一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原(Flagellin)免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用，其特征在于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；固相载体为16-氨基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基)吡啶。本发明的蛋白质芯片可以准确的探测出莱姆病患者血清中的抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体，操作简单、检测结果稳定。
【专利说明】一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及 其制备方法和应用 一、
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白质芯片，具体涉及伯氏疏螺旋体感染的莱姆病病人血清中相 关的抗鞭毛抗原抗体的检测蛋白质芯片及其制备与使用。 二、 技术背景
[0002] 莱姆病（Lyme Diseas，LD)是一种由蜱虫传播的疏螺旋体感染人体，以多个器 官损伤为特征的感染性疾病。在世界范围内，莱姆病在美国以及欧洲，尤其是斯堪的纳维 亚半岛以及中欧地区为其高发地区，在中国，莱姆病的发病主要分布在大兴安岭地区以及 大别山地区。莱姆病的主要病原体为疏螺旋体，分为三个亚型：伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)，阿弗西尼疏螺旋体（Borrelia afzelii)和伽氏疏螺旋体（Borrelia garinii)。儿童发病率高于成人。环形游走性红斑（Erythema migrans，EM)是伯氏疏螺旋 体感染的临床特征性表现，未经治疗的莱姆病病人在病情发展的数月到数年之间会发生神 经性病变，外周神经以及中枢神经都将受累。但是由于莱姆病感染初期的临床表现的非特 异性，即其环形游走性红斑的表现与诸多皮肤性疾病有类似及重叠的表现，以及临床医生 对莱姆病的危害认识不足等原因，导致莱姆病易在临床上误诊或漏诊。
[0003] 目前，在实验室诊断方面，许多技术可应用于确诊伯氏疏螺旋体的感染，其中包括 细胞培养技术、免疫组织化学技术、聚合酶链反应以及用全细胞裂解液、重组蛋白和多肽进 行的酶联免疫检测或者蛋白质印迹的血清抗体检测等技术。尽管如此，常规血清免疫方法 在莱姆病诊断上的价值仍然存在着诸多问题。美国国家疾控中心推荐莱姆病检测的首选方 法是用ELISA或者直接免疫荧光法对血清中疏螺旋体产生的抗体的检测，但是结果仍需要 免疫印迹方法的确证。
[0004] 目前公认的是，伯氏疏螺旋体菌体在感染后，人体免疫反应对其产生抗体主要针 对于其鞭毛抗原（Flagellin)和外表面蛋白C抗原（Outer space protein C，OspC)。其 中，鞭毛抗原是伯氏疏螺旋体主要的免疫性抗原。在感染伯氏疏螺旋体的早期和晚期都能 够发现抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原抗体在血清中的表达。与其他菌体抗原相比，抗鞭毛抗原 抗体检测目前是用于诊断伯氏疏螺旋体感染莱姆病较为理想的血清学指标。其中，血清中 的IgG抗体分子量小，在疾病的发生中产生晚，维持时间长，消失慢，浓度高，可作为疾病既 往感染的指标；而血清中的IgM抗体分子量大，在感染的初期就可检测到，维持时间短，消 失快，是作为疾病急性期感染的指标。
[0005] 生物芯片是近几年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一 体的高新技术，利用微电子芯片技术的集成化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的 特殊标志物的生物样品有序地固化在玻璃片、娃片、金属片和商分子材料等基质表面，并 利用微量反应提及，一次杂交就可以对许多血清中的生物标志物、突变或多态性进行特异、 快速、精确检测。尤其是随着生物芯片技术以其高通量、高敏感性和高特异性的优势，其在 生物学领域应用以及实验室技术方面应用已广泛被接受，在针对疾病大规模的人群筛查方 面更是优势明显，已经在基因筛查、基因诊断、蛋白质相互作用以及细胞功能研究等领域获 得成功应用。蛋白质芯片不仅可以研究蛋白间相互作用，并且由于其可以对痕迹材料进行 检测，大大增加了检测物的敏感性，所以在疾病标志物的实验室诊断方面，其应用越来越 广。
[0006] 为了弥补临床上诊断伯氏疏螺旋体感染引起的莱姆病中产生的检测时限长、易误 诊漏诊等情况的发生，因而，研发一种新型蛋白质芯片，对导致莱姆病的伯氏疏螺旋体鞭毛 抗原产生的血清IgG抗体和IgM抗体进行检测，将大大提高临床诊断率以及对疾病高发区 的人群进行有效筛查，这无疑具有潜在的临床价值和社会效益。 三、
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中抗 鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片及其利记博彩app和使用方法。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种诊断伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清中 抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体的蛋白质芯片试剂盒。
[0009] 本发明解决技术问题采用如下技术方案：
[0010] 本发明公开了一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特点在 于：在固相载体表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨 基-1-十六烷硫醇修饰的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来 酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基）吡啶。
[0011] 本发明同时公来了用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备方 法，其特点在于按如下步骤进行：
[0012] 步骤1 :对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
[0013] 以浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以IOOmg 4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基）吡啶溶于 IOmL N，N-二甲基甲酰胺构成的混合液为修饰液2 ;对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰 液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再 浸于所述修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N，N-二甲基甲酰 胺和PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与 Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0? OlM ;
