偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法
【专利摘要】偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法：步骤⑴-步骤⑺为试纸条制作：步骤⑻-步骤⑼.为磁珠包被方法：以MES buffer作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以BST buffer 作为缓冲液，将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。步骤⑽-步骤⑾为封闭方法：⑿.保存。本发明的制备方法操作简单，结果可靠。新方法所制备的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条克服了现有技术的不足，能够简单快速地检测肌钙蛋白，检测结果更加精准，应用领域较宽，对抗体原料的利用率较高。
【专利说明】偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备方法，具体涉及一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 肌钙蛋白是一种调节心肌收缩的蛋白质分子，由肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白T (TnT)和肌钙蛋白I(TnI)三个亚基组成。随着心脏生物标志物应用的不断发展，肌钙蛋白 已成为诊断心肌梗死(MI)的首选标志物。该标志物的临床快检（POCT)的发展，能够让患者 得到及时适当的治疗。以罗氏的肌钙蛋白T测试卡为例，CTnT的临界值为0.lng/ml，检测 卡的检测范围为0.l_2ng/ml，检测时间为8-12分钟。
[0003] 目前用于POCT诊断CTnT和cTnl的免疫学方法主要包括了胶体金免疫层析法和 荧光法。这两种方法都能够应用于诊断试纸条。
[0004] 胶体金免疫层析法制备的胶体金诊断试纸条，其检测结果可通过肉眼观察到显色 现象。但肌钙蛋白的浓度无法通过颜色变化准确定量。此外，金纳米与抗体的连接通常采 用被动吸附法，该反应虽然简单快速，但无法控制抗体的Fab端在纳米颗粒表面的方向性， 降低了抗原捕获效率，对抗体原料的利用率也有一定的影响。
[0005] 荧光法与胶体金免疫层析法类似，相对于金纳米颗粒而言，荧光微球在诊断试纸 条上流动时，由于微球尺寸较大（200nm及以上)，容易产生团聚；流动过程中，微球-抗体连 接物在未到达T线时已经发生了部分的沉积，造成较强的非特异性吸附；在检测时，由于光 学检测器只能收集试纸条表面的光强信号，对血样全部流过T线后的情况无法完全反映， 使得检测结果不精准。
[0006] 半导体量子点虽然光稳定性好、发射谱带较窄、量子产率较高、发光可调，但其潜 在的生物毒性及间歇发光性(光闪烁）限制了在生物检测领域的应用。
[0007] 稀土上转换发光材料的晶体高晶化程度对材料的发光能力影响显著。但提高高晶 化程度会大大增加合成材料的工序和成本。配套的光学检测器对激发光的波长范围要求很 高，而常规激发光的发射功率又偏低，导致了包括发光材料和检测器在内的整套检测产品 的制造成本偏高，限制了该类材料的大规模生产与普及应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种改进的、偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方 法。本方法中提供了新的磁珠包被方法：特别是包括活化步骤与偶联步骤：以2-(N_吗啉 代）乙磺酸缓冲液（MESbuffer)作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以硼 酸-吐温作为缓冲液（BSTbuffer)，将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。本 发明的制备方法操作简单，结果可靠。新方法所制备的诊断试纸条克服了现有技术的不足， 能够简单快速地检测肌钙蛋白，检测结果更加精准，应用领域较宽，对抗体原料的利用率较 商。
