一种梯度胶及其制备方法
一种梯度胶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种梯度胶及其制备方法，该梯度胶为SDS-PAGE梯度胶，由轻液和重液组成，轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成：凝胶缓冲液(3.5×)：20-35％；A液：15-70％，双蒸水：0-60％，甘油：0-15％，AP：0.15-0.40％，TEMED：0.015-0.04％，且轻液和重液组成成分及含量不同，通过胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装制成。本发明制成的梯度胶外观较好，分辨率高，对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带且稳定性好，无论是在电场继续作用下，还是存放一定时间后，各区带之间相对位置基本不变。
【专利说明】一种梯度胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种凝胶及其制备方法，尤其涉及一种梯度胶及其制备方法。
[0002]本申请中下列定义是指:
[0003]轻液:梯度胶中浓度较低的胶液；
[0004]重液:梯度胶中浓度较高的胶液；
[0005]凝胶缓冲液(3.5X):是指将配制的凝胶缓冲液标准液稀释3.5倍制得，本发明中其它类似表示意义均相同。
【背景技术】
[0006]随着泳动距离的增加，单一浓度的凝胶在一些情况下难以发挥较好的作用，无法检测、分离全部样品分子。因此，目前梯度胶已广泛取代了单一浓度的凝胶。样品分子在这种梯度胶中泳动时，起初由于样品分子在孔径比它大的凝胶区域中泳动，各种大小不同的样品分子以各自不同的泳动率在电场中运动；但后来，当样品分子达到凝胶孔径小于样品分子大小的区域中时，样品分子就被凝胶孔限所阻，不同大小的样品分子之间形成稳定的区带，因此，梯度胶对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带，即使电场在继续作用时，各区带之间也保持相对位置不变。因此，梯度胶不仅能进一步提高凝胶电泳的分辨率，还能在同一凝胶板中同时分离，分析大小相差很大的样品分子。同时，由于这种梯度胶系统中，凝胶的孔径大小成相应的梯度，用这种方法样品分子迁移后也不易再扩散，是一种较好的分析方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种外观、分辨率、重复性和稳定性好的梯度胶。
[0008]本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种梯度胶，所述梯度胶为SDS-PAGE梯度胶，所述SDS-PAGE梯度胶由轻液和重液组成，所述轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5X):20-35%汸液:15-70%，双蒸水:0-60%，甘油:0-15%, AP:0.15-0.40%, TEMED:0.015-0.04%，且所述轻液和重液组成成分及含量不同。
[0009]在上述的一种梯度胶中，所述凝胶缓冲液是通过将262gBis_Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.2-6.6。
[0010]在上述的一种梯度胶中，所述A液为30%的Acr-BiS水溶液，其中Acr与Bis的质量比为19:1。
[0011]在上述的一种梯度胶中，所述梯度胶为4% -20% SDS-PAGE梯度胶。
[0012]在上述的一种梯度胶中，所述4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):23mL ;A 液:14mL，双蒸水:43mL, AP:300 μ L，TEMED:30 μ L ;重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A 液:46mL,甘油:4mL, AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。
[0013]在上述的一种梯度胶中，所述梯度胶为8% -16% SDS-PAGE梯度胶。
[0014]在上述的一种梯度胶中，所述8% -16% SDS-PAGE梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):20mL ;A 液:15mL，双蒸水:39mL, AP:135 μ L，TEMED:13 μ L ;重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，双蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL, AP:135 μ L，TEMED:13μ L。
[0015]本发明另一个目的在于提供上述梯度胶的制备方法，所述制备方法主要包括胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装；
[0016]其中，所述胶液配制是按上述配方配制梯度胶的轻液和重液，其中，TEMED和AP在灌胶前加入，且添加顺序依次为TEMED、AP ；
[0017]所述灌胶的具体过程为:将配制好的梯度胶的轻液、重液置于梯度混合仪的相应容器内，同时打开磁力搅拌器进行搅拌，然后排除灌胶管内气体后当重液和轻液的高度一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，液体达到灌胶槽顶部后停止灌胶。
[0018]本发明梯度胶的制备过程中，灌胶前还要进行拼装夹具等准备工作，将胶夹表面的碎屑清理干净，扣紧卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。然后将拼装好的夹具以数个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液，然后加水检测确保灌胶槽不漏液，然后用清水清洗梯度混合仪，保证仪器通畅。
