一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及细胞增殖检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒。该方法包括：将第一待测血液样本与淋巴细胞多克隆激活剂混合，经细胞培养，获得第一血液细胞；将荧光标记的淋巴细胞表面标记抗体与第一血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝对计数用微球，采用流式细胞术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据淋巴细胞数量、绝对计数用微球数量和绝对计数用微球浓度获得刺激组淋巴细胞的浓度。本发明不仅可检测淋巴细胞各亚群的增殖比例，还可检测淋巴细胞各亚群增殖的绝对值，可准确反应淋巴细胞的增殖情况；使用全血进行增殖实验，不需要分离PBMC，血标本量要求很小；操作步骤简易，耗时短，误差较小。
【专利说明】一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞增殖检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况 的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 原发免疫缺陷病（Primaryimmunodeficiencydisease,PID)系因相关基因突变导 致免疫细胞或其组成成分量或质的变化，导致机体对多种病原体易感性显著增高的疾病。 迄今已发现的约200多种PID中，已有200余个基因突变被明确。而免疫功能评估对PID的 诊断及预后具有重要意义。一方面，已经基因确诊的PID患儿进行免疫功能评估有助于判 断患儿的病情严重程度，指导临床用药，为临床治疗以及造血干细胞移植提供参考意见；另 一方面，对疑诊的PID患儿进行免疫功能评估可以为诊断提供线索，并为下一步基因筛查 及诊断治疗提供帮助。免疫功能的初步评估通常运用全血细胞计数，总的和特异的免疫球 蛋白水平测定，联合分析补体系统，评估淋巴细胞不同亚群的数量。但是这些检测指标还不 够，因为PID的临床表现不一定是由于细胞数量的减少导致，而是跟细胞功能的缺失有关。
[0003] 淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞 增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。目前，检测淋巴细胞增殖 水平的方法主要包括形态学观察法、放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)掺入法、核苷类似物 (BrDU)溴脱氧尿苷掺入法、细胞能量代谢测定（MTT比色法）和CFSE(羧基荧光素乙酰酸琥 珀酰亚胺酯）染色流式测定法：
[0004](一）形态学观察法
[0005] 形态学观察法是依据淋巴母细胞转化的形态学特征，借助光学显微镜进行检测。 但其存在多种不足，主要体现在：用形态观察的方法判断淋巴细胞增殖情况，准确性较差； 该法只能分析总的淋巴细胞的增殖情况，无法判断淋巴细胞亚群的增殖情况；需要分离外 周血单个核细胞（PBMC)，血标本量要求较大（通常>4mL)，在小年龄患者中收集标本更困 难；该法只能计算淋巴细胞增殖比例，不能得到细胞增殖的绝对值。
[0006] (二）放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)掺入法
[0007] 放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)掺入法是指增殖的细胞其新合成DNA需摄取核苷 酸原料，故可用核素标记的核苷酸参与反应，通过测定放射性强度以反映淋巴细胞增殖水 平。其不足之处包括：标记为放射性核素，存在放射性污染危险；该法只能分析总的淋巴细 胞的增殖情况，无法判断淋巴细胞亚群的增殖情况；需要分离PBMC，血标本量要求较大（通 常>4mL)，在小年龄患者中收集标本更困难；该法只能计算淋巴细胞增殖比例，不能得到细 胞增殖的绝对值。
[0008] (三）核苷类似物（BrDU)溴脱氧尿苷掺入法
[0009] 核苷类似物（BrDU)溴脱氧尿苷掺入法的原理同放射性核素掺入法的原理近似， 其不足之处包括：该法敏感度不高；该法只能分析总的淋巴细胞的增殖情况，无法判断淋 巴细胞亚群的增殖情况；需要分离PBMC，血标本量要求较大（通常>4mL)，在小年龄患者中 收集标本更困难；该法只能计算淋巴细胞增殖比例，不能得到细胞增殖的绝对值。
[0010](四）细胞能量代谢测定（MTT比色法）
