一种电化学生物传感器,及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及一种电化学生物传感器，及其制备方法和用途，包括如下步骤：(1)将合成聚合物膜的药品配成特定浓度的溶液备用；(2)将DNA序列溶解在Tris-HCl缓冲溶液中备用；(3)将金电极进行抛光处理，再进行超声波清洗；(4)以处理干净的裸金电极为工作电极，以含有一定浓度模板分子的聚合物溶液为电解液，通过电聚合方法，合成聚合物修饰的金电极；(5)将得到的聚合物修饰金电极浸泡清洗，将聚合物中的模板分子洗脱掉，得到分子印迹膜修饰的金电极；(6)得到基于分子印迹聚合物膜构建的电化学生物传感器。结合了电化学生物传感器和分子印迹技术两者固有的优势，且合成方法简单、耗能低、成本低。利用目标分析物与模板分子——叶酸的特异性结合作用，或通过外切酶III的切割作用释放模板分子，达到分别检测叶酸受体和汞离子的目的。
【专利说明】一种电化学生物传感器，及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器【技术领域】，具体涉及用模板分子与聚合物构成的聚合物膜组装电化学传感器，并用此传感器对叶酸受体及汞离子进行分析检测。
【背景技术】
[0002]在传感器领域中，分子印迹技术由于其具有很高的选择识别属性、简单的合成及很高的稳定性，而引起研究者们广泛的探究兴趣。今年来电化学生物传感器因为制造成本低、仪器简单、操作简单和相应快速等优点而成为最有前景的分析方法之一。因此结合了这两者固有优势的基于分子印迹聚合物膜的电化学生物传感器，在生物分析、药物分析、环境监测和评估以及农药残留检测等领域具有巨大的潜力，也引起及其强烈的关注和研究。然而目前，大部分已报道的基于分子印迹聚合物膜的电化学生物传感器仅仅用于检测一种分析物——模板分子。很少有关研究体系可检测多种目标分析物。本申请尝试打破这个基于分子印迹聚合物膜的电化学生物传感器的瓶颈。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种电化学生物传感器，及其制备方法和用途，利用目标分析物与分子印迹膜中的模板分子的特异性结合作用，利用汞离子-胸腺嘧啶-汞离子碱基错配作用再通过外切酶III的切割作用释放模板分子，实现对叶酸受体及汞离子进行分析检测。具体技术方案如下:
[0004]一种电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0005](I)将合成聚合物膜的药品配成特定浓度的溶液备用；
[0006](2)将DNA序列溶解在Tris-HCl缓冲溶液中备用；
[0007](3)将金电极进行抛光处理，再进行超声波清洗；
[0008](4)以处理干净的裸金电极为工作电极，以含有一定浓度模板分子的聚合物溶液为电解液，通过电聚合方法，合成聚合物修饰的金电极；
[0009](5)将得到的聚合物修饰金电极浸泡清洗，将聚合物中的模板分子洗脱掉，得到分子印迹膜修饰的金电极；
[0010](6)得到基于分子印迹聚合物膜构建的电化学生物传感器。
[0011]进一步地，步骤(2)中，DNA序列采用一端氨基化，Tris-HCl的pH值为7.4，并在低温下下保存。
[0012]进一步地，步骤(3)中，包括如下步骤:
[0013](2-1)将金电极用0.3 μ m的铝粉进行抛光处理；
[0014](2-2)将金电极用0.5 μ m的铝粉进行抛光处理；
[0015](2-3)放入HNO3:H2O (v/v) = 1:1溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min ；
[0016](2-4)放入乙醇溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min ；
[0017](2-5)放入超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min。
[0018]进一步地，步骤(4)中，模板分子为叶酸。
[0019]进一步地，步骤(5)中，将聚合物修饰金电极置于含甲醇和醋酸的溶液中浸泡清洗约20?30min，用以将聚合物中的叶酸洗脱掉。
[0020]一种电化学生物传感器，采用上述方法制备得到。
[0021]上述电化学生物传感器的用途，用于对叶酸受体进行检测。
[0022]进一步地，所述检测方法包括:将不同浓度的叶酸受体加入至含有确定浓度的叶酸溶液中培养约40?60min ;待叶酸受体与叶酸结合完全，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极置于叶酸和叶酸受体反应后的溶液中，实现对叶酸受体的间接检测。
