一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法，其特征是：利用光学各向异性的贵金属纳米材料，在控制湿度和温度条件下，通过自然蒸发的方式，晾干在硅片基底上形成方向可控、排布规则的三维超晶体；将待测微生物吸附在三维超晶体上，利用三维超晶体等离激元场对微生物的本征拉曼信号的放大，通过增强拉曼技术检测获得待测微生物的本征拉曼信号，从而识别待测微生物的菌种类。本发明利用了纳米超晶体作为基底，直接吸附微生物，高效放大微生物微弱的本征拉曼信号，能实现对微生物的免标记快速识别，避免了微生物繁殖培养所耗费的长周期的过程。
【专利说明】一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物的检测领域，具体涉及到光学各向异性的贵金属纳米超晶体作为高敏感表面增强拉曼基底，对微生物的微弱本征拉曼信号进行高效放大，来快速有效识别微生物的存在及种类。
【背景技术】
[0002]目前，普遍应用的微生物识别技术主要是平板计数法，其检测周期较长，通常需要三天到一周，并且由于其对微生物的种类识别只能依据微生物的形态导致检测不够准确，无法满足微生物快速准确的识别要求。
【发明内容】
[0003]本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法，其是一种通用性的微生物识别技术，借助纳米超晶体内部天线效应产生的高效增强拉曼能力，放大微生物微弱的本征拉曼信号，实现对微生物的免标记快速准确识别。
[0004]本发明为解决技术问题采用如下技术方案:
[0005]本发明通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法，其特点是:
[0006]在含光学各向异性的贵金属纳米材料的溶液中加入定向调节剂溶液，获得混合溶液；将所述混合溶液滴在硅片基底上，在避光环境中，控制环境温度和湿度，使混合溶液中的溶剂在15?30小时之间自然蒸发，即在娃片基底上形成方向可控、排布规则的三维超晶体；
[0007]将待测微生物吸附在所述三维超晶体上，利用三维超晶体等离激元场对微生物的本征拉曼信号的放大，通过增强拉曼技术检测获得待测微生物的本征拉曼信号，从而识别待测微生物的菌种类。
[0008]本发明通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法，其特点也在于:
[0009]所述光学各向异性的贵金属纳米材料为金纳米棒、金三角纳米片、金银核壳纳米棒或金银核壳三角纳米片。
[0010]所述二维超晶体为垂直于娃片基底排布的纳米棒二维超晶体、垂直于娃片基底排布的纳米片二维超晶体、平行于娃片基底排布的纳米棒二维超晶体，或是平行于娃片基底排布的纳米片三维超晶体。
[0011 ] 所述定向调节剂溶液为NaCl的水溶液或巯基-聚乙二醇的水溶液；
[0012]当所述定向调节剂溶液为NaCl的水溶液时，所述三维超晶体垂直于硅片基底排布；
[0013]当所述定向调节剂溶液为巯基-聚乙二醇的水溶液，所述三维超晶体平行于硅片基底排布。
[0014]所述待测微生物为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或霉菌。
[0015]当定向调节剂为巯基-聚乙二醇时，是通过纳米晶面化学取向锚定方法对三维超晶体的方向进行控制，在这种制备技术中运用了作为光学各向异性的贵金属纳米材料其端面(对于纳米棒来说)或三角边(对于三角纳米片来说)的反应活性强于侧面(对于纳米棒来说)或三角面(对于三角纳米片来说)的反应活性，控制巯基-聚乙二醇的用量，借助金巯键强作用，取代贵金属纳米材料表面活性剂，对端面或三角边进行封堵，只留下侧面或三角面的表面活性剂用于纳米棒或纳米三角片的自组装形成三维超晶体。
