是首个可以实现针对单一蛋白质某一特定糖基化修饰亚型进行检测的方法，可以对样本中目标糖蛋白糖基化亚型的含量进行半定量测定；对各种生物样本中蛋白质糖基化亚型的检测具有广泛适用性。
[0026]2、本发明提供的蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，是一种基于凝集素和抗体的酶联免疫吸附检测试剂盒及其检测方法。通过凝集素与寡糖链、抗原与抗体、生物素与链亲和素等反应级联放大，然后将其转化为方便检测的信号，从而实现糖蛋白糖基化亚型的半定量检测。
[0027]3、本发明提供的蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，利用凝集素和抗体分别识别糖蛋白的糖链结构和蛋白质抗原本身，在检测前无需将目标糖蛋白从生物样本中提取纯化，可以直接应用收集的生物样本进行检测。该方法不仅提高了检测效率，同时不需要复杂的纯化仪器设备；此外避免了蛋白质纯化过程对目标糖蛋白活性、结构等的不利影响。
[0028]4、本发明提供的蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，为了克服抗体本身携带的糖链对于目标糖蛋白糖链检测的干扰，采用凝集素包被聚丙乙烯孔，然后加入待测样本，最后加入抗体的实验方法，使得先加入反应孔内的待测样本中过量的糖蛋白足以封闭所有的凝集素结合位点，并形成空间位阻效应，从而达到避免抗体的糖链与凝集素相结合，降低背景值的目的。
[0029]5、本发明提供的蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒及其检测方法，与以往蛋白质糖基化检测的方法操作相比，操作更加简便，步骤少，且不需要昂贵的设备。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是实施例1中不同稀释倍数血清样品半乳糖基化α 1-抗胰蛋白酶亚型的吸光度检测结果图；
[0031]图2是实施例2中不同稀释倍数血清样品岩藻糖基化α 1_抗胰蛋白酶亚型的吸光度检测结果图；
[0032]图3是实施例3中不同稀释度血清样品聚乳糖胺基化α 1-抗胰蛋白酶亚型的吸光度检测结果图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0034]实施例1:
[0035]I)将西非单叶豆凝集素(Bandeiraea simplicifolia，BS-1)用 pH = 9.6 的碳酸盐缓冲液溶解并稀释至3 μ g/mL，加入96孔板的每个聚苯乙烯反应孔内，使其覆盖整个孔底，每孔中加入该凝集素溶液100 yL，4°C过夜。
[0036]2)次日，弃去孔内凝集素溶液，每孔加入200 μ L封闭液，封闭未与凝集素结合的部位，室温孵育Ih。
[0037]3)用清洗缓冲液清洗96孔板4次，每次清洗时清洗缓冲液应加满整个反应孔，轻柔摇动3min，弃去孔内液体并在吸水纸上拍干。
[0038]4)将血清样本用含 0.01g/mL BSA 的 PBS (pH = 7.4)按 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释后分别加入96孔板，每孔加100 μ L，室温孵育Ih ；
待反应结束后，用清洗缓冲液清洗96孔板4次。
[0039]5)用含体积分数为0.05% Tween-20的PBST(pH = 7.4)将生物素标记的α 1-抗胰蛋白酶抗体稀释100倍，每孔加入100 μ L，室温孵育Ih ;反应结束后，用清洗缓冲液洗板子4次。
[0040]6)用含体积分数为0.05 % Tween-20的PBST (pH = 7.4)将HRP标记的链亲和素稀释2000倍，每孔加入100 μ L，室温孵育30min。用清洗缓冲液洗板子5次。
[0041]7)于各反应孔中加入100 μ LTMB底物显色液，室温孵育15?20min。
[0042]8)于各孔中加入50 μ L终止液终止反应。
[0043]9)待反应完成后，利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值，对不同稀释倍数血清样品中半乳糖基化α 1-抗胰蛋白酶亚型进行半定量检测。
[0044]具体检测结果如图1所示，横坐标为血清稀释倍数，纵坐标为吸光度。实施例1中凝集素BS-1特异性识别半乳糖和N-乙酰半乳糖，α 1-抗胰蛋白酶抗体可与α 1-抗胰蛋白酶特异性结合，联合检测半乳糖基化α 1-抗胰蛋白酶亚型的血清水平。
[0045]实施例2:
[0046]I)将橙黄网胞盘菌凝集素(Aleuria Aurantia Lectin，AAL)用pH = 9.6的碳酸盐缓冲液溶解并稀释至3 μ g/mL，加入96孔板的每个聚苯乙烯反应孔内，使其覆盖整个孔底，每孔中加入该凝集素溶液100 yL，4°C过夜。
[0047]2)次日，弃去孔内凝集素溶液，每孔加入200 μ L封闭液，封闭未与凝集素结合的部位，室温孵育Ih。
[0048]3)用清洗缓冲液清洗96孔板4次，每次清洗时清洗缓冲液应加满整个反应孔，轻柔摇动3min，弃去孔内液体并在吸水纸上拍干。
[0049]4)将血清样本用含 0.01g/mL BSA 的 PBS (pH = 7.4)按 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释后分别加入96孔板，每孔加100 μ L，室温孵育Ih ；
待反应结束后，用清洗缓冲液清洗96孔板4次。
[0050]5)用含体积分数为0.05% Tween-20的PBST(pH = 7.4)将生物素标记的α 1-抗胰蛋白酶抗体稀释100倍，每孔加入100 μ L，室温孵育Ih ;反应结束后，用清洗缓冲液洗板子4次。
[0051]6)用含体积分数为0.05% Tween-20的PBST (pH = 7.4)将HRP标记的链亲和素稀释2000倍，每孔加入100 μ L，室温孵育30min。用清洗缓冲液洗板子5次。
[0052]7)于各反应孔中加入100 μ LTMB底物显色液，室温孵育15?20min。
[0053]8)于各孔中加入50 μ L终止液终止反应。
[0054]9)待反应完成后，利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值，对不同稀释倍数血清样品中岩藻糖基化α 1-抗胰蛋白酶亚型进行半定量检测。
[0055]具体检测结果如图2所示，横坐标为血清稀释倍数，纵坐标为吸光度。实施例2中凝集素AAL特异性识别岩藻糖，α 1-抗胰蛋白酶抗体可与α 1-抗胰蛋白酶特异性结合，联合检测岩藻糖基化α 1-抗胰蛋白酶亚型的血清水平。
[0056]实施例3:
[0057]I)将美洲商路凝集素(Phytolacca americana，PWM)用pH = 9.6的碳酸盐缓冲液溶解并稀释至3 μ g/mL，加入96孔板的每个聚苯乙烯反应孔内，使其覆盖整个孔底，每孔中加入该凝集素溶液100 μ L，4°C过夜。
[0058]2)次日，弃去孔内凝集素溶液，每孔加入200 μ L封闭液，封闭未与凝集素结合的部位，室温孵育Ih。
[0059]3)用清洗缓冲液清洗96孔板4次，每次清洗时清洗缓冲液应加满整个反应孔，轻柔摇动3min，弃去孔内液体并在吸水纸上拍干。
[0060]4)将血清样本用含 0.01g/mL BSA 的 PBS (pH = 7.4)按 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释后分别加入96孔板，每孔加100 μ L，室温孵育Ih ；
待反应结束后，用清洗缓冲液清洗96孔板4次。
[0061]5)用含体积分数为0.05% Tween-20的PBST(pH = 7.4)将生物素标记的α 1-抗胰蛋白酶抗体稀释100倍，每孔加入100 μ L，室温孵育Ih ;反应结束后，用清洗缓冲液洗板子4次。
[0062]6)用含体积分数为0.05 % Tween-20的PBST (pH = 7.4)将HRP标记的链亲和素稀释2000倍，每孔加入100 μ L，室温孵育30min。用清洗缓冲液洗板子5次。
[0063]7)于各反应孔中加入100 μ L TMB底物显色液，室温孵育15?20min。
[0064]8)于各孔中加入50 μ L终止液终止反应。
[0065]9)待反应完成后，利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值，对不同稀释度血清样品中聚乳糖胺基化α 1-抗胰蛋白酶亚型进行半定量检测。
[0066]具体检测结果如图3所示，横坐标为血清稀释倍数，纵坐标为吸光度。实施例3中凝集素PWM特异性识别聚乳糖胺，α 1-抗胰蛋白酶抗体可与α 1_抗胰蛋白酶特异性结合，联合检测聚乳糖胺基化α 1-抗胰蛋白酶亚型的血清水平。
[0067]上述实施例1、2、3中使用的生物素标记的α 1-抗胰蛋白酶抗体购自Abcam公司，实施例1、2、3中使用的HRP标记的链亲和素、TMB底物显色液均购自Sigma-Aldrich公司，实施例1、2中使用的凝集素BS-1、AAL购自Vector公司，实施例3中使用的凝集素PWM购自 Sigma-Aldrich 公司。
【权利要求】
1.一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒，其特征在于，包括: 凝集素:固定在聚苯乙烯固相载体上后，利用其糖识别域特异性识别并结合糖蛋白上的寡糖链，凝集素包被浓度为3?30 μ g/mL ； 封闭液:含0.025?0.05g/mL牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH = 6?8，用于封闭未与凝集素结合的固相载体位点，降低背景值； 生物素标记的抗体:用于特异性结合凝集素捕获的糖蛋白中的目标蛋白，且生物素-亲和素系统有级联放大作用； 辣根过氧化物酶标记的链亲和素:结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子发生反应，起到了级联放大作用，且辣根过氧化物酶在遇到催化底物后显色，达到检测目标糖蛋白糖基化亚型的目的； 3’，3’，5’，5’ -四甲基联苯胺底物显色液:在辣根过氧化物酶催化下能够形成可溶性蓝色产物，用于半定量检测目标糖蛋白； 终止液?2mol/L硫酸，用于终止上诉催化反应； 清洗缓冲液:含体积分数为0.1?0.2% Tween-20的PBST，pH = 6?8。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒，其特征在于，生物素标记的抗体使用时用含体积分数为0.02?0.1 % Tween-20的PBST稀释至100?2000倍。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质糖基化亚型的检测试剂盒，其特征在于，使用时，辣根过氧化物酶标记的链亲和素用含体积分数为0.02?0.1% Tween-20的PBST稀释至2000 ?10000 倍。
4.一种蛋白质糖基化亚型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将凝集素用pH= 9?9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3?30 μ g/mL后，包被于孔板的每个聚苯乙烯反应孔内，每个孔中加入凝集素50?200 μ L，2?6°C静置12?18h ； 2)将封闭液加入反应孔内，每孔加200?300μ L，封闭未与凝集素结合的部位，室温孵育I?3h ; 3)用清洗缓冲液清洗孔板； 4)将生物样品用含0.005?0.015g/mL BSA的PBS稀释后加入孔板，加50?200 μ L于上述已包被的各反应孔中，室温孵育I?3h ;待反应结束后，用清洗缓冲液清洗孔板；其中，含BSA的PBS的pH = 6?8 ; 5)用含体积分数为0.02?0.1 % Tween-20的PBST稀释生物素标记的特异性抗体100?2000倍，加50?200 μ L至各反应孔内，室温孵育I?3h ;反应结束后，用清洗缓冲液洗板子4次；其中，含Tween-20的PBST的pH = 6?8 ; 6)用含体积分数为0.02?0.1 % Tween-20的PBST稀释HRP标记的链亲和素2000?10000倍，加50?200 μ L至孔板，室温孵育0.5?1.5h，然后用清洗缓冲液洗孔板； 7)各反应孔中加入50?200μ LTMB底物显色液，室温孵育15?20min ； 8)各孔中加入50?100μ L终止液终止反应； 9)待反应完成后，利用酶标仪检测各反应孔在波长为450nm处的吸光度值，对待测样本中的目标蛋白质糖基化亚型进行半定量检测。
5.根据权利要求4所述的一种蛋白质糖基化亚型的检测方法，其特征在于，孔板选用96孔板。
6.根据权利要求4所述的一种蛋白质糖基化亚型的检测方法，其特征在于，生物样品为组织裂解液、细胞裂解液或血清。
【文档编号】G01N33/68GK104502611SQ201410826200
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】梁一倩, 陈明伟 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院