一种50nm银粒子的定量检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种50nm银粒子的定量检测方法。检测方法步骤包括：制备50nm银粒子的免疫原和包被抗原、制备50nm银粒子高特异性抗体、制备酶标抗体、用吸光度法测定50nm银粒子含量。本发明检测方法特异性高，灵敏度高，操作相对简单。
【专利说明】-种50nm银粒子的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料检测【技术领域】，特别涉及一种50nm银粒子的定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 多个世纪以来，银通常被作为金属银被大家广泛使用，如银饰品和银器具。现如 今，随着纳米技术的发展，以纳米技术为核心的新科技革命已经成为当今时代的主题。银常 作为纳米粒子的形式渗透到我们日常生活与生产中。同其他有机的抗微生物相比，纳米银 具有抗菌性和低毒性，因此纳米银在抗菌药物和食品生产中已经被广泛的应用。纳米银对 环境安全和人类健康贡献极大，开发应用前景极其广阔，在生活日渐便捷化的今日，纳米银 添加制品已成为广大消费者的必备用品。
[0003] 我们知道，纳米银可以通过直接或间接接触等途径进入环境和人体，在纳米银如 此广阔的开发应用前景下，我们对纳米银可能产生的生物学效应和潜在的毒理性研究还不 够充分。白春礼院士在293次香山会议上的报告指出："在发展纳米的同时，同步开展其安 全性研究，使纳米技术成为人类第一个在其可能产生负面效应之前，就已经过认真的研究， 引起广泛重视，并最终能安全造福人类的技术。"同时，2003年，Science和Nature也相继 发表文章，探讨纳米材料的生物效应、对环境和健康的影响。因此，对纳米材料的研究及其 重要。
[0004] 目前，我们可以通过透射式电子显微镜（TEM)、原子力显微镜（AFM)和扫描电子显 微镜（SEM)等对纳米银的尺寸、外貌和结构形态做一定的研究，但对于纳米银的定量检测 却是一项极其具有挑战性的工作。目前，我们对纳米粒子的定量检测方法主要有电感耦合 等离子体质谱法、分光光度法、火焰原子吸收光谱法和电化学法等，但上述方法均存在一定 的缺陷，比如电感稱合等离子体质谱法只适用特定尺寸的纳米粒子，对于小尺寸的纳米粒 子并不适用；分光光度法和火焰原子吸收光谱法干扰因素较多，对含量较高样品的测定结 果尚可，但对低含量样品的检测能力不强；而电化学分析法定量分析稳定性差，灵敏度低， 不适合理论应用。所以，开发一种简单、快速、适用于现场监控的痕量分析方法已经迫在眉 睫。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种50nm银粒子的定量检测方法，本 发明检测方法对痕量50nm银粒子的检测方法特异性高，灵敏度高，操作相对简单。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] -种50nm银粒子的定量检测方法，步骤包括：
[0008] a、制备50nm银私子的免疫原和包被抗原；
[0009] b、将免疫原注射到动物体内，制得50nm银粒子高特异性抗体；
[0010] C、制备酶标抗体；
[0011] d、用吸光度法测定50nm银粒子含量，利用直接竞争酶联免疫法将标准品与待测 样竞争抗体的反应，酶标抗体的酶可以促使底物液发光，从而测得吸光度值，即可通过标准 曲线来定量检测50nm银粒子含量。
[0012] 所述50nm银粒子的制备方法为：
[0013] 称取27. 8mg的AgN03溶解于100mL蒸馏水中溶解，再转移到三角烧瓶中，缓慢搅 拌下油浴加热至沸腾，快速加入3mL 1 %的柠檬酸三钠溶液，继续沸腾35分钟，冷却后用棕 色瓶收集，4ΓΙΓ·存备用，所得溶液即为含50nm银粒子的溶液。
[0014] 所述步骤a中50nm银粒子的免疫原的制备方法为：
[0015] 在搅拌下将巯基乙酸（TGA)水溶液加入到50nm银粒子溶液中，在搅拌15-20min 后，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDAC)和N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)的水溶液，室温避光下搅拌3-4h，然后再调节pH9?10,加入牛血清白蛋白溶液 (BSA, sigma公司），4°C下搅拌5-6h,将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析12小时以 上，避光低温保存。
[0016] 所述避光低温保存温度为CC;
[0017] 所述巯基乙酸水溶液质量百分比浓度为9.9%，50nm银粒子溶液浓度lOOyg/ mL，EDAC 溶液浓度为 10mg/mL，NHS 溶液浓度为 10mg/mL，BSA 浓度为 10g/L，TGA、EDAC 和 NHS的物质的量比1:2:4 ;纳米银粒子溶液、巯基乙酸溶液和牛血清白蛋白溶液的体积比为 400:1:10 ；
[0018] 所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于用质量百分比 1 %卵清蛋白溶液（OVA)代替10g/L牛血清白蛋白；
[0019] 所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为：
[0020] 将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶，对动物进行多次免疫，制得50nm银粒 子高特异性抗体。