[0009] 本发明的方法所制备的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，与现有技术有所区 另IJ，该诊断试纸条的结构是，在结合垫与吸收垫之间设有NC膜(硝酸纤维膜)，该NC膜为滴 入待检测的血样的区域，其特征在于，在所述的NC膜中，含有免疫磁珠；该免疫磁珠是指： 直径约200nm的由聚苯乙烯包裹的铁纳米颗粒，表面有羧基，并在活化缓冲液中与单克隆 抗体偶联后构成的偶联了抗体的免疫磁珠。
[0010] 偶联了抗体的免疫磁珠，可以简称为"磁抗"，其中，所述被偶联的抗体，可以是 16A11和/或810。根据偶联抗体的不同，可以分别称为：16A11磁抗或810磁抗。
[0011] 完成本申请发明任务的技术方案是，一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的 制备方法，其特征在于，步骤如下： 步骤⑴-步骤(7)为试纸条制作： ⑴.试纸条在32°C过夜干燥； ⑵.将NC膜从冰箱取出，剪取适当长度置室温平衡至少2h; ⑶.配所需浓度的抗体，2mg/ml的19C7 ;方法：19C7抗体用buffer稀释； ⑷.将NC膜贴到底板上； (5) .划线之前先用稀NaOH清洗一个循环后静置，再用稀HCl清洗一个循环，静置后用 纯水清洗一个循环；划线机配置：1. 5μ1/cm，用铅笔将划好的T线标记好； (6) . 32~37°C干燥过夜； (7) .干燥结束，贴样品垫、吸水垫、AR膜，随后切条装盒备用； 步骤⑶-步骤(9).为磁珠包被方法： ⑶.活化： 以0.OlM2- (N-吗啉代）乙磺酸缓冲液（MESbuffer)作为活化缓冲液，取10μ1表 面有羧基的磁珠（固体含量10%，Millipore公司提供）加入离心管中，MSEbuffer洗涤，用 磁分离器分离后，弃上清液；洗涤3遍后，在离心管中加入242. 5μ1MESbuffer，再加入新 鲜配制的1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶液（EDC溶液）2. 5μ1和0. 25g/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS溶液）5μ1，振荡混匀，室温下旋转活化磁珠表面的羧基，反应 结束后，用MSEbuffer洗涤去除反应的活化剂，再用MSEbuffer洗涤磁珠； ⑶.偶联： 以0. 02MBSTbuffer作为偶联过程的缓冲液；用250μ1的BSTbuffer洗涤磁珠；洗 涤完成后，加入适量的单克隆抗体16A11/810,再加入BSTbuffer，保持离心管内溶液体积 为250μ1 ;振荡混匀，使磁珠表面活化的羧基与抗体的氨基在室温下旋转反应；偶联完成 后，磁分离器分离收集上清液，备用于检测偶联效率； 步骤(1Φ-步骤(11)为封闭方法： (1〇).上清液吸取后，在离心管中加入242. 5μ1的BST缓冲液和甘氨酸溶液，旋转封 闭； (11) .磁分离器分离弃上清液后，加入250μ1的1%(W/V)BSA封闭液（BST缓冲液稀释)， 对免疫磁珠表面没有完全反应的活化基团进行封闭； (12) .保存： BSTbuffer洗涤封闭完成的磁珠，最后将免疫磁珠保存重悬在250μ1的免疫微球保 存液中。
[0012] 本发明的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条使用方法如下： 16A11磁抗4. 6μ1，810磁抗4. 6μ1，待测血样3μ1，加入149. 5μΓ混合缓冲液（2%BSA+ 1%吐温+2. 5%蔗糖+ 0· 3%PVP-K30,溶于IOmMρΗ7· 4磷酸缓冲液）中，混合反应3分 钟后加入试纸条的点样口。
[0013] 进样128μ1 ,15分钟后，用Magnasense磁检测器读数。
[0014] 说明： 1) 混合缓冲液：2%1^(￥八)+1%吐温-20(￥八）+2.5(%鹿糖（￥八）+0.3% PVP-K30 (w/v)，溶于IOmMρΗ7. 4 磷酸缓冲液； 其中，BSA范围是0. 3~3%(w/v);吐温-20范围是0~2%(w/v);蔗糖范围0. 5~3%(w/v);PVP-K30 范围是 0·l~l%(w/v); 2) 检测时间在15分钟前为不稳定变化，15分钟~30分钟时检测的数值较稳定。
[0015] 更优化和更具体地说， 步骤⑴中所述的试纸条，（参照图1)，其吸收垫、结合垫与NC膜之间的连接缝隙控制在 2mm，T线位置位于距离结合垫42. 3mm处。