[0019]本发明胶液是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，而聚合反应是通过自由基聚合，因此就需要自由基，而本发明加入的AP就是作为引发剂产生自由基，TEMED则是催化AP产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。因此，在胶液配置过程中，TEMED和AP必须在灌胶前才加入胶液中，而且必须严格按照先添加TEMED而后添加AP的顺序，以保证聚合效果。
[0020]本发明在灌胶过程中，先使胶液流出3-5滴后再将灌胶管接在灌胶槽阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，阀门一般控制在55-65度倾斜，当液体达到顶部后关闭，停止灌胶。在灌胶后采用清水清洗仪器，避免管道堵塞。
[0021]灌胶完成后保证2_3h的聚合时间，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行封装。
[0022]在上述的一种梯度胶的制备方法中，所述封装是将修整后的梯度胶进行真空封装后置于4-8°C进行保存，且封装时加入300-500 μ L储存缓冲液。
[0023]在上述的一种梯度胶的制备方法中，所述储存缓冲液由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20-35% ;甘油:l-8%，100mmol/L 的 EDTA:0.1_5%，余量为去矿物质水。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下几个优点:
[0025]1.本发明梯度胶外观较好，表面无残胶，胶柱无倾斜并且所有胶柱的顶端和胶孔的底端都分别在同一水平线上，胶体表面无条纹，胶体底部无缺损。
[0026]2.本发明梯度胶分辨率高，对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带。
[0027]3.本发明梯度胶稳定性好，无论是在电场继续作用下，还是存放一定时间后，各区带之间相对位置基本不变。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例1和2制备得到的梯度胶和对比例的单一浓度的凝胶的电泳检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0029]以下是本发明的具体实施例，并结合【专利附图】
【附图说明】对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0030]实施例1:
[0031]首先，配制4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，其中，梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):23mL 汸液:14mL，双蒸水:43mL，AP:300 μ L,TEMED:30μ L ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5 X):20mL ；A液:46mL，甘油:4mL，AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。原料中的凝胶缓冲液是通过将262g Bis-Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.4 ;A液为30%的Acr-Bis水溶液，Acr与Bis的质量比为19:1。按以上配方配制4^-20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，而TEMED和AP在各液体加完后在灌胶前加入,且添加顺序依次为TEMED、AP。
[0032]在配制胶液的同时，进行胶夹的拼接，将胶夹表面碎屑清理干净，扣紧各卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼装好的胶夹以12个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液。然后拧紧胶槽各螺丝，以防漏液。最后加水检测确保灌胶槽不漏液后，打开恒流泵，将流速调整到最大，用水清洗梯度混合仪，确保仪器畅通后，关闭恒流泵。
[0033]然后将配制好的胶液按轻液，重液分别置于梯度混合仪相应容器内(此时混合仪由重液流向轻液的阀门保持关闭)，同时打开磁力搅拌器，搅拌速度为使指针指向6的位置。然后将恒流泵流速调至3.0,打开恒流泵，使胶液流出3?5滴再将灌胶管接在灌胶槽的阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门，阀门一般控制在60度倾斜，当灌胶槽的液体到达顶部先关闭恒流泵再关闭灌胶槽阀门，停止灌胶。灌好胶后要用清水清洗恒流泵和梯度混合仪，避免管道堵塞。
[0034]灌胶完成后聚合2h，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行真空封装，置于4-8°C保存。在封装时加入400 μ L储存缓冲液，储存缓冲液由60mL的凝胶缓冲液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA与去矿物质水配成总体积为220mL的溶液。
[0035]实施例2:
[0036]首先，配制8^-16% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，其中，梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):20mL 汸液:15mL，双蒸水:39mL，AP: 135 μ L7TEMED:13μ L ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，双蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL，AP: 135 μ L，TEMED:13 μ L。原料中的凝胶缓冲液(3.5X)是通过将262g Bis-Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.4 ;A液为30%的Acr-Bis水溶液，Acr与Bis的质量比为19:1。按以上配方配制4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，而TEMED和AP在各液体加完后在灌胶前加入，且添加顺序依次为TEMED、AP。