[0014] 步骤2 :固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针
[0015] 将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12. 5 i! g/ mL的蛋白溶液；
[0016] 将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4°C?37°C孵育0.5?12h，取出后用PBST溶 液清洗、氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片；
[0017] 其中，步骤1对金箔芯片进行清洗的方法优选为：将NH3、H20 2 &H20按体积比1 :1 : 5混合构成TLl清洗液，将金箔芯片浸入盛有TLl清洗液的不锈钢清洗盒内，82°C水浴6分 钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。
[0018] 本发明上述用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的使用方法，其特 点在于：
[0019] 将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 i! g/mL的 IgG荧光二抗溶液；
[0020] 将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 ii g/mL 的IgM荧光二抗溶液；
[0021] 将待诊断患者血清点样于所述蛋白质芯片的任意两个伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗 原探针上，常温条件下孵育抗体1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
[0022] 将所述IgG荧光二抗溶液和所述IgM荧光二抗溶液分别点样于一个孵育有抗体的 探针之上，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
[0023] 若探针处呈现荧光色，则待诊断患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗 原IgM抗体，若探针处无荧光色，则待诊断患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗 原IgM抗体；
[0024] 在使用时，还应同时将健康人血清同时点样于同一蛋白质芯片的其他伯氏疏螺旋 体重组鞭毛抗原探针上，作为阴性对照。
[0025] 本发明还公开了基于上述蛋白质芯片的用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的 试剂盒，其特点在于：包含上述的蛋白质芯片、PBST-BSA溶液、将Cy3标记驴抗人IgG抗体 溶于PBST-BSA溶液中，构成的浓度不低于4. 9 ii g/mL的IgG荧光二抗溶液和将Cy3标记山 羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 ii g/mL的IgM荧光二抗溶液；
[0026] 所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中 Tween20 的浓度为 0? OlM ;
[0027] 所述的PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成， 在所述PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0. 01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0. 1 %。 [0028] 与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0029] 本发明一方面利用金箔作为基质。其与传统玻璃片、硅片以及高分子材料基质的 优势在于，金箔本身为惰性金属，但其与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比来说更 加牢固。并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附，大 大降低了非特异性，避免了检测结果假阳性的产生。
[0030] 本发明第二方面，在十六烷基修饰的基础上，对传统方法进行改良，进行活化的马 来酸的修饰，利用具有活性的羧基末端与蛋白质结合，与传统马来酸修饰相比，这种新型活 化马来酸修饰金箔芯片能结合更多蛋白质，提高了检测敏感性。
[0031] 在用于实际检测临床莱姆病患者血中抗鞭毛抗原IgG抗体和抗鞭毛抗原IgM抗体 方面，每张芯片可同时检测188例血清，灵敏度、特异性均较高，减少了假阳性和假阴性的 发生几率。其次，芯片的稳定性和可重复性较好，增加了实验室诊断的准确性。尤其在与传 统方法相比时，运用其在对莱姆病高危地区的人群进行大规模筛查，可提供更为简便和可 靠的检测方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为金箔芯片点样布阵图；
[0033] 图2为原子力显微镜扫描清洗后金箔芯片平面表征；
[0034] 图3为原子力显微镜扫描化学修饰后金箔芯片平面表征；
[0035] 图4为伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原浓度梯度质控结果，其中兔抗伯氏疏螺旋体鞭 毛抗原IgG抗体浓度为50 ii g/mL，Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度为2500 ii g/mL ;
[0036] 图5为兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度质控结果，其中伯氏疏螺旋 体鞭毛抗原浓度为50 ii g/mL，Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度为2500 ii g/mL ;
[0037] 图6为Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度梯度质控结果，其中伯氏疏螺旋体鞭毛抗 原浓度为50 ii g/mL，兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体浓度为50 ii g/mL ;
[0038] 图7为伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原孵育时间-温度质控结果；
[0039] 图8为莱姆病患者抗鞭毛抗原IgG抗体、阴性血清和阴性对照实际检测图；
[0040] 图9为莱姆病患者抗鞭毛抗原IgM抗体、阴性血清和阴性对照实际检测图。 具体实施例