[0023]上述电化学生物传感器的用途，用于对汞离子进行检测。
[0024]进一步地，所述检测方法包括如下步骤:将不同浓度的汞离子加入至具有确定浓度的叶酸修饰的探针DNA溶液中培养30?50min，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极放在外切酶III切割后的溶液中，实现对汞离子的间接检测。
[0025]与目前现有技术相比，本发明制备的电化学生物传感器，结合了电化学生物传感器和分子印迹技术两者固有的优势，且合成方法简单、耗能低、成本低。利用目标分析物与模板分子——叶酸的特异性结合作用，或通过外切酶III的切割作用释放模板分子，达到分别检测叶酸受体和汞离子的目的。本发明使用电沉积法组装基于分子印迹聚合物膜的电化学生物传感器，利用目标分析物与分子印迹膜中的模板分子的特异性结合作用，利用汞离子-胸腺嘧啶-汞离子碱基错配作用再通过外切酶III的切割作用释放模板分子，从而实现对目标分析物检测的间接检测。此传感器实现了对目标分析物灵敏性、特异性、稳定性的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1(a)为叶酸印迹膜修饰的金电极的扫描电子显微镜图片；
[0027]图1(b)为聚合物修饰的金电极的扫描电子显微镜图片；
[0028]图2(a)为制备聚合物修饰金电极的电聚合循环伏安图。
[0029]图2(b)为每一步电极修饰过程电极的阻抗图。
[0030]图中:
[0031]a为裸的金电极的阻抗图。
[0032]b为聚合物修饰金电极的阻抗图。
[0033]c为分子印迹膜修饰的金电极的阻抗图。
[0034]d为分子印迹膜修饰的金电极在一定浓度模板分子溶液中培养后的阻抗图。
[0035]图2(c)为不同电极的循环伏安图。
[0036]图中
[0037]a为聚合物修饰电极的循环伏安图。
[0038]b为分子印迹膜修饰的金电极的循环伏安图。
[0039]c为分子印迹膜修饰的金电极在一定浓度模板分子溶液中培养后的循环伏安图。
[0040]图2(d)不同电极的差示脉冲伏安图。
[0041]图中
[0042]a为聚合物修饰电极的差示脉冲伏安图。
[0043]b为分子印迹膜修饰的金电极的差示脉冲伏安图。
[0044]c为分子印迹膜修饰的金电极在一定浓度模板分子溶液中培养后的差示脉冲伏安图。
[0045]图3(a)为基于分子印迹聚合物膜构建电化学生物传感器对不同浓度目标叶酸受体检测的循环伏安图。
[0046]图3(b)为此传感器对不同浓度叶酸受体响应的标准曲线。
[0047]图4(a)为基于分子印迹聚合物膜构建电化学生物传感器对不同浓度目标汞离子检测的循环伏安图。
[0048]图4(b)为此传感器对不同浓度汞离子响应的标准曲线。
[0049]图5为基于叶酸印迹聚合物膜的电化学传感器的制备及其对叶酸受体及汞离子的检测的简单原理图。
【具体实施方式】
[0050]下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
[0051]基于叶酸印迹聚合物膜的电化学传感器的制备及其对叶酸受体及汞离子的检测的步骤如下:
[0052]a、将购买的合成聚合物膜的药品配成特定浓度的溶液备用，将购买的DNA序列(一端氨基化)溶解在Tris-HCl (pH7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
[0053]b、将金电极先依次用0.3和0.5 μ m的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H20(v/v) = 1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3?5min。
[0054]C、以处理干净的裸的金电极为工作电极，以含有一定浓度模板分子一叶酸的聚合物溶液为电解液，通过电聚合方法，合成聚合物修饰的金电极。
[0055]d、将上述得到的聚合物修饰金电极放在含有甲醇和醋酸的溶液中浸泡清洗约20?30min，用以将聚合在聚合物中的模板分子——叶酸洗脱掉，从而得到叶酸印迹聚合物膜修饰的金电极。基于叶酸印迹聚合物膜的电化学传感器制备成功。
[0056]e、将不同浓度的叶酸受体加入到含有确定浓度的叶酸溶液中培养约40?60min，待叶酸受体与叶酸结合完全，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极置于叶酸和叶酸受体反应后的溶液中，实现对叶酸受体的间接检测。由于溶液中叶酸的浓度是确定的，那么叶酸受体的浓度越大，能够与溶液中的叶酸结合的就越多，使得溶液中剩余的叶酸的量随着加入叶酸受体的量的变化而变化，最终再结合到分子印迹膜修饰的金电极上的模板分子——叶酸的量就会变化，那么分子印迹膜修饰的金电极上对铁氰化钾/亚铁氰化钾探针的电化学响应就会相应变化。因此该传感器可对不同浓度目标叶酸受体进行定量检测。