[0037]在配制胶液的同时，进行胶夹的拼接，将胶夹表面碎屑清理干净，扣紧各卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼装好的胶夹以13个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液。然后拧紧胶槽各螺丝，以防漏液。最后加水检测确保灌胶槽不漏液后，打开恒流泵，将流速调整到最大，用水清洗梯度混合仪，确保仪器畅通后，关闭恒流泵。
[0038]然后将配制好的胶液按轻液，重液分别置于梯度混合仪相应容器内(此时混合仪由重液流向轻液的阀门保持关闭)，同时打开磁力搅拌器，搅拌速度为使指针指向6的位置。然后将恒流泵流速调至3.0,打开恒流泵，使胶液流出3?5滴再将灌胶管接在灌胶槽的阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门，阀门一般控制在60度倾斜，当灌胶槽的液体到达顶部先关闭恒流泵再关闭灌胶槽阀门，停止灌胶。灌好胶后要用清水清洗恒流泵和梯度混合仪，避免管道堵塞。
[0039]灌胶完成后聚合3h，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行真空封装，置于4-8°C保存。在封装时加入400 μ L储存缓冲液，储存缓冲液由60mL的凝胶缓冲液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA与去矿物质水配成总体积为220mL的溶液。
[0040]对比例1:
[0041 ] 市售浓度为8 %的SDS-PAGE凝胶。
[0042]对比例2:
[0043]市售浓度为10 %的SDS-PAGE凝胶。
[0044]对比例3:
[0045]市售浓度为12%的SDS-PAGE凝胶。
[0046]先对本发明实施例1和2制得的梯度胶进行外观检测，结果为:梯度胶的表面无残胶，胶柱无倾斜并且所有胶柱的顶端和胶孔的底端都分别在同一水平线上，胶体表面无条纹，胶体底部无缺损。
[0047]再将本发明实施例1和2制得的梯度胶和对比例1-3单一浓度的凝胶对样品为JWllO空菌裂解液进行电泳检测，电泳检测过程中所采用的电泳缓冲液(1X)由60.6g的Tris base, 104.6g的MOPS, 1g的SDS和3g的EDTA溶于去矿物质水配制成IL的标准液；转印缓冲液(20X)由60g的Tris base和81.6g的Bicine溶于去矿物质水配制成IL的标准液；上样缓冲液(5X)由Ig的SDS, 5mL的甘油，25mg的Bromophenol Blue, 150mg的Tris base和ImL的2-Mercapoethanol溶于去矿物质水配制成1mL的标准液，pH为6.8。电泳检测结果如图1所示。
[0048]从图1可知，本发明实施例1和2制得的梯度胶电泳检测结果为:条带SHARP，分辨率明显高于对比例单一浓度的凝胶，对样品JWllO空菌裂解液组成的分析更为细致，且相邻条带清晰可辨，指定细胞裂解同一蛋白条带在同一水平线上。而且，在37°c下放置一个月，条带基本没有发生改变，稳定性相当强。
[0049]实施例3-4与实施例1-2的区别仅在于凝胶缓冲液的pH为6.2。
[0050]实施例5-6与实施例1-2的区别仅在于凝胶缓冲液的pH为6.6。
[0051]实施例7-8与实施例1-2的区别仅在于储存缓冲液加入量为300 μ L。
[0052]实施例9-10与实施例1-2的区别仅在于储存缓冲液加入量为500 μ L。
[0053]实施例11-12与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为5% -10% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0054]实施例13-14与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为3% -12% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0055]实施例15-16与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为6% -18% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0056]实施例17-18与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -20% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0057]实施例19-20与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -30% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0058]实施例21-22与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为12% -28% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0059]实施例23-24与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为I % -100% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0060]实施例25-26与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为5% -80% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0061]实施例27-28与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0062]实施例29-30与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为20% -30% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0063]实施例31-32与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为30% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0064]实施例33-34与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为40% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0065]实施例35-36与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为50% -60% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0066]鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-2作为代表说明本发明申请优异之处。
[0067]本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处，同样都在本发明要求保护的范围内。
[0068]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属【技术领域】的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0069]尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
【权利要求】
1.一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为梯度胶，所述梯度胶由轻液和重液组成，所述轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5^):20-35% ；八液:15-70%，双蒸水:0-60%，甘油:0-15%，八?:0.15-0.4012120:0.015-0.04%，且所述轻液和重液组成成分及含量不同。
2.根据权利要求1所述的一种梯度胶，其特征在于，所述凝胶缓冲液是通过将2628618-11-18溶于去矿物质水配制成的标准液，邱为6.2-6.6。
3.根据权利要求1所述的一种梯度胶，其特征在于，所述八液为30%的&1-818水溶液，其中与818的质量比为19:1。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为4%-20%808~？^62梯度胶。
5.根据权利要求4所述的一种梯度胶，其特征在于，所述4%-20% 808~？^62梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X3:2301减:1?[，双蒸水:43齓，八?:300^1,丁2腳:30^1 ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X3:2001纖:46111匕甘油姐，八?:200 卩 1, 丁腿0:20 卩 I。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为8%-16%808~？^62梯度胶。
7.根据权利要求6所述的一种梯度胶，其特征在于，所述8%-16% 八⑶梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5父〉:2001 ；八液:15111匕双蒸水:39齓，八?:135比12120:13 ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5 X): 20^1 ；八液:30^1,双蒸水:7.5111[，甘油:7.51111,:135111, 12120:139 匕
8.一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法主要包括胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装； 其中，所述胶液配制是按上述配方配制梯度胶的轻液和重液，其中，12120和八？在灌胶前加入，且添加顺序依次为12腿0、八？； 所述灌胶的具体过程为:将配制好的梯度胶的轻液、重液置于梯度混合仪相应容器内，同时打开磁力搅拌器进行搅拌，然后排除灌胶管内气体后当重液和轻液的高度一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，液体达到顶部后关闭。
9.根据权利要求8所述的一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述封装是将修整后的梯度胶进行真空封装后置于4-81进行保存，且封装时加入300-500 9 I储存缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述储存缓冲液由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5^):20-35% ；甘油的201八:0.1-5%，余量为去矿物质水。
【文档编号】G01N27/447GK104359964SQ201410609912