[0016] 步骤⑵中所述的"将NC膜从冰箱取出"，一般为4°C的冰箱。
[0017] 步骤⑶中所述的19C7抗体用buffer，其组成为：IOmMPBSph7. 4,含1%蔗糖，3% 的甲醇。
[0018] 步骤(5)中所述的用NaOH清洗，是用0.IM的NaOH清洗一个循环后静置IOmin;再 用0.IMHCl清洗一个循环,静置IOmin后用纯水清洗一个循环。
[0019] 步骤(5)中所述的划线，划线时相对湿度控制在60%左右。 步骤(5)中所述静置，推荐静置lOmin。
[0020] 步骤(5)中所述的用稀NaOH清洗，是用0.IM的NaOH清洗一个循环后静置IOmin; 所述的用稀HCl清洗，是用0.IMHCl清洗一个循环，静置IOmin后用纯水清洗一个循 环。
[0021] 步骤(6)中所述的32~37°C干燥过夜，以32°C为佳。
[0022] 步骤(7)中所述的切条装盒备用，相对湿度控制在35%左右。
[0023] 其中， I.NC膜孔径选择范围为：milliporeN135,SartoriusN95。SartoriusN95 对于 磁抗的流动和不团聚有较好的作用。
[0024] 2.吸水垫厚度选择范围：GEWhatmanCF6,捷宁H1。采用Hl时，抗原在0~lng/ml 浓度下的检测信号差别明显，建议采用。
[0025] 步骤(8)中所述的振荡混匀，是用旋涡混合器振荡混匀。
[0026] 步骤(8)中所述的室温下旋转活化磁珠表面的羧基，一般为3-30分钟。
[0027] 其中： I)MESbuffer的pH值为5. 0~6· 4,在pH5. 0时洗脱磁珠的效果最佳。
[0028] 2)活化时间5分钟时，活化效果最好，抗体的连接量既满足检测信号强度的需要， 又节约抗体用量。
[0029] 3)EDC与NHS的摩尔比是1:2,EDC的浓度范围在1μmol~10mmol，NHS的浓度范 围是2ymol~2mmol，其中以EDC2ymol，NHS4ymol时，活化效果最佳。参照图2。
[0030] 步骤(9)中所述的振荡混匀，是用旋涡混合器振荡混匀。
[0031] 其中： I)BST缓冲液pH值大于4,选择pH9时，抗体的偶联最佳。
[0032] 2)单克隆抗体的用量范围为2~40μg，其中10μg时，既能达到高包被效率和灵敏 信号，又节约原料。
[0033] 3)室温下的偶联旋转反应时间应大于1小时，以3小时为最佳。参照图3。
[0034] 步骤(11)所述的封闭方法：是在室温下旋转反应30分钟。
[0035] 其中： 1)根据磁珠比表面积的计算，甘氨酸用量应不超过总体系。当体积为7. 5μ1时，能够 起到充分封闭的效果，同时用量最经济。甘氨酸的浓度应不低于10mM，达到25mM时既能充 分封闭抗体的小位点，又能保持磁抗不团聚。
[0036] 2)旋转封闭甘氨酸时间在0. 5~3小时内均可，0. 5小时反应对之后的BSA封闭影 响最小。
[0037] 3)BSA的浓度为0. 1~3% (w/v)，在1%时室温旋转15分钟以上均能达到封闭目的， 其中室温30分钟和2~10度冷藏一天的效果大致相同，为最优参数。参照图4。
[0038] 步骤(12)所述的BSTbuffer洗涤封闭完成的磁珠，推荐操作4次。
[0039] 步骤(12)所述的免疫微球保存液的组成是：BST缓冲液中加入0. 1%BSA和0. 02%叠 氣纳中。
[0040] 本发明所制备的偶联了抗体的免疫磁珠与待检测的血样的比例是： 16A11 磁抗 4-5μ1，810 磁抗 4-5μ1，待测血样 2. 5-3. 5μ1，混合缓冲液 138-152μ1。
[0041] 其中，混合缓冲液是在检测前与待测血样一起滴入本诊断试纸条的NC膜。与现有 技术不同的是：磁抗既可以固定在本诊断试纸条的NC膜中；也可以通过磁抗与血样、缓冲 液的外混反应后，直接加样到NC膜上。
[0042] 本申请推荐以下最佳比例： 16Α11磁抗4. 6μ1，810磁抗4. 6μ1，待测血样3μ1，混合缓冲液149. 5μ1。
[0043] 上述混合缓冲液的组成是：2%BSA+ 1%吐温+2. 5%蔗糖+ 0. 3%PVP-K30,溶于 IOmMpH7. 4磷酸缓冲液中。
[0044] 所述的试纸条中，NC膜孔径选择范围为：milliporeN135,SartoriusN95。 SartoriusN95对于磁抗的流动和不团聚有较好的作用。