[0057]f、将不同浓度的汞离子加入到具有确定浓度的叶酸修饰的探针DNA(叶酸-DNA)溶液中培养30?50min，利用DNA序列中的富胸腺嘧啶序列与汞离子的特异性结合作用，使得叶酸-DNA形成双链结构而能被外切酶III切割，释放叶酸分子，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极放在外切酶III切割后的溶液中，实现对汞离子的间接检测。由于溶液中叶酸-DNA的浓度是确定的，那么分子印迹膜修饰的金电极上对铁氰化钾/亚铁氰化钾探针的电化学响应就会随汞离子浓度变化而相应变化。因此该传感器可对不同浓度目标汞离子进行定量检测。
[0058]本发明制备的电化学生物传感器，结合了电化学生物传感器和分子印迹技术两者固有的优势，且合成方法简单、耗能低、成本低。利用目标分析物与模板分子——叶酸的特异性结合作用，或通过外切酶III的切割作用释放模板分子，达到分别检测叶酸受体和汞离子的目的。
[0059]上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将合成聚合物膜的药品配成特定浓度的溶液备用； (2)将DNA序列溶解在Tris-HCl缓冲溶液中备用； (3)将金电极进行抛光处理，再进行超声波清洗； (4)以处理干净的裸金电极为工作电极，以含有一定浓度模板分子的聚合物溶液为电解液，通过电聚合方法，合成聚合物修饰的金电极； (5)将得到的聚合物修饰金电极浸泡清洗，将聚合物中的模板分子洗脱掉，得到分子印迹膜修饰的金电极； (6)得到基于分子印迹聚合物膜构建的电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，DNA序列采用一端氨基化，Tris-HCl的pH值为7.4，并在低温下下保存。
3.如权利要求1或2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，包括如下步骤: (2-1)将金电极用0.3 μ m的铝粉进行抛光处理； (2-2)将金电极用0.5 μ m的铝粉进行抛光处理； (2-3)放入HNO3 = H2O (v/v) = 1:1溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min ； (2-4)放入乙醇溶液，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min ； (2-5)放入超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间为3?5min。
4.如权利要求1-3中任一项所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，模板分子为叶酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将聚合物修饰金电极置于含甲醇和醋酸的溶液中浸泡清洗约20?30min，用以将聚合物中的叶酸洗脱掉。
6.一种电化学生物传感器，其特征在于，采用如权利要求1-5所述方法制备得到。
7.如权利要求6所述电化学生物传感器的用途，其特征在于，用于对叶酸受体进行检测。
8.如权利要求7所述电化学生物传感器的用途，其特征在于，所述检测方法包括:将不同浓度的叶酸受体加入至含有确定浓度的叶酸溶液中培养约40?60min ;待叶酸受体与叶酸结合完全，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极置于叶酸和叶酸受体反应后的溶液中，实现对叶酸受体的间接检测。
9.如权利要求6所述电化学生物传感器的用途，其特征在于，用于对汞离子进行检测。
10.如权利要求9所述电化学生物传感器的用途，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤:将不同浓度的汞离子加入至具有确定浓度的叶酸修饰的探针DNA溶液中培养30?50min，将制备得到的分子印迹膜修饰的金电极放在外切酶III切割后的溶液中，实现对汞离子的间接检测。
【文档编号】G01N27/327GK104267087SQ201410591901
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】王广凤, 陈玲 申请人:安徽师范大学