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】郑华安 申请人:宁波市鄞州华谦电子有限公司
【专利摘要】本发明涉及一种梯度胶及其制备方法，该梯度胶为SDS-PAGE梯度胶，由轻液和重液组成，轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成：凝胶缓冲液(3.5×)：20-35％；A液：15-70％，双蒸水：0-60％，甘油：0-15％，AP：0.15-0.40％，TEMED：0.015-0.04％，且轻液和重液组成成分及含量不同，通过胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装制成。本发明制成的梯度胶外观较好，分辨率高，对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带且稳定性好，无论是在电场继续作用下，还是存放一定时间后，各区带之间相对位置基本不变。
【专利说明】一种梯度胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种凝胶及其制备方法，尤其涉及一种梯度胶及其制备方法。
[0002]本申请中下列定义是指:
[0003]轻液:梯度胶中浓度较低的胶液；
[0004]重液:梯度胶中浓度较高的胶液；
[0005]凝胶缓冲液(3.5X):是指将配制的凝胶缓冲液标准液稀释3.5倍制得，本发明中其它类似表示意义均相同。
【背景技术】
[0006]随着泳动距离的增加，单一浓度的凝胶在一些情况下难以发挥较好的作用，无法检测、分离全部样品分子。因此，目前梯度胶已广泛取代了单一浓度的凝胶。样品分子在这种梯度胶中泳动时，起初由于样品分子在孔径比它大的凝胶区域中泳动，各种大小不同的样品分子以各自不同的泳动率在电场中运动；但后来，当样品分子达到凝胶孔径小于样品分子大小的区域中时，样品分子就被凝胶孔限所阻，不同大小的样品分子之间形成稳定的区带，因此，梯度胶对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带，即使电场在继续作用时，各区带之间也保持相对位置不变。因此，梯度胶不仅能进一步提高凝胶电泳的分辨率，还能在同一凝胶板中同时分离，分析大小相差很大的样品分子。同时，由于这种梯度胶系统中，凝胶的孔径大小成相应的梯度，用这种方法样品分子迁移后也不易再扩散，是一种较好的分析方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种外观、分辨率、重复性和稳定性好的梯度胶。
[0008]本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种梯度胶，所述梯度胶为SDS-PAGE梯度胶，所述SDS-PAGE梯度胶由轻液和重液组成，所述轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5X):20-35%汸液:15-70%，双蒸水:0-60%，甘油:0-15%, AP:0.15-0.40%, TEMED:0.015-0.04%，且所述轻液和重液组成成分及含量不同。
[0009]在上述的一种梯度胶中，所述凝胶缓冲液是通过将262gBis_Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.2-6.6。
[0010]在上述的一种梯度胶中，所述A液为30%的Acr-BiS水溶液，其中Acr与Bis的质量比为19:1。
[0011]在上述的一种梯度胶中，所述梯度胶为4% -20% SDS-PAGE梯度胶。
[0012]在上述的一种梯度胶中，所述4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):23mL ;A 液:14mL，双蒸水:43mL, AP:300 μ L，TEMED:30 μ L ;重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A 液:46mL,甘油:4mL, AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。
[0013]在上述的一种梯度胶中，所述梯度胶为8% -16% SDS-PAGE梯度胶。
[0014]在上述的一种梯度胶中，所述8% -16% SDS-PAGE梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):20mL ;A 液:15mL，双蒸水:39mL, AP:135 μ L，TEMED:13 μ L ;重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，双蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL, AP:135 μ L，TEMED:13μ L。
[0015]本发明另一个目的在于提供上述梯度胶的制备方法，所述制备方法主要包括胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装；
[0016]其中，所述胶液配制是按上述配方配制梯度胶的轻液和重液，其中，TEMED和AP在灌胶前加入，且添加顺序依次为TEMED、AP ；
[0017]所述灌胶的具体过程为:将配制好的梯度胶的轻液、重液置于梯度混合仪的相应容器内，同时打开磁力搅拌器进行搅拌，然后排除灌胶管内气体后当重液和轻液的高度一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，液体达到灌胶槽顶部后停止灌胶。
[0018]本发明梯度胶的制备过程中，灌胶前还要进行拼装夹具等准备工作，将胶夹表面的碎屑清理干净，扣紧卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。然后将拼装好的夹具以数个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液，然后加水检测确保灌胶槽不漏液，然后用清水清洗梯度混合仪，保证仪器通畅。
