一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法
【专利摘要】一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，将水稻离体叶片剪成长3cm的小段，置于不同浓度的CdCl2溶液中浸泡3-5天以提高镉离子进入叶片的渗透能力，然后依据叶片失绿情况，准确地判断水稻的耐镉能力，叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐镉能力差；叶片失绿程度小的，叶片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐镉能力强。本发明的优点是：该方法以水稻叶片的失绿进程为依据，只需要少量的水稻叶片，利用较短的时间，迅速准确地鉴定出水稻的耐镉能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点；根据鉴定提高优良耐镉基因型水稻的筛选效率，具有非常广阔的应用前景。
【专利说明】一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术的植物检测，特别涉及一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，由于长期污灌、大量施用富镉磷肥、农药等原因，农田镉(Cd)污染日益严重。据报道，我国农田重金属Cd污染面积已达2X 104hm2，每年生产Cd含量超标的农产品达14.6X108kg，且有日益增加的趋势。
[0003]水稻是中国种植面积最大的粮食作物，也是全球的主要粮食作物之一，过量的Cd在水稻的根、茎、叶以及籽粒中积累，不仅影响水稻产量、品质及整个农田生态系统，并可通过食物链更严重地危及动物和人类的健康。最早发现的“痛痛病”就是由于长期食用Cd污染的大米后引起的，其主要症状为腹胀，消化不良，背、腿疼痛，严重时会引起骨质疏松和多发性病理性骨折。因此，耐镉基因型水稻的筛选变得尤为重要。
[0004]水稻受Cd毒害后，症状最先表现在植株根部，根系逐渐变粗，表面呈红棕色，叶片失绿、植株矮化，老叶叶尖干枯死亡，并随Cd处理浓度的提高，毒害症状加重。所以，对水稻的耐镉能力主要是通过比较其存活率、相对生长量等进行直接的筛选鉴定。但是水稻生长期长，评价生长性状、生长期等需要的时间较长，费时费力、误差大、效率低，而且受环境因素的影响较大，准确性差。
[0005]在Cd溶液中，水稻根系吸收的镉离子运送到地上部分，在叶片中进行积累，积累到一定程度后破坏了叶片的膜系统和叶绿体结构，使叶绿素含量下降，最后导致叶片细胞死亡，从而出现叶片失绿，逐渐变黄的现象。如果把水稻叶片直接放在镉溶液中，镉离子可以通过叶片切口直接进入叶片细胞，从理论上讲也会对叶片细胞造成伤害，破坏叶绿体结构，出现叶片失绿、叶绿素含量降低。在相同的镉胁迫环境中，耐镉基因型的叶片失绿情况和不耐镉的基因型有明显的区别。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，该鉴定方法所需材料极少且测定周期短，工作效率极高，具有显著的经济技术效果。
[0007]本发明的技术方案:
一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，将水稻离体叶片剪成长3cm的小段，置于不同浓度的CdCl2溶液中浸泡以提高镉离子进入叶片的渗透能力，浸泡时间为3-5天，然后依据叶片失绿情况，准确地判断水稻的耐镉能力，叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐镉能力差；叶片失绿程度小的，叶片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐镉能力强。
[0008]所述CdCl2溶液中，镉离子浓度为0、0.1,0.5、1.0mg/L。
[0009]本发明的工作机理:
耐镉能力不同的水稻基因型，其离体叶片吸收积累镉离子的速率有显著差异，细胞抵抗镉离子生理毒害的能力也明显不同，综合反映为镉溶液中离体叶片的失绿进程有很大的差异。
[0010]本发明的优点是:
该鉴定方法以水稻叶片的失绿进程为依据，只需要少量的水稻叶片，且不受水稻大小的限制，利用较短的时间，迅速准确地鉴定出水稻的耐镉能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点；根据鉴定结果淘汰大量不耐镉的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提闻优良耐铺基因型水稻的筛选效率，加快耐铺水稻育种的步伐；该鉴定方法对其他植物耐镉潜力的快速鉴定具有重要参考价值，具有非常广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为胁迫5天时离体叶片的失绿速度与溶液中镉离子浓度的关系图。
【具体实施方式】
[0012]实施例:
一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，将水稻离体叶片剪成长3cm的小段，先在稀释100万倍的商用三硅氧烷表面活性剂中浸泡lmin，用去离子水冲洗三次后，置于含有0,0.1,0.5、1.0、5、10、20、30、50mg/L Cd2+的CdCl 2溶液中置于不同浓度的CdCl2溶液中浸泡5天以提高镉离子进入叶片的渗透能力，然后依据叶片失绿情况，准确地判断水稻的耐镉能力。叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐镉能力差；叶片失绿程度小的，叶片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐镉能力强。通过该方法可以淘汰大量不耐镉的基因型，实现耐镉基因和高产优质基因的结合，加速耐镉水稻新品种的选育。