[0041] 本发明各实施例原材料的来源与准备如下：
[0042] 1、金箔芯片来源：本发明所用金箔芯片来自Interactiva公司（德国，乌尔姆）， 其基底为玻璃片，其上覆盖一层IOnm厚度的纯金（纯度99.9% )，金箔之上为一区域化的 50 ii m的TEFLON膜的阵列（96孔*2,8行*12列），阵列孔径为I. 25mm，如图1所示。
[0043] 2、金箔芯片表面化学修饰试剂：
[0044] 修饰液1 :浓度为0.8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液。（16-氨 基-1-十六烷硫醇购自日本D0JIND0公司）
[0045] 修饰液2 :100mg 4-(N_马来酰亚胺基甲基）环己烧-1-羧酸琥拍酰亚胺酯与50mg 4_(二甲氨基）吡啶溶于IOmL N，N-二甲基甲酰胺。（以上试剂均购自美国SIGMA-ALDRICH 公司）
[0046] 3、抗原、抗体、荧光素类
[0047] 伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原购自MYBI0S0URCE公司；兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原 IgG抗体购自ROCKLAND公司；Cy3标记山羊抗兔IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记驴抗人 IgG抗体购自Sangon公司；Cy3标记山羊抗人IgM抗体购自KPL公司；磷酸缓冲液（PBS)、 Tween 20及胎牛血清（BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
[0048] 4、PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与0? OlM Tween 20混合构成。
[0049] PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、0. OlM Tween 20及0? 1 %胎牛血清BSA混合 构成。
[0050] 实施例1、金箔芯片表面化学修饰
[0051] 步骤1、金箔芯片的清洗：由NH3 :H202 :H20 = 1 :1 :5的体积比例混合获得TLl清洗 液。将金箔芯片置于盛有TLl清洗液的不锈钢清洗盒内，82°C水浴6分钟，清洗2次，取出 之后用超纯水冲洗2分钟，2次，再用无水乙醇清洗2分钟，2次，之后用氮气吹干，置于干净 S闭芯片盒中，待用。
[0052] 步骤2、对清洗后金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
[0053] 将清洗后的金箔芯片浸于修饰液1之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出 后用无水乙醇溶液清洗3次，每次2分钟，然后氮气吹干；再将此金箔芯片浸于修饰液2之 中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用N，N-二甲基甲酰胺清洗3次，每次3分钟， 再用PBST溶液（PH 7. 4)清洗3次，每次2分钟，用氮气吹干，得固相载体待用。
[0054] 图2和图3为利用原子力显微镜（AFM)观察金箔芯片修饰前后表征情况。可以看 出，修饰后的平面表面较修饰前的平面表面更为粗糙，表示经修饰后，化学基团共价连接到 金箔芯片表面上。这种修饰是首次在金箔平面上开展，与传统的马来酸修饰相比，提高了马 来酸的活性，使其更容易于与蛋白质连接，增加了试剂检测的敏感性。
[0055] 实施例2质控实验
[0056] 制备孵育液1 :将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液，配置成蛋白浓 度梯度为 200 u g/mL，100 u g/mL，50 u g/mL，25 u g/mL，12. 5 u g/mL，6. 25 u g/mL，3. 12 u g/ mL，I. 65 ii g/mL，0? 78 ii g/mL，0? 39 ii g/mL，0? 19 ii g/mL 的鞭毛抗原溶液。
[0057] 制备孵育液2 :将兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置 成抗体浓度梯度为 200 y g/mL，100 y g/mL，50 y g/mL，25 y g/mL，12. 5 y g/mL，6. 25 y g/mL， 3. 12 y g/mL，I. 65 y g/mL，0? 78 y g/mL，0? 39 y g/mL，0? 19 y g/mL 的溶液。
[0058] 制备孵育液3 :将Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗 浓度梯度为 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I y g/mL，39. I y g/mL，19. 5 y g/mL，9. 8 y g/mL，4. 9 y g/mL 的溶液。
[0059] 制备孵育液4 :将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗 浓度梯度为 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I ii g/mL，39. I ii g/mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL 的 IgG 突光二抗溶液。
[0060] 制备孵育液5 :将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液，配置成荧光二抗 浓度梯度为 5000 u g/mL，2500 u g/mL，1250 u g/mL，625 u g/mL，312. 5 u g/mL，156. 2 u g/mL， 78. I ii g/mL，39. I ii g/mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL 的 IgM 突光二抗溶液。
[0061] I、鞭毛抗原浓度梯度孵育质控实验。
[0062] 将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于孵育液1中，室温条 件（25°C )下孵育2小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，得用于莱姆病免 疫血清学诊断的蛋白质芯片。
[0063] 将浓度为50 g/mL兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原抗体溶液点样于上述孵育有伯氏 疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的蛋白质芯片之上，室温（25°C )条件下孵育1小时。取出用 PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干，待用。