[0045] 所述的试纸条中，吸水垫厚度选择范围：GEWhatmanCF6,捷宁Hl。采用Hl时，抗 原在〇~lng/ml浓度下的检测信号差别明显，建议采用。
[0046] 本申请推荐：所述的试纸条，其吸收垫、结合垫与NC膜之间的连接缝隙控制在 2mm，T线位置位于距离结合垫42. 3mm处。
[0047] 本发明是一种改进的、偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法。本方法 中提供了新的磁珠包被方法：特别是包括活化步骤与偶联步骤：以2-(N-吗啉代）乙磺酸 缓冲液（MESbuffer)作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以硼酸-吐温缓冲 液（BSTbuffer)作为缓冲液，将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。本发明 的制备方法操作简单，结果可靠。新方法所制备的诊断试纸条克服了现有技术的不足，能够 简单快速地检测肌钙蛋白，检测结果更加精准，应用领域较宽，对抗体原料的利用率较高。
[0048] 磁信号检测更为敏感，可以定量检测极低浓度的样品。以CRP为例：（目前国内没 有使用磁检测器作为临床快检的产品，用于类比的产品为胶体金免疫层析法和荧光法仪器 检测的结果)。
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【权利要求】
1. 一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下： 步骤⑴-步骤(7)为试纸条制作： ⑴.试纸条在32°C过夜干燥； ⑵.将NC膜从冰箱取出，剪取适当长度置室温平衡至少2h ; ⑶.配所需浓度的抗体，2mg/ml的19C7 ;方法：19C7抗体用buffer稀释； ⑷.将NC膜贴到底板上； (5) .划线之前先用稀NaOH清洗一个循环后静置，再用稀HC1清洗一个循环，静置后用 纯水清洗一个循环；划线机配置：1. 5 yl/cm，用铅笔将划好的T线标记好； (6) . 32~37°C干燥过夜； (7) .干燥结束，贴样品垫、吸水垫、AR膜，随后切条装盒备用； 步骤⑶-步骤(9).为磁珠包被方法： ⑶.活化： 以0. 01M 2-(N-吗啉代）乙磺酸缓冲液作为活化缓冲液，取10 ill表面有羧基的磁珠 加入离心管中，MSE buffer洗涤，用磁分离器分离后，弃上清液；洗涤3遍后，在离心管中加 入242.5iU MES buffer，再加入新鲜配制的1-(3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶 液2. 5 yl和0. 25g/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液5 yl，振荡混匀，室温下旋转活化磁珠表面 的羧基，反应结束后，用MSE buffer洗涤去除反应的活化剂，再用MSE buffer洗涤磁珠； ⑶.偶联： 以0. 02M BST buffer作为偶联过程的缓冲液；用250 yl的BST buffer洗涤磁珠；洗 涤完成后，加入适量的单克隆抗体16A11/810,再加入BST buffer，保持离心管内溶液体积 为250 yl ;振荡混匀，使磁珠表面活化的羧基与抗体的氨基在室温下旋转反应；偶联完成 后，磁分离器分离收集上清液，备用于检测偶联效率； 步骤(W)-步骤(11)为封闭方法： (1〇).上清液吸取后，在离心管中加入242. 5 ill的BST缓冲液和甘氨酸溶液，旋转封 闭； (11) .磁分离器分离弃上清液后，加入250iU的1% (W/V)BSA封闭液，对免疫磁珠表面 没有完全反应的活化基团进行封闭； (12) .保存： BST buffer洗涤封闭完成的磁珠，最后将免疫磁珠保存重悬在250 yl的免疫微球保 存液中。
2. 根据权利要求1所述偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征在 于， 步骤⑶所述的19C7抗体用buffer稀释，该buffe的组成是：10mM PBS ph7. 4,含1%鹿 糖，3%的甲醇； 步骤(5)中所述的用稀NaOH清洗，是用0. 1M的NaOH清洗一个循环后静置lOmin ;所述 的用稀HC1清洗，是用0. 1M HC1清洗一个循环，静置10min后用纯水清洗一个循环； 步骤(7)中所述的切条装盒备用，相对湿度控制在35% ; 步骤⑶中所述的室温下旋转活化磁珠表面的羧基，时间为3-30分钟； 步骤(11)所述的封闭方法：是在室温下旋转反应30分钟； 步骤(12)所述的免疫微球保存液的组成是：BST缓冲液中加入0. 1%BSA和0. 02%叠氮钠 中。
