一种基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：步骤1)，移取纳米金溶液和含有三聚氰胺的溶液于一离心管中，充分混匀，作用5分钟使得纳米金达到最佳的团聚态；步骤2)，移取上述纳米金溶液和三聚氰胺溶液的混合溶液于化学发光池中，采用静态注射的方式注入鲁米诺–过氧化氢化学发光试剂，通过IFFL-D流动注射化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度，根据测定结果进行判定。本发明检出限达到8.6×10–14g/mL，达到目前固相萃取-化学发光分析法的灵敏度，且较之简单方便的多；分析测试时间缩短为10分钟以内；整个操作实验的条件较温和，且完成在一均相的体系中，有利于自动化的分析操作。
【专利说明】-种基于纳米金化学发光快速检测H聚霞胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学检测【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种基于纳米金化学发光 快速检测H聚氯胺的方法。
【背景技术】
[000引S聚氯胺（melamine)化学名称为2, 4, 6-S胺基-1，3, 5-S嗦（2,4,6-triamin0-l，3,5-triazine)或 1,3,5-H嗦-2,4,6-H胺 (1, 3, 5-triazine-2, 4, 6-triamino)，是一种H嗦类含氮杂环有机化合物，俗称密胺、蛋白 精。作为一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用途是与酵缩合，生产塑料。由于其形态酷 似蛋白粉，无异味，含氮量高达66%，远高于普通蛋白质的含氮量，慢性毒性不容易被发现。 添加该品可引起凯氏定氮法测得的表观上蛋白质质量分数提高，产品质量"合格"，同时大 幅降低生产成本，因此常被不法分子作为蛋白质替代品添加到乳品、饲料中。H聚氯胺本身 毒性较小，长期或反复摄入可能对肾和膀脫产生影响，导致结石产生。鉴于H聚氯胺的人为 添加会对消费者造成危害，我国有关部口已发布了H聚氯胺限量值的公告。因此，对H聚 氯胺进行有效的检测对于食品尤其乳制品的安全具有一定的意义。
[0003]目前国内外常用于H聚氯胺的检测方法，主要有高效液相色谱法（HPLC)、液相色 谱-质谱联用法、免疫分析法、毛细管电泳法、气质联用法、英光光度法等。该些方法及技术 各有各的优点和使用范围。在该些分析方法中，HPLC法是最常用的检测方法，具有高效、快 速、灵敏度高、检出率高等特点；但由于前处理较复杂，所需仪器较昂贵，操作繁琐、费时，所 用试剂毒性较大，污染环境，且对实验操作人员具有一定的技术要求，不适于H聚氯胺的快 速检测。气质联用和液质联用技术虽然是目前较先进的检测方法，但其设备昂贵，试剂消耗 量大，检测成本高，仅能于部分实验室作为确证方法使用，不适合广泛使用。毛细管电泳法 分离度高，分离效果好，所用试剂量小，价廉无污染，但灵敏度不够高。近红外吸收法虽然选 择性好，可实现在线检测，但设备价格昂贵，需要不断进行校准，样品基质中的干扰是近红 外分析精度及重现性的一大障碍。免疫分析法灵敏度高，可适用于大量样品的快速筛选，但 是操作繁琐、费时。比色法方便快捷，价廉易操作，但只适用于H聚氯胺含量大时进行筛选， 无法进行痕量检测，且当待测物碱性大时误差亦较大。拉曼光谱技术W及核磁共振法虽然 能够满足快捷简易的要求，但是仪器本身比较昂贵。因此，发展简便、快速且实用性强的用 于H聚氯胺检测的分析方法显得很有必要。
[0004] 针对现有技术存在的相对不足，提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决了目前检测H聚氯胺分析方法存在的局限性；包括使用大型 昂贵的仪器、分析成本高、灵敏度不能满足各方面的需求；操作麻烦且对分析人员的要求较 高；分析测定时间较长。利用H聚氯胺能够增强鲁米诺-过氧化氨-纳米金体系化学发光 信号，建立一种全新的简单灵敏基于纳米金催化化学发光分析测定H聚氯胺的方法。
[0006] 本发明提供的技术方案是；一种基于纳米金化学发光快速检测H聚氯胺的方法， 包括W下步骤：
[0007] 步骤1)，移取纳米金溶液和含有H聚氯胺的溶液于一离也管中，充分混匀，作用 5分钟使得纳米金达到最佳的团聚态；所述的纳米金溶液中的纳米金的粒径为2. 6皿，浓 度为5.OXl(T7mol/L。所述的2. 6nm纳米金溶液的制备过程为；在室温、强力揽拌的条件 下，将100血的HAuCl^O. 01%w/w)水溶液、1血的1 %巧樣酸H轴溶液和1血的0. 075% NaBH4/l%巧樣酸H轴溶液完全混合，混合后溶液揽拌30分钟，完全反应后，于4°C冰箱保存 待用。所述的鲁米诺-过氧化氨化学发光试剂选择鲁米诺的浓度为4Xl(r5mol/l，过氧化 氨浓度为4Xl(T2mol/l，鲁米诺和过氧化氨的体积比为2:1。所述的鲁米诺-过氧化氨化 学发光试剂的抑值为12.0。