[0064] 将浓度为2500 ii g/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体溶液点样与上述孵育有抗体 的芯片之上，室温（25°C )条件下孵育1小时。取出用PBST清洗3次，每次2分钟。氮气吹 干。
[0065] 使用芯片扫描仪（北京博奥公司，型号：晶芯Luxscan 10K-A)对以上蛋白质芯片 进行扫描，结果显示于图4。从图中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和Cy3 标记山羊抗兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原孵育浓度大 于12. 5 y g/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差 异。故显示孵育伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原的最优浓度应在12. g/mL以上。
[0066] 2、抗鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实验。
[0067] 将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液之中，室温（25°C )条件下孵育2小时，取出用PBST清洗3 次，每次2分钟，氮气吹干；再将孵育液2的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶液点样 于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的芯片之上，室温（25°C )条件下孵育1小时，取 出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再加2500 ii g/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗 体，室温（25°C )条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
[0068] 使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为抗鞭毛抗原IgG抗体浓度梯度孵育质控实 验，结果显示与图5。从图中可以看出：在伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原和Cy3标记山羊抗 兔IgG抗体孵育条件不变的情况下，当兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体孵育浓度大于 6. 25 y g/mL时，所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度存在着可辨识的 差异。说明此修饰芯片可以检测到抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体的数量级在yg/mL 级。
[0069] 3、Cy3标记山羊抗兔IgG抗体浓度梯度孵育质控实验。
[0070] 将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液之中，室温（25°C )条件下孵育2小时，取出用PBST清洗 3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为50 ii g/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗 体溶液点样于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针的芯片之上，室温（25°C)条件下孵 育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。再将稀释浓度为5000ii g/mL， 2500 u g/mL,1250 u g/mL,625 u g/mL,312. 5 u g/mL,156. 2 u g/mL,78. Iu g/mL,39. I U g/ mL，19. 5 ii g/mL，9. 8 ii g/mL，4. 9 ii g/mL的孵育液3点样于孵育有抗体的芯片之上，取出用 PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
[0071] 使用芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为荧光素抗IgG抗体的质控实验，结果显示 于图6。从图中可以看出：在兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体和伯氏疏螺旋体重组鞭 毛抗原孵育条件不变的情况下，当Cy3标记山羊抗兔IgG抗体孵育浓度大于4. 9 ii g/mL时， 所产生的荧光信号强度与阴性对照组产生的荧光信号强度有明显的差异。故显示孵育Cy3 标记山羊抗兔IgG抗体的最优浓度应在4. 9 ii g/mL以上。
[0072] 4、浓度-温度质控实验。
[0073] 将实施例1完成表面化学修饰的金箔芯片作为固相载体浸于浓度为50 ii g/mL的 伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶液，分别在37°C，室温（25°C )和4°C条件下孵育12小时、6 小时、3小时、1小时和0. 5小时，取出用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干；再将浓度为 50 y g/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原IgG抗体溶液点样于孵育有伯氏疏螺旋体重组鞭 毛抗原探针的芯片之上，室温（25°C )条件下孵育1小时，取出用PBST清洗3次，每次2分 钟，氮气吹干。再将稀释浓度为2500 ii g/mL的Cy3标记山羊抗兔抗IgG抗体溶于PBST-BSA 溶液点样于孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST-BSA清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。
[0074] 芯片扫描仪对芯片进行扫描，即为Cy3标记山羊抗兔IgG抗体的质控实验，结果显 示于图7。从图中可以看出：
[0075] 1、荧光强度随着孵育时间的延长而延长，当孵育时间大于1小时，荧光强度随着 孵育时间的延长变化不是很明显。故在实际检测中，为了缩短孵育时间，建议探针制作的孵 育时间大于1小时即可满足需求。
[0076] 2、在孵育温度的选择上，荧光强度在室温（24°C )条件下强于37°C和4°C条件下的 荧光强度。故在实际检测中，建议在室温（24°C )条件下进行孵育实验。
[0077] 实施例3莱姆病患者血清样本检测