[0016]当定向调节剂为NaCl时，是通过调整电解质离子活度物理吸附方法对三维超晶体的方向进行控制，在这种制备技术中，运用电解质的介入，改变了溶液中的离子活度，调节了表面活性剂包覆的贵金属纳米材料的表面活性剂的静电排斥力与内耗吸引力之间的平衡，导致了贵金属纳米材料的自组装形成三维等离激元超晶体。
[0017]与已有技术相比，本发明有益效果体现在:
[0018]1、本发明利用了纳米超晶体作为基底，直接吸附微生物，高效放大微生物微弱的本征拉曼信号，能实现对微生物的免标记快速识别，避免了微生物繁殖培养所耗费的长周期的过程；
[0019]2、本发明方法具有通用性，不介入任何光学探针，避免微生物化学或生物功能化繁琐的过程，识别方法简单，具有广泛的普适性；
[0020]3、本发明通过定向调节剂的选择，可以获得方向可控的三维超晶体。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为光学各向异性金银核壳纳米棒的垂直硅片基底排布的纳米棒三维超晶体的扫描电镜图；
[0022]图2为大肠杆菌吸附在垂直硅片基底排布的金银核壳纳米棒三维超晶体的扫描电镜图；
[0023]图3为运用垂直娃片基底排布的金银核壳纳米棒二维超晶体a和非超晶体b对大肠杆菌的增强拉曼识别；
[0024]图4为光学各向异性金三角纳米片的平行硅片基底排布的纳米片三维超晶体的扫描电镜图；
[0025]图5为运用金三角纳米片的平行硅片基底排布的纳米片三维超晶体对酵母菌的增强拉曼识别。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:通过金银核壳纳米棒三维超晶体增强大肠杆菌的本征拉曼信号以识别大肠杆菌
[0027]本实施例为通过金银核壳纳米棒三维超晶体增强大肠杆菌的本征拉曼信号以识别大肠杆菌，按如下过程进行:
[0028]第I步:将20mL、0.5mM的氯金酸(HAuCl4)溶液与20mL、0.2M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)在冰浴条件下混合得混合液；将1.2mL、0.02M的硼氢化钠(NaBH4)加入到混合液中，在100rpm转速条件下，剧烈搅拌2分钟，并在25°C下静置I小时，得到含有纳米金种子的溶液；
[0029]将200mL、0.2M的CTAB与10mL、4mM的硝酸银(AgNO3)溶液在室温条件下混合形成黄色的成长液；将200mLUmM的HAuCl4溶液加入成长液中，伴随着2.8mL、0.08M的抗坏血酸的加入，黄色的成长液变成无色混合液，表明三价态的金被还原成一价态的金。将480 μ L的含有纳米金种子的溶液加入到上述无色混合液中，5-10分钟后，溶液的颜色从无色变成朱砂红色，表明金纳米棒已经形成，获得金纳米棒溶液。
[0030]新鲜制备的金纳米棒溶液，静置24小时，在1000rpm转速条件下离心20分钟，去除上清液，重新溶解在40mL超纯水中备用。在15-25°C条件下，将ImL的金纳米棒溶液稀释在5mL、0.1M的CTAB溶液中，再依次加入0.75mL、4mM AgNO3溶液和0.1mL,0.1M抗坏血酸，轻微振荡后把0.2mL、0.1M的NaOH溶液加入其中，以形成碱性环境有助于银离子在纳米金棒的表面形成银层；最后溶液的颜色从朱砂红色变成了绿色，表明金银核壳纳米棒的形成。
[0031]第2步:将上述步骤制备的金银核壳纳米棒溶液，1000rpm转速下，离心10分钟，去除上清液，重新溶解在50 μ L 0.0lM NaCl溶液中，取10 μ L滴在浓硫酸/双氧水(3:1)80°C条件下I小时处理后的干净硅片上。然后放入在室温25°C和80%湿度避光的环境下，待其24小时自然慢慢晾干。在缓慢蒸发的过程后，会在硅片基底上形成一个咖啡环，分布在咖啡环上的金银核壳纳米棒形成有规则排列的三维超晶体。
[0032]图1给出了大尺度范围内的光学各向异性金银核壳纳米棒的垂直硅片基底排布的三维纳米棒超晶体的扫描电镜图。从图1可以清晰观测到金银核壳纳米棒垂直在硅片基底上，形成了紧密规则排布的三维超晶体。