[0013]实验研究:
I)根据梯度试验确定水稻叶片失绿速度的镉浓度和表面活性剂:
将水稻叶片用剪刀剪成长3cm的小段，在表面活性剂中进行预处理后，分别置于含有
0、0.1、0.5、1.0、5、10、20、30、50mg/L Cd2+ 的 CdCl2 溶液中，5d 后观测其叶片失绿情况。Cd浓度越高，相同处理时间内的叶片失绿情况越严重。浓度大于lmg/L时，由于浓度过高，叶片细胞死亡，叶片呈棕褐色；浓度小于等于lmg/L时，水稻叶片出现不同程度的失绿，但现象并不明显。因此，我们把0.1、0.5、1.0mg/L作为CdClJA迫的镉浓度。因为扩展剂作为新一代农用喷雾助剂，具有显著增大扩展面积，促进离子吸收的作用。
[0014]2)根据梯度试验确定扩展剂的浓度和浸泡时间:
将水稻叶片用剪刀剪成长3cm的小段，分别在稀释倍数为5000、5000X10、5000X100、5000X200倍的表面活性剂中浸泡lmin、5min、10min，5天后观测其叶片失绿情况。在稀释5000-500000倍的表面活性剂中浸泡5-10min后，T705叶片在Omg/L的镉溶液中处理5天，出现了明显的变黄现象，说明该浓度的表面活性剂对叶片细胞的伤害比较大；在稀释100000倍的表面活性剂中浸泡Imin后，在Omg/L的镉溶液中处理5天，T705叶片仍然保持鲜绿，说明稀释100万倍的表面活性剂为不会对T705水稻叶片造成伤害。
[0015]3)水稻叶片失绿程度临界镉胁迫时间的确定:
将水稻叶片用剪刀剪成长3 cm的小段，经100万倍表面活性剂预处理Imin后，置于含有0.1、0.5、1.0 mg/L Cd2+的CdCl2溶液中，每天观测其叶片失绿情况。胁迫3天后，叶片失绿程度较轻；胁迫时间越长，相同浓度处理内的叶片失绿情况越严重。处理5天，X24水稻叶片出现严重失绿，而且对时间长短的灵敏性较低，可重复性较好；耐镉品种的叶片失绿程度较轻。因此，我们把处理5天作为CdCl2胁迫的临界时间。
[0016]4)叶片失绿与耐镉性的相关性研究:
叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉潜力的试验结果表明，在含有0.1-0.5 mg/L的CdCl2溶液中放置5天，耐镉品种T705的叶片失绿程度与对照没有明显差异，只有放在l.0mg/LCdCl2溶液中的叶片明显变黄。但是，镉敏感品种X24的离体叶片，在0.1-1.0 mg/L的CdCl2溶液中放置5天后，叶片全部变黄，溶液中的镉离子浓度越高，叶片的失绿程度越严重。说明水稻的耐铺能力和尚体叶片的耐铺能力闻度相关，用含0.1、0.5、1.0 mg/L的CdCl2溶液进行处理，通过观察叶片失绿程度，能快速、准确地筛选出耐镉水稻。
[0017]根据上述研究结果实施的试验实例:
实验材料为湖南广泛种植早熟籼稻品种，其中T优705为杂交品种，耐镉能力强；湘早籼24为常规品种，对镉比较敏感。
[0018]以生长两个月的T705和X24水稻为材料，取新鲜翠绿无病害的全展叶，用去离子水冲洗两次，用剪刀剪成长3cm的小段，经100万倍表面活性剂预处理Imin后，置于含有
0.0.1,0.5,1.0 mg/L的CdCl2溶液中，5天后观测其叶片失绿情况。在含有0，0.1，0.5，
1.0 mg/L的CdCl2溶液中放置5天，耐镉品种T705的叶片失绿程度不明显，而X24水稻叶片失绿程度严重，叶片变黄，叶绿素含量显著降低。说明含有0，0.1，0.5，1.0 mg/L Cd2+的CdCl2溶液能够把耐铺能力不冋的水稻品种鉴别出来。
[0019]图1为胁迫5天时离体叶片的失绿速度与溶液中镉离子浓度的关系图，图中表明:在含有0,0.1,0.5，1.0mg/L Cd2+的CdCl 2溶液中放置5天，耐镉品种T705的叶片失绿程度不明显，仅在1.0mg/L的镉溶液中局部失绿；镉敏感品种X24叶片失绿明显，在0.1mg/L的镉溶液中已经开始失绿，且随Cd2+浓度的增大叶片失绿越严重。放置5d后，耐镉品种T705仅在0.5和1.0mg/L的镉溶液中有一定程度的失绿，但X24叶片在0.1-1.0mg/L镉溶液中的失绿更加严重。该实验说明水稻的耐镉能力和叶片的耐镉能力高度相关，用100万倍的表面活性剂和含有0，0.1,0.5，1.0mg/L Cd2+的CdCl 2溶液进行处理，通过观察叶片失绿程度，能快速准确地筛选出耐镉水稻品种。
【权利要求】
1.一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，其特征在于:将水稻离体叶片剪成长3cm的小段，置于不同浓度的CdCl2溶液中浸泡以提高镉离子进入叶片的渗透能力，浸泡时间为3-5天，然后依据叶片失绿情况，准确地判断水稻的耐镉能力，叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐镉能力差；叶片失绿程度小的，叶片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐镉能力强。
2.根据权利要求1所述利用离体叶片失绿进程快速鉴定水稻耐镉能力的方法，其特征在于:所述CdCl2溶液中，镉离子浓度为0,0.1,0.5、1.0mg/L。
【文档编号】G01N21/78GK104458715SQ201410651772
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】高子平, 刘仲齐, 赵静, 张长波 申请人:农业部环境保护科研监测所