[0008]步骤2)，移取上述纳米金溶液和H聚氯胺溶液的混合溶液于化学发光池中，采用 静态注射的方式注入鲁米诺-过氧化氨化学发光试剂，通过IFFL-D流动注射化学发光分 析仪测定并记录其化学发光强度，根据测定结果进行判定。
[0009] 本发明提供的另外的技术方案是；将步骤1)中所述的鲁米诺-过氧化氨化学发 光试剂用鲁米诺-高楓酸钟化学发光试剂代替。
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] 化学发光分析因具有灵敏度高、线性范围宽、试剂便宜及仪器操作简单等优点已 广泛应用于药物分析中。而化学发光分析检测H聚氯胺的研究报道很少。近年来，随着纳 米科学的迅猛发展，纳米材料因其特有的光学和电学等理化性质已经W各种角色用于化学 发光生物分析中，开创了纳米粒子化学发光生物分析的新邻域。一度成为研究的热点。然 而遗憾的是，基于纳米金催化化学发光分析测定H聚氯胺的研究还未见报道。我们的研究 发现H聚氯胺能够增强鲁米诺-过氧化氨-纳米金体系的化学发光信号，基于此建立了一 种纳米金催化化学发光分析测定H聚氯胺的分析方法，该方法简单灵敏，快速。整个分析测 定将会在10分钟之内完成。
[0012] 本发明所建立的基于纳米金催化化学发光分析检测H聚氯胺的方法，解决了现 有检测方法遇到的问题，具有W下优点；（1)检出限达到8.6Xl(^l4g/mレ达到目前固相萃 取-化学发光分析法的灵敏度，且较之简单方便的多；（2)该方法的分析测试时间缩短为10 分钟W内；（3)整个操作实验的条件较温和，且完成在一均相的体系中，有利于自动化的分 析操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整更好地理解本发明W 及容易得知其中许多伴随的优点，但此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解， 构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发 明的不当限定，其中：
[0014] 图1纳米金浓度的优化示意图；
[0015] 图2鲁米诺浓度的优化示意图；
[0016] 图3过氧化氨浓度的优化示意图；
[0017] 图4体系抑的选择示意图；
[0018] 图5化学发光检测H聚氯胺的灵敏度分析示意图。
【具体实施方式】
[0019] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0020] 所用到的主要仪器设备和试剂：
[0021]IFFL-D流动注射化学发光分析仪及其配套设备（西安瑞迈分析仪器有限公司）， 5840R台式高速大容量离也机巧ppendo计Ltd.德国），TU-1901型紫外-可见分光光度 仪（北京普析通用仪器有限公司），透射电子显微镜（日立公司，规格型号；H-600)。
[00过氯金酸（HAuCL?化0,AR,Au含量>47. 8%，国药集团化学试剂有限公司）；将氯 金酸固体溶于二次去离子水中制备氯金酸储备溶液，放于4C冰箱中保存。将4. 4：3g鲁米诺 固体粉末溶解在20mL0.IOM化OH溶液中并稀释至比，制备得到2. 5X10-2M鲁米诺储备溶 液。使用之前避光保存一星期W确保试剂性质的稳定。鲁米诺的工作溶液通过储备溶液的 稀释而得到。&化的工作溶液在每次使用时从30 % (w/w)H2化（上海化学试剂公司）稀释得 至IJ。称取H聚氯胺（北京兴福精细化学研究所）0. 0050g，加水溶解后，定容于IOOml容量瓶 中，配置lXl(T4g/mlH聚氯胺储备液。实验用水为二次去离子水。
[002引实验条件的优化：
[0024]实验中选用2. 6nm的纳米金，考查了金的浓度的影响。如图1，金的浓度越大，体系 的发光强度也越大，而当金浓度大于5. 0Xl(Tmol/L时，体系的化学发光强度有所减弱。本 发明选用纳米金的粒径为2. 6皿，浓度为5.OXICTmoi/L。
[00巧]考察了化学发光试剂的影响，如图2和3,发现随着鲁米诺和过氧化氨浓度的 增加，体系的发光强度越大。考虑到化学发光强度和试剂的消耗，选择鲁米诺的浓度为 4Xl〇-5mol/L，过氧化氨浓度为 4Xl〇-2mol/L〇
[002引考察了体系抑值的影响，如图4,当体系的抑值小于12时，随着抑值的增加化学 发光强度增大；而当体系的抑值大于12时，随着抑值的增加化学发光强度减弱。本发明 所用体系的抑值优化为12.0。
[0027] 2. 6皿纳米金的制备：