[0078] 将88例临床确诊为伯氏疏螺旋体感染的莱姆病患者血清分别点样于含有孵育浓 度为50 y g/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原的探针的芯片的88个孔上，另外4个孔点样 液为临床确诊未感染伯氏疏螺旋体的健康人血清，其余4个孔点样液为PBST-BSA溶液，常 温条件下孵育1小时，取出后用PBST清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。在另一相同芯片上 做相同操作。再分别将1:2500稀释的Cy3标记驴抗人IgG抗体和1:2500稀释的Cy3标记 山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液后点样于两个孵育有抗体的芯片之上，取出用PBST 清洗3次，每次2分钟，氮气吹干。使用芯片扫描仪对芯片进行扫描。结果分别显示为图8 和图9。从图中可以看出：在实际检测临床已诊断为莱姆病患者的血清中，阳性患者的血清 的荧光强度与健康人群的血清以及PBST-BSA点样的荧光强度之间存在着明显的差异性。 说明该芯片在实际诊断伯氏疏螺旋体感染的抗鞭毛抗体的血清学检测中有着良好的应用。
[0079] 实施例4可重复性实验
[0080] 表1为组内可重复性实验，每32个孔作为一组，共三组，按照步骤孵育浓度为 50 y g/mL的伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原、浓度为50 ii g/mL的兔抗伯氏疏螺旋体鞭毛抗原 IgG抗体和浓度为2500 ii g/mL的Cy3标记山羊抗兔IgG抗体。
[0081] 表 1
[0082]
【权利要求】
1. 一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片，其特征在于：在固相载体 表面点阵固定有伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针；所述固相载体为16-氨基-1-十六烷硫 醇修饰的金箔芯片，在所述16-氨基-1-十六烷硫醇上结合有4-(N-马来酰亚胺基甲基） 环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(二甲氨基）吡啶。
2. -种权利要求1所述的用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的制备 方法，其特征在于按如下步骤进行： 步骤1 :对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体 以浓度为〇. 8mM的16-氨基-1-十六烷硫醇的乙醇溶液为修饰液1，以lOOmg 4-(N-马 来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与50mg 4-(二甲氨基）吡啶溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺构成的混合液为修饰液2 ;对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1 中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再浸于 所述修饰液2之中，黑暗条件下室温摇荡孵育12小时，取出后依次用N，N-二甲基甲酰胺和 PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中Tween 20的浓度为0. 01M ; 步骤2 :固定伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探针 将伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于12. 5 y g/mL的 蛋白溶液； 将固相载体浸于所述蛋白溶液中，在4°C?37°C孵育0. 5?12h，取出后用PBST溶液清 洗、氮气吹干，即得用于莱姆病免疫血清学诊断的蛋白质芯片； 所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0. 01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0. 1%。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法 为：将NH3、H202及H20按体积比1 :1 :5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗 液的不锈钢清洗盒内，82°C水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清 洗，最后用氮气吹干。
4. 权利要求1所述用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片的使用方法，其 特征在于： 将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 y g/mL的IgG 荧光二抗溶液； 将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 y g/mL的 IgM荧光二抗溶液； 将待诊断患者血清点样于所述蛋白质芯片的任意两个伯氏疏螺旋体重组鞭毛抗原探 针上，常温条件下孵育抗体1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干； 将所述IgG荧光二抗溶液和所述IgM荧光二抗溶液分别点样于一个孵育有抗体的探针 之上，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干； 若探针处呈现荧光色，则待诊断患者血清中含有抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原 IgM抗体，若探针处无荧光色，则待诊断患者血清中不含抗鞭毛抗原IgG抗体或抗鞭毛抗原 IgM抗体； 所述PBST溶液是由磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合构成，在所述PBST溶液中TWeen20 的浓度为0. 01M ; 所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0. 01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0. 1%。
5. -种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的试剂盒，其特征在于：包含权利要求 1所述的蛋白质芯片、PBST-BSA溶液、将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中， 构成的浓度不低于4. 9 y g/mL的IgG荧光二抗溶液和将Cy3标记山羊抗人IgM抗体溶于 PBST-BSA溶液中，构成浓度不低于4. 9 y g/mL的IgM荧光二抗溶液； 所述PBST-BSA溶液是由磷酸缓冲液PBS、Tween 20及胎牛血清BSA混合构成，在所述 PBST-BSA溶液中Tween 20的浓度为0. 01M，胎牛血清BSA的质量百分数为0. 1%。
【文档编号】G01N33/68GK104374921SQ201410676478
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】杜卫东, 叶雷 申请人:安徽医科大学