[0033]第3步:大肠杆菌在溶菌肉汤(LB)培养基中37°C下培养12小时，分散在超纯水中，5000rpm转速条件下离心处理后，去除上清液，重新分散在超纯水中，形成lmL、0.0050D大肠杆菌液，然后取10 μ L的大肠杆菌液，滴在已制备的金银核壳纳米棒三维超晶体上，I小时自然晾干后，进行拉曼测试，其检测条件为检测功率0.85mff,激发波长785nm，采集时间 1S。
[0034]图2给出了大肠杆菌附着结合在垂直硅片基底排布的金银核壳纳米棒三维超晶体的扫描电镜图。从图中可以清晰观测到长度大小约为Iym的大肠杆菌吸附在超晶体表面上。
[0035]作为对比，按如下方式制备非超晶体的三维金银核壳纳米棒，并将大肠杆菌吸附在其上:
[0036]将上述步骤制备的金银核壳纳米棒溶液,1000rpm转速下,离心10分钟,去除上清液，重新溶解在50 μ L超纯水溶液中，取10 μ L滴在硅片上。然后放入鼓风吹干机中，温度设置在40°C的环境下，待其20分钟快速晾干。在快速蒸发的过程后，不会在硅片基底上形成一个咖啡环，因而形成了无序分布的非超晶体基底。然后将上述制备的大肠杆菌液，取1yL的大肠杆菌液，滴在已制备的非超晶体基底上，I小时自然晾干后，进行拉曼测试，其检测条件为检测功率0.85mW，激发波长785nm，采集时间10S。
[0037]图3给出了非超晶体(曲线b)和垂直硅片基底排布的金银核壳纳米棒三维超晶体(曲线a)对大肠杆菌的拉曼识别谱。从图中a谱线可以观测到大肠杆菌的本征拉曼振动带，其位置在752cm—1，1001cm-1,1449cm—1的微弱本征拉曼信号，受三维超晶体等离激元场的拉曼激发，相对于无序分布的金银核壳纳米棒基底获取的拉曼谱图，被明显地增强。
[0038]鉴于不同形貌的光学各向异性的贵金属纳米颗粒不同的拉曼增强特性，因此该项微生物识别技术中的贵金属纳米材料可选自金纳米棒、金三角纳米片、金银核壳纳米棒、金银核壳三角纳米片的光学各向异性纳米颗粒。由于用于微生物增强拉曼识别的三维超晶体的纳米天线效应的差异导致的拉曼增强能力的不同，因此该项微生物识别技术的超晶体可选自垂直娃片基底排布的纳米棒超晶体、纳米片超晶体或平行娃片基底排布的纳米棒、纳米片超晶体。因为微生物的种类差异决定了其本征光学信号的不同，所以该项微生物识别技术的微生物可选自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、霉菌。
[0039]实施例2:通过金三角纳米片三维超晶体增强拉曼信号以识别酵母菌
[0040]本实施例中通过金三角纳米片三维超晶体增强拉曼信号以识别酵母菌的具体步骤:
[0041]第I步:lmL、0.0lM氯金酸溶液和lmL、0.0lM柠檬酸三钠溶液加水稀释至40mL，在冰浴条件下混合得混合液，再加入lmL、0.1M硼氢化钠，在100rpm转速条件下，剧烈搅拌2分钟，在25°C下静置2-4小时，得到含有纳米金种子的溶液。
[0042]然后，225mL、0.05M CTAB, ImL,0.1M KI, 1.25mL、0.1M 抗坏血酸，1.25mL、0.1MNaOH, 6.25mL、0.0lM氯金酸溶液相混合形成混合成长液。随后，从盛有225mL混合成长液的锥形瓶C中，取22.5mL至锥心瓶B中，在锥心瓶B中取2.25mL至锥形瓶A中。最终，向锥心瓶A中加入225 μ L上述制备的含有纳米金种子的溶液，迅速将A瓶中溶液倒入B瓶，再将B瓶溶液立即转移至C瓶。5-10分钟后，溶液的颜色从无色变为紫红色，表明金三角纳米片已经形成。新鲜制备的金三角纳米片成长液，静置24小时，收集锥心瓶底部的绿色溶液，再在6000rpm转速条件下离心处理20分钟，重新溶解在20mL超纯水中备用。