[0021] 所述多次免疫方法为：第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂 量0. 5mg?lmg/kg/次，免疫注射，免疫三周后，进行六次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原 与弗氏不完全佐剂混溶，进行免疫注射，免疫剂量〇. 5mg?lmg/kg/次，六次加强免疫间隔 为2-3周，经六次加强免疫后，从动物静脉采血，血清室温20-251!静置〇. 5-lh，在冰箱 4?#置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性抗体。
[0022] 所述弗氏佐剂制备方法为：将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声 3小时左右，使之完全混匀，制得不完全弗氏佐剂；临用前向不完全弗氏佐剂中加入卡介苗 即为完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂与卡介苗的体积比为6:1。
[0023] 所述动物包括哺乳动物、禽类，哺乳动物包括家兔、马、羊、鼠、猪和猴，优选兔和 鼠，禽类包括鸡、鸭和鹅，优选鸡；所述的动物为适龄、健壮、无感染的动物，优选雄性动物， 动物的年龄应为青壮年，兔龄选月龄2?5个月，体重2?3Kg的成年雄兔，鸡优选蛋鸡。
[0024] 所述的免疫注射的部位包括腹腔内、静脉内、肌肉内、淋巴结内、皮下和皮内注射， 这些方法可以单独使用或多次组合使用，优选背部皮下多点注射、皮内多点注射和腿部肌 肉注射单独或多种组合注射。
[0025] 所述的佐剂也可以为胞壁酸二肽、多糖类物质等有机佐剂，或者明矾等无机佐剂。
[0026] 所述步骤c酶标抗体的制备方法为：
[0027] 取辣根过氧化物酶lOmg溶于0. 4mL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸钠缓冲液即CB缓冲 液，待溶解后加入25%戊二醛0. lmL，然后37°C温育2小时；之后加入0-4°C无水乙醇2mL， 2500r/min离心15分钟，倾去上清液；取沉淀用80%乙醇411^混悬，同上离心，倾去乙醇，将 管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用lmL 0.05mol/L pH9.6 CB缓冲液溶解，加入0.5-lmL50nm 银粒子抗体，放在冰箱内过夜后，用少量的NaH2P04调至中性即可。最后用饱和硫酸铵溶液 沉淀法将其纯化，纯化抗体于4°C或-20°C保存。
[0028] 所述步骤d具体为：
[0029] 1)包被：将包被抗原与水以1:50?1:200稀释后制成稀释液，优选1:100,用稀 释液包被96孔酶标板，每孔加稀释液80?150 μ L，优选100 μ L，放置4°C过夜，取出用洗涤 液PBST洗涤2?6次，每次2?6分钟，优选洗涤3?5次，每次3?5分钟。
[0030] 2)封闭：加入质量百分比浓度为1 %?5% OVA溶液，优选1 %的OVA ;每孔100? 200 μ L，优选150?200 μ L，封闭没有包被抗原的多余的部分，30°C?40°C温育0. 5?2. 0 小时后，取出用洗涤液PBST洗涤2?6次，每次2?6分钟，优选37°C温育0. 5?1. 0小时 后，取出用洗涤液PBST洗涤3?5次，每次3?5分钟。
[0031] 3)竞争：加入50 μ 1/孔不同浓度含50nm银粒子的溶液和样品溶液，然后加入分 别加入50 μ L酶标抗体，使之发生竞争反应。30°C?40°C下温育1?5小时，优选37°C下 温育3小时，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点，取出用洗涤液PBST 洗漆2?6次，每次2?6分钟，优选洗漆3?5次，每次3?5分钟。
[0032] 4)检测：加入底物液显色，每孔80?120 μ L，优选每孔100 μ L，温育30分钟后， 用2mol/L的H2S04终止液停止反应。用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度。
[0033] 5)、根据吸光强度和含50nm银粒子的溶液浓度绘制工作曲线，根据工作曲线求得 待测样品溶液中50nm银粒子的含量。
[0034] 本发明具有以下优点和积极效果：
[0035] (1)抗体实用性强：本发明制备出了特异性好、效价高的多克隆抗体。
[0036] (2)提供了一种对纳米材料的定量检测方法：通过制备的纳米银的多克隆抗体， 使我们能够测量痕量50nm AgNPs。
[0037] (3)此免疫分析方法特异性高，灵敏度高，操作相对简单。
【具体实施方式】
[0038] 实验药品及仪器：
[0039] (1)实验试剂
[0040] 牛血清蛋白（BSA)，羊血清蛋白（0VA)，辣根过氧化物酶（HRP)，液体石蜡，羊毛 月旨，无水乙醚，戊二醛（25% )，液体卡介苗，75%医用酒精，氢氧化钠，尿素，无水碳酸钠，碳 酸氢钠，磷酸氢二钠，氨水，硝酸银，巯基乙酸（99%，C 2H402S)，N-羟基琥珀酰亚胺（98%， C4H5N03)，柠檬酸三钠，磷酸，硫酸，乙醇，柠檬酸，邻苯二胺，盐酸，氯化钠，磷酸二氢钠，硫酸 铵，四硼酸钠，Tween-20,过氧化氢，实验用水为超纯水。
[0041] ⑵实验仪器
[0042] UV-4100型紫外-可见分光光度计，集散式恒温加热磁力搅拌器，磁力搅拌器，透 析袋，一次性注射器，多功能酶标仪，SCQ50超声波清洗器，TGL-16G高速台式离心机，96孔 酶标板。
[0043] (3)溶液的配制
[0044] 1) 1 %柠檬酸三钠：50mg柠檬酸三钠溶解在4. 95mL蒸馏水中
[0045] 2)生理盐水：0· 85g NaCl用