[0019]本发明胶液是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，而聚合反应是通过自由基聚合，因此就需要自由基，而本发明加入的AP就是作为引发剂产生自由基，TEMED则是催化AP产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。因此，在胶液配置过程中，TEMED和AP必须在灌胶前才加入胶液中，而且必须严格按照先添加TEMED而后添加AP的顺序，以保证聚合效果。
[0020]本发明在灌胶过程中，先使胶液流出3-5滴后再将灌胶管接在灌胶槽阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，阀门一般控制在55-65度倾斜，当液体达到顶部后关闭，停止灌胶。在灌胶后采用清水清洗仪器，避免管道堵塞。
[0021]灌胶完成后保证2_3h的聚合时间，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行封装。
[0022]在上述的一种梯度胶的制备方法中，所述封装是将修整后的梯度胶进行真空封装后置于4-8°C进行保存，且封装时加入300-500 μ L储存缓冲液。
[0023]在上述的一种梯度胶的制备方法中，所述储存缓冲液由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20-35% ;甘油:l-8%，100mmol/L 的 EDTA:0.1_5%，余量为去矿物质水。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下几个优点:
[0025]1.本发明梯度胶外观较好，表面无残胶，胶柱无倾斜并且所有胶柱的顶端和胶孔的底端都分别在同一水平线上，胶体表面无条纹，胶体底部无缺损。
[0026]2.本发明梯度胶分辨率高，对样品分子组成的分析更为细致，获得更清晰的样品分子区带。
[0027]3.本发明梯度胶稳定性好，无论是在电场继续作用下，还是存放一定时间后，各区带之间相对位置基本不变。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例1和2制备得到的梯度胶和对比例的单一浓度的凝胶的电泳检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0029]以下是本发明的具体实施例，并结合【专利附图】
【附图说明】对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0030]实施例1:
[0031]首先，配制4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，其中，梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):23mL 汸液:14mL，双蒸水:43mL，AP:300 μ L,TEMED:30μ L ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5 X):20mL ；A液:46mL，甘油:4mL，AP:200 μ L，TEMED:20 μ L。原料中的凝胶缓冲液是通过将262g Bis-Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.4 ;A液为30%的Acr-Bis水溶液，Acr与Bis的质量比为19:1。按以上配方配制4^-20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，而TEMED和AP在各液体加完后在灌胶前加入,且添加顺序依次为TEMED、AP。
[0032]在配制胶液的同时，进行胶夹的拼接，将胶夹表面碎屑清理干净，扣紧各卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼装好的胶夹以12个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液。然后拧紧胶槽各螺丝，以防漏液。最后加水检测确保灌胶槽不漏液后，打开恒流泵，将流速调整到最大，用水清洗梯度混合仪，确保仪器畅通后，关闭恒流泵。
[0033]然后将配制好的胶液按轻液，重液分别置于梯度混合仪相应容器内(此时混合仪由重液流向轻液的阀门保持关闭)，同时打开磁力搅拌器，搅拌速度为使指针指向6的位置。然后将恒流泵流速调至3.0,打开恒流泵，使胶液流出3?5滴再将灌胶管接在灌胶槽的阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门，阀门一般控制在60度倾斜，当灌胶槽的液体到达顶部先关闭恒流泵再关闭灌胶槽阀门，停止灌胶。灌好胶后要用清水清洗恒流泵和梯度混合仪，避免管道堵塞。
[0034]灌胶完成后聚合2h，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行真空封装，置于4-8°C保存。在封装时加入400 μ L储存缓冲液，储存缓冲液由60mL的凝胶缓冲液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA与去矿物质水配成总体积为220mL的溶液。
[0035]实施例2:
[0036]首先，配制8^-16% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，其中，梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X):20mL 汸液:15mL，双蒸水:39mL，AP: 135 μ L7TEMED:13μ L ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5Χ):20mL ；A液:30mL，双蒸水:7.5mL，甘油:7.5mL，AP: 135 μ L，TEMED:13 μ L。原料中的凝胶缓冲液(3.5X)是通过将262g Bis-Tris溶于去矿物质水配制成IL的标准液，pH为6.4 ;A液为30%的Acr-Bis水溶液，Acr与Bis的质量比为19:1。按以上配方配制4% -20% SDS-PAGE梯度胶的轻液和重液，而TEMED和AP在各液体加完后在灌胶前加入，且添加顺序依次为TEMED、AP。