3. 根据权利要求1所述偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征在 于，步骤(11)所述的BSA封闭液为BST缓冲液稀释的牛血清白蛋白封闭液。
4. 根据权利要求1所述偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征在 于， 步骤⑴中所述的试纸条，其吸收垫、结合垫与NC膜之间的连接缝隙控制在2mm，T线位 置位于距离结合垫42. 3mm处； 步骤⑵中所述的"将NC膜从冰箱取出"，为4°C的冰箱； 步骤(5)中所述的划线，划线时相对湿度控制在60% ;步骤(5)中所述静置，为静置lOmin ; 步骤(6)中所述的干燥过夜温度为32°C ; 步骤⑶中所述的振荡混匀，是用旋涡混合器振荡混匀；步骤(9)中所述的振荡混匀，是用 旋涡混合器振荡混匀； 步骤(12)所述的BST buffer洗漆封闭完成的磁珠，是操作4次。
5. 根据权利要求1-4之一所述偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其 特征在于，步骤⑴中所述的试纸条中，NC膜孔径选择范围为：millipore N135, Sartorius N95 ;所述吸水垫厚度选择范围：GE Whatman CF6或捷宁HI ; 步骤⑶中所述的洗脱，MES buffer的pH值为5. 0~6. 4 ;所述的活化时间为5分钟； 所述EDC与NHS的摩尔比是1:2, EDC的浓度范围在liimol~10mmol，NHS的浓度范围 是 2 u mo1~2mmo1 ； 步骤⑶中所述的BST缓冲液pH值为9时；单克隆抗体的用量范围为10 ii g ;室温下的 偶联旋转反应时间应为3小时； 步骤(11)所述的封闭方法，甘氨酸体积为7. 5 yl时；甘氨酸的浓度为25mM ;旋转封闭甘 氨酸时间为〇. 5小时；BSA的浓度为0. 1~3% (w/v);室温旋转时间为30分钟。
6. 根据权利要求5所述偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征 在于，本方法制备的所述偶联了抗体的免疫磁珠与待检测的血样的比例是：16A11磁抗 4-5 iil，810 磁抗 4-5 iil，待测血样 2. 5-3. 5 iil，混合缓冲液 138-152 ill。
7. 根据权利要求5所述的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，其特征在于，本方法 制备的所述偶联了抗体的免疫磁珠与待检测的血样的比例是：16A11磁抗4. 6 iil，810磁抗 4. 6 ii 1，待测血样3 ii 1，混合缓冲液147 ii 1。
8. 根据权利要求6或7所述的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，其特征在于，所 述混合缓冲液的组成是：2%BSA + 1%吐温+2. 5%蔗糖+ 0. 3% PVP-K30,溶于10mM pH7. 4 磷酸缓冲液中。
9. 根据权利要求8所述的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，其特征在于，所述的 试纸条中，NC膜孔径选择范围为：millipore N135, Sartorius N95 ;所述吸水垫厚度选择 范围：GE Whatman CF6,或捷宁 H1。
10. 根据权利要求9所述的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，其特征在于，所述 的试纸条，其吸收垫、结合垫与NC膜之间的连接缝隙控制在2_，T线位置位于距离结合垫 42. 3mm 处。
【文档编号】G01N33/531GK104483477SQ201410596438
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】杨昕 申请人:南京爱思唯志生物科技有限公司