[002引制备过程中所用的玻璃器皿均使用王水清洗（1:3HN03 -肥1)，然后用二次去离子 水彻底冲洗干净，烘干备用。2. 6nm纳米金的制备方法为测氨化轴还原法。制备过程简述 如下；在室温、强力揽拌的条件下，将100血的HAuCL化01%w/w)水溶液、1血的1 %巧樣 酸H轴溶液和ImL的0. 075%NaBH4/l%巧樣酸H轴溶液完全混合。混合后溶液揽拌30分 钟，完全反应后，于4C冰箱保存待用。
[0029] 静态注射化学发光分析测定H聚氯胺：
[0030] 本发明所建立的化学发光分析测定H聚氯胺的方法，采用静态注射的方式进行。 整个过程分为两个步骤；H聚氯胺和纳米金的相互作用和化学发光分析的测定，而且该两 个步骤是完全独立的。具体的测定过程如下；（1)移取纳米金和H聚氯胺的溶液于一离也 管中，充分混匀，作用5分钟使得纳米金达到最佳的团聚态；（2)移取上述纳米金/H聚氯 胺溶液100yL于化学发光池（40X14mm石英管）中，注入200yL鲁米诺-过氧化氨化学 发光试剂（4XICT5M鲁米诺和4XICT2M过氧化氨的体积比为2:1)，通过IFFL-D流动注射化 学发光分析仪测定并记录其化学发光强度。
[0031] H聚氯胺化学发光的分析性能：
[0032] 在上述优化的实验条件下，实现了对H聚氯胺化学发光分析的测定。结果表明，随 着H聚氯胺浓度的增加，化学发光信号逐渐增强。且在3. 8XIO42?2. 6XlCrWg/血的浓度 范围内，H聚氯胺的浓度与化学发光信号的强度成良好的相关性，线性曲线如图5所示，其 检出限为8.6Xl(Ti4g/mL(S/N= 3)。并对1.6Xl(TWg/mL的H聚氯胺平行测定11次，其 相对标准偏差为3. 2%。实验结果表明该方法检出限低，精密度好。较目前仅有的化学发光 分析方法的灵敏度要高很多，已达到固相萃取-化学发光分析法的灵敏度，且较之简单方 便的多。
[0033] 干扰测定
[0034] 于8. 6X10 - 1VmLH聚氯胺溶液中，分别加入1000倍的 2护，Ca",Mg2+，N03_，COs]-,PC^-和葡萄糖，100 倍的AP，Na+,Cl-，SO42-，尿素和巧樣酸，10 倍 的Cu",Ba"等进行干扰实验，结果表明均不干扰测定。
[00巧]样品分析的结果：
[0036] 按国标法处理样品。准确移取1血鲜牛奶样品，加入5mL肥1酸化的己膳（pH= 2. 0)溶液，超声15分钟，使蛋白质沉淀，而后再W8000r/min离也10分钟，转移合并上 清液，向上述清液中加入20mL正己焼，振荡、静置、弃去上层有机相，将下层清液减压蒸 干，水溶、用微孔滤膜过滤，用水定容，润旋混合1分钟后得清液备用。
[0037] 采用标准加入法进行回收率的实验，结果列于表1。实验结果表明，本发明所建立 的方法具有较好的准确度和精密度，回收率分别为97. 79%?102. 13%，RSD在1. 8%? 4.6%,且样品前处理简单，分析时间短，不需使用大型仪器，可用于牛奶样品中H聚氯 胺的快速检测。
[0038] 表1牛奶中H聚氯胺的测定结果（n=5)
[0039]
【权利要求】
1. 一种基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1)，移取纳米金溶液和含有三聚氰胺的溶液于一离心管中，充分混匀，作用5分钟 使得纳米金达到最佳的团聚态； 步骤2)，移取上述纳米金溶液和三聚氰胺溶液的混合溶液于化学发光池中，采用静态 注射的方式注入鲁米诺-过氧化氢化学发光试剂，通过IFFL-D流动注射化学发光分析仪 测定并记录其化学发光强度，根据测定结果进行判定。
2. 根据权利要求1所述的基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，其特征在 于，所述的纳米金溶液中的纳米金的粒径为2. 6nm，浓度为5. OX l(T7mol/L。
3. 根据权利要求1所述的基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，其特征在 于，所述的鲁米诺-过氧化氢化学发光试剂选择鲁米诺的浓度为4Xl(T5m〇l/L，过氧化氢 浓度为4X l(T2m〇l/L，鲁米诺和过氧化氢的体积比为2:1。
4. 根据权利要求1所述的基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，其特征在 于，所述的鲁米诺-过氧化氢化学发光试剂的pH值为12. 0。
5. 根据权利要求1所述的基于纳米金化学发光快速检测三聚氰胺的方法，其特征在 于，所述的鲁米诺-过氧化氢化学发光试剂用鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂代替。
【文档编号】G01N21/76GK104359897SQ201410576585
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】齐莹莹, 修福荣 申请人:福建工程学院