[0037]在配制胶液的同时，进行胶夹的拼接，将胶夹表面碎屑清理干净，扣紧各卡扣，然后将梳子插好，梳子的光滑面朝向板子背面。拼装好的胶夹以13个为单位放入灌胶槽，保证有孔道标记的一面(背面)靠近灌胶槽的背面，且所有的胶夹保持同一方向，防止取胶时损坏胶孔。如留有空隙用挡板填充，安装灌胶阀门，确保连接处不漏液。然后拧紧胶槽各螺丝，以防漏液。最后加水检测确保灌胶槽不漏液后，打开恒流泵，将流速调整到最大，用水清洗梯度混合仪，确保仪器畅通后，关闭恒流泵。
[0038]然后将配制好的胶液按轻液，重液分别置于梯度混合仪相应容器内(此时混合仪由重液流向轻液的阀门保持关闭)，同时打开磁力搅拌器，搅拌速度为使指针指向6的位置。然后将恒流泵流速调至3.0,打开恒流泵，使胶液流出3?5滴再将灌胶管接在灌胶槽的阀上，以排除灌胶管内的气体，防止将气泡引入胶内。当重液和轻液的高度达到一致时，打开梯度混合仪中间的阀门，阀门一般控制在60度倾斜，当灌胶槽的液体到达顶部先关闭恒流泵再关闭灌胶槽阀门，停止灌胶。灌好胶后要用清水清洗恒流泵和梯度混合仪，避免管道堵塞。
[0039]灌胶完成后聚合3h，聚合时不能移动灌胶槽，以免在胶未聚合前由于移动而影响所形成的梯度。聚合结束后将胶拆下并用清水冲洗干净。然后对胶进行修整，修整前首先进行目测，检查胶体是否有明显缺陷，包括:①、检查胶内是否含有气泡，若有气泡要把气泡赶走、检查胶体表面是否有条纹现象(有条纹现象则属于次品)、检查胶体下边缘是否完整且平整、检查胶板卡口是否干净(若不干净则用水冲洗干净)、检查胶孔是否在一直线上。胶体都符合要求后，才开始拔梳齿，且在拔梳齿时保证均匀用力，不能拔断，拔出后把气泡赶干净，同时检查胶柱是否完整竖直，切掉突出的胶柱部分，然后进行真空封装，置于4-8°C保存。在封装时加入400 μ L储存缓冲液，储存缓冲液由60mL的凝胶缓冲液(3.5X)，1mL的甘油，3mL的100mmol/L的EDTA与去矿物质水配成总体积为220mL的溶液。
[0040]对比例1:
[0041 ] 市售浓度为8 %的SDS-PAGE凝胶。
[0042]对比例2:
[0043]市售浓度为10 %的SDS-PAGE凝胶。
[0044]对比例3:
[0045]市售浓度为12%的SDS-PAGE凝胶。
[0046]先对本发明实施例1和2制得的梯度胶进行外观检测，结果为:梯度胶的表面无残胶，胶柱无倾斜并且所有胶柱的顶端和胶孔的底端都分别在同一水平线上，胶体表面无条纹，胶体底部无缺损。
[0047]再将本发明实施例1和2制得的梯度胶和对比例1-3单一浓度的凝胶对样品为JWllO空菌裂解液进行电泳检测，电泳检测过程中所采用的电泳缓冲液(1X)由60.6g的Tris base, 104.6g的MOPS, 1g的SDS和3g的EDTA溶于去矿物质水配制成IL的标准液；转印缓冲液(20X)由60g的Tris base和81.6g的Bicine溶于去矿物质水配制成IL的标准液；上样缓冲液(5X)由Ig的SDS, 5mL的甘油，25mg的Bromophenol Blue, 150mg的Tris base和ImL的2-Mercapoethanol溶于去矿物质水配制成1mL的标准液，pH为6.8。电泳检测结果如图1所示。
[0048]从图1可知，本发明实施例1和2制得的梯度胶电泳检测结果为:条带SHARP，分辨率明显高于对比例单一浓度的凝胶，对样品JWllO空菌裂解液组成的分析更为细致，且相邻条带清晰可辨，指定细胞裂解同一蛋白条带在同一水平线上。而且，在37°c下放置一个月，条带基本没有发生改变，稳定性相当强。
[0049]实施例3-4与实施例1-2的区别仅在于凝胶缓冲液的pH为6.2。
[0050]实施例5-6与实施例1-2的区别仅在于凝胶缓冲液的pH为6.6。
[0051]实施例7-8与实施例1-2的区别仅在于储存缓冲液加入量为300 μ L。
[0052]实施例9-10与实施例1-2的区别仅在于储存缓冲液加入量为500 μ L。
[0053]实施例11-12与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为5% -10% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0054]实施例13-14与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为3% -12% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0055]实施例15-16与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为6% -18% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0056]实施例17-18与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -20% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0057]实施例19-20与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -30% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0058]实施例21-22与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为12% -28% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0059]实施例23-24与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为I % -100% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0060]实施例25-26与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为5% -80% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0061]实施例27-28与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为10% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0062]实施例29-30与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为20% -30% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0063]实施例31-32与实施例1-2的区别仅在于梯度胶为30% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0064]实施例33-34与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为40% -50% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0065]实施例35-36与实施例1_2的区别仅在于梯度胶为50% -60% SDS-PAGE梯度胶，轻液和重液配比在组成成分及其体积百分比内即可。
[0066]鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-2作为代表说明本发明申请优异之处。
[0067]本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处，同样都在本发明要求保护的范围内。
[0068]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属【技术领域】的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0069]尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
【权利要求】
1.一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为梯度胶，所述梯度胶由轻液和重液组成，所述轻液和重液均由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5^):20-35% ；八液:15-70%，双蒸水:0-60%，甘油:0-15%，八?:0.15-0.4012120:0.015-0.04%，且所述轻液和重液组成成分及含量不同。
2.根据权利要求1所述的一种梯度胶，其特征在于，所述凝胶缓冲液是通过将2628618-11-18溶于去矿物质水配制成的标准液，邱为6.2-6.6。
3.根据权利要求1所述的一种梯度胶，其特征在于，所述八液为30%的&1-818水溶液，其中与818的质量比为19:1。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为4%-20%808~？^62梯度胶。
5.根据权利要求4所述的一种梯度胶，其特征在于，所述4%-20% 808~？^62梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X3:2301减:1?[，双蒸水:43齓，八?:300^1,丁2腳:30^1 ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5X3:2001纖:46111匕甘油姐，八?:200 卩 1, 丁腿0:20 卩 I。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种梯度胶，其特征在于，所述梯度胶为8%-16%808~？^62梯度胶。
7.根据权利要求6所述的一种梯度胶，其特征在于，所述8%-16% 八⑶梯度胶的轻液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5父〉:2001 ；八液:15111匕双蒸水:39齓，八?:135比12120:13 ；重液由以下成分组成:凝胶缓冲液(3.5 X): 20^1 ；八液:30^1,双蒸水:7.5111[，甘油:7.51111,:135111, 12120:139 匕
8.一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法主要包括胶液配制、灌胶、清洗、聚合、拆胶、修整和封装； 其中，所述胶液配制是按上述配方配制梯度胶的轻液和重液，其中，12120和八？在灌胶前加入，且添加顺序依次为12腿0、八？； 所述灌胶的具体过程为:将配制好的梯度胶的轻液、重液置于梯度混合仪相应容器内，同时打开磁力搅拌器进行搅拌，然后排除灌胶管内气体后当重液和轻液的高度一致时，打开梯度混合仪中间的阀门进行灌胶，液体达到顶部后关闭。
9.根据权利要求8所述的一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述封装是将修整后的梯度胶进行真空封装后置于4-81进行保存，且封装时加入300-500 9 I储存缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种梯度胶的制备方法，其特征在于，所述储存缓冲液由以下成分(以体积百分比计)组成:凝胶缓冲液(3.5^):20-35% ；甘油的201八:0.1-5%，余量为去矿物质水。
【文档编号】G01N27/447GK104359964SQ201410609912
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】郑华安 申请人:宁波市鄞州华谦电子有限公司
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