[0043]第2步:取ImL金三角纳米片溶液，加入50uL、lmg/mL巯基-聚乙二醇溶液(分子量6000MW)，在25°C条件下，反应2小时，6000rpm转速10分钟，离心去除上清液，重新溶解在200 μ L超纯水中，取1uL滴在浓硫酸/双氧水(3:1) 80°C条件下I小时处理的干净硅片上。然后放入在室温25°C和80%湿度避光的环境下，待其24小时自然慢慢晾干。在缓慢蒸发的过程后，会形成在硅片基底上形成一个咖啡环，分布在咖啡环上的金三角纳米片形成有规则排列的超晶体。
[0044]图4给出了大尺度范围内的光学各向异性金纳米片的平行硅片基底排布的纳米片三维超晶体的扫描电镜图。从图4可以清晰观测到金三角纳米片平行在硅片基底上，形成了紧密规则排布的三维超晶体。
[0045]第3步:酵母菌在酵母浸出物胰蛋白右旋葡萄糖(YPD)培养基中30°C下培养20小时，分散在超纯水中，4000rpm转速条件下离心处理后，去除上清液，重新分散在超纯水中，形成lmL、0.0050D酵母菌液，然后取10 μ L的酵母菌液，滴在已制备的金三角纳米片三维超晶体上，I小时自然晾干后，进行拉曼测试，其检测条件为检测功率0.85mW，激发波长785nm，采集时间1S。
[0046]图5给出了平行硅片基底排布的金三角纳米片三维超晶体对酵母菌的拉曼识别谱。从图中可以观测到酵母菌的本征拉曼振动带，其位置在1240(^-^ 1375(^-1的微弱本征拉曼信号，受超晶体等离激元场的拉曼激发，明显地被增强，并且本征拉曼信号明显的不同于图3中大肠杆菌的本征拉曼信号。
[0047]与通用的平板计数法测微生物的相比，本发明的优点在于，使用了具有明显拉曼增强效应的光学各向异性的贵金属纳米材料，构筑了方向可控、排布高度规则的三维超晶体，提供高重现性、有规律的光学热点来高效放大微生物的本征微弱拉曼信号。相对于通用的平板计数法，目前这一识别技术，利用了不同微生物的本征固有信号，能够准确识别微生物的种类。
【权利要求】
1.一种通过纳米超晶技术增强拉曼信号以识别微生物的方法，其特征是: 在含光学各向异性的贵金属纳米材料的溶液中加入定向调节剂溶液，获得混合溶液；将所述混合溶液滴在硅片基底上，在避光环境中，控制环境温度和湿度，使混合溶液中的溶剂在15?30小时之间自然蒸发，即在娃片基底上形成方向可控、排布规则的三维超晶体； 将待测微生物吸附在所述三维超晶体上，利用三维超晶体等离激元场对微生物的本征拉曼信号的放大，通过增强拉曼技术检测获得待测微生物的本征拉曼信号，从而识别待测微生物的菌种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述光学各向异性的贵金属纳米材料为金纳米棒、金三角纳米片、金银核壳纳米棒或金银核壳三角纳米片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述三维超晶体为垂直于硅片基底排布的纳米棒二维超晶体、垂直于娃片基底排布的纳米片二维超晶体、平行于娃片基底排布的纳米棒二维超晶体，或是平行于娃片基底排布的纳米片二维超晶体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述定向调节剂溶液为NaCl的水溶液或巯基-聚乙二醇的水溶液； 当所述定向调节剂溶液为NaCl的水溶液时，所述三维超晶体垂直于硅片基底排布； 当所述定向调节剂溶液为巯基-聚乙二醇的水溶液，所述三维超晶体平行于硅片基底排布。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述待测微生物为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或霉菌。
【文档编号】G01N21/65GK104458694SQ201410706162
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】王进, 贾皓玮, 邱丽 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院