[0011] 细胞能量代谢测定（MTT比色法）是指活细胞内有活性的线粒体作用于噻唑蓝 (MTT)，可生产蓝黑色甲替产物，其生成量与细胞代谢活跃程度呈正相关，由此间接定量分 析细胞增殖水平。其不足之处包括：该法为间接评估淋巴细胞增殖状况的方法，是通过计算 活细胞的比率，而非直接检测分裂的细胞数；该法只能分析总的淋巴细胞的增殖情况，无法 判断淋巴细胞亚群的增殖情况；需要分离PBMC，血标本量要求较大（通常>4mL)，在小年龄 患者中收集标本更困难；该法只能计算淋巴细胞增殖比例，不能得到细胞增殖的绝对值。
[0012] (五）CFSE(羧基荧光素乙酰酸琥珀酰亚胺酯）染色流式测定法
[0013]CFSE(羧基荧光素乙酰酸琥珀酰亚胺酯）染色流式测定法是指用流式细胞术检测 增殖后的CFSE标记的细胞，以及该群细胞的表面标志分子，从而分析目标细胞的增殖动力 学。由于CFSE是非极性分子，可自由扩散进入细胞，在胞内酯酶水解后产生具有荧光特性 的CFSE，并与胞内蛋白的赖氨酸等胺基发生不可逆偶联，形成稳定的大分子荧光结合物。当 细胞分裂时，荧光结合物平均分配到两个子细胞中，而荧光强度为亲代细胞的一半。在一个 增殖细胞群体中，连续各代细胞的荧光强度表现为二倍递减的特征，所以CFSE标记的细胞 在增殖后具有系列减半的荧光强度这一特点。其不足之处包括：需要分离PBMC，血标本量 要求较大（通常>4mL)，在小年龄患者中收集标本更困难；PBMC的提取后，通常后续要多次 洗涤，可能活化，损伤，或选择性地丢失细胞；该法只能计算淋巴细胞增殖比例，不能得到细 胞增殖的绝对值；操作步骤繁复，误差较大，而且该方法是基于在刺激组和未刺激组的最初 的PBMC数量（而不是淋巴细胞数量）是相同的，而且后续多次的洗涤吹打可能引入更多的 误差；CFSE染色要求均匀，CFSE高浓度时有一定毒性。
[0014] 基于上述几种淋巴细胞增殖水平检测方法存在的不足，急需开发一种不需要分离 PBMC，血液标本量要求少，不仅能得到淋巴细胞增殖比例和绝对值，还可以得到分析总的淋 巴细胞的增殖情况和淋巴细胞各亚群的增殖情况，操作简易、误差小的淋巴细胞增殖水平 的检测方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0015] 有鉴于此，本发明提供了一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂 盒。该方法不仅可以检测淋巴细胞各亚群的增殖比例，还可以检测淋巴细胞各亚群增殖的 绝对值，可准确反应淋巴细胞的增殖情况；使用全血进行增殖实验，不需要分离PBMC，血标 本量要求很小，最多只需要300yL，是现有技术用血量的5% ;操作步骤简易，耗时短，误差 较小。
[0016] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0017] 本发明提供了一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法，包括如下步骤：
[0018] 将第一待测血液样本与淋巴细胞多克隆激活剂混合，经细胞培养，获得第一血液 细胞；将荧光标记的淋巴细胞表面标记抗体与第一血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝 对计数用微球，采用流式细胞术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据淋巴细胞 数量、绝对计数用微球数量和绝对计数用微球浓度获得刺激组淋巴细胞的浓度；
[0019] 将第二待测血液样本进行细胞培养，获得第二血液细胞；将荧光标记的淋巴细胞 表面标记抗体与第二血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝对计数用微球，采用流式细胞 术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据淋巴细胞数量、绝对计数用微球数量和 绝对计数用微球浓度获得未刺激组淋巴细胞的浓度；
[0020] 比较刺激组淋巴细胞的浓度与未刺激组淋巴细胞的浓度，获得淋巴细胞增殖情 况；
[0021] 第一待测血液样本与所述第二待测血液样本的来源相同。
[0022] 淋巴细胞（lymphocyte)是白细胞的一种，由淋巴器官产生，机体免疫应答功能的 重要细胞成分，是体内极为复杂的不均一细胞群体，包括许多形态上相似而功能不同的亚 群，功能和表面标记各不相同，具有明显的异质性。根据淋巴细胞的发育部位、表面、抗原、 受体及功能等不同，可将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等多种。T淋巴细 胞和B淋巴细胞是其中最主要的两大群体。
[0023] T淋巴细胞（又名T细胞）和B淋巴细胞（又名B细胞）都起源于造血干细胞。T 细胞随血循环到胸腺，在胸腺激素等的作用下成熟，然后再随血循环到周围淋巴器官，在各 自既定的区域定居、繁殖。受抗原激活即分化增殖，产生效应细胞，行使其免疫功能。T淋巴 细胞的免疫功能主要是抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等。B细胞则在骨髓或腔上囊发育成 熟，可以释放淋巴因子促进T细胞的形成。B淋巴细胞可以增殖分化为效应B淋巴细胞（所 谓的浆细胞）和记忆B淋巴细胞，而效应B淋巴细胞可以释放抗体（免疫球蛋白），作用于 抗原，形成沉淀物，最终被吞噬细胞吞噬。淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程的一 个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常 用方法。
[0024] 在淋巴细胞表面具有可供鉴别的特殊结构，这一特殊结构为表面标记。在淋巴细 胞的不同分化阶段，其各种表面标记的表达也各不相同。淋巴细胞与其它细胞之间、与周围 环境中的分子间的相互作用以及淋巴细胞识别抗原、活化、辅助、抑制、杀伤等生物学作用 均与其表面标记有关。因此，淋巴细胞表面标记可用于淋巴细胞及其亚群的鉴别。淋巴细 胞表面标记主要包括簇分化抗原（⑶)、组织相容性抗原（MHC)等。
[0025] CD是淋巴细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的淋巴细胞可表达 不同的分化抗原，这是区分淋巴细胞的重要标记。淋巴细胞表面主要⑶抗原及其分布见表 1〇
[0026] 表1参与免疫应答的细胞表面主要⑶抗原及其分布
[0027]
【权利要求】
1. 一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法，其特征在于，包括如下步骤： 将第一待测血液样本与淋巴细胞多克隆激活剂混合，经细胞培养，获得第一血液细胞； 将荧光标记的淋巴细胞表面标记抗体与所述第一血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝 对计数用微球，采用流式细胞术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据所述淋巴 细胞数量、所述绝对计数用微球数量和绝对计数用微球浓度获得刺激组淋巴细胞的浓度； 将第二待测血液样本进行细胞培养，获得第二血液细胞；将荧光标记的淋巴细胞表面 标记抗体与所述第二血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝对计数用微球，采用流式细胞 术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据所述淋巴细胞数量、所述绝对计数用微 球数量和绝对计数用微球浓度获得未刺激组淋巴细胞的浓度； 比较所述刺激组淋巴细胞的浓度与所述未刺激组淋巴细胞的浓度，获得淋巴细胞增殖 情况； 所述第一待测血液样本与所述第二待测血液样本的来源相同。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞表面标记抗体为T淋巴细胞 表面标记抗体和/或B淋巴细胞表面标记抗体。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述T淋巴细胞表面标记抗体为CD3抗 体、⑶8抗体、⑶45抗体、⑶4抗体、⑶14抗体或⑶15抗体中的一种或两者以上的混合物。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述B淋巴细胞表面标记抗体包括CD3抗 体、⑶45抗体、⑶19抗体、⑶14抗体或⑶15抗体中的一种或两者以上的混合物。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞多克隆激活剂为PWM或 PHA。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测血液样本的用量不大于300 y L。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养具体为在35°C?40°C、4? 6% C02的条件下培养5?10天。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育具体为：在20°C?30°C避光条 件下孵育1〇?30min。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解所用的试剂为溶血素。
10. -种检测淋巴细胞增殖情况的试剂盒，其特征在于，包括淋巴细胞多克隆激活剂、 荧光标记的淋巴细胞表面标记抗体，溶血素、绝对计数用微球和抗凝剂。
【文档编号】G01N15/10GK104458539SQ201410786994
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】赵晓东, 秦涛 申请人:重庆医科大学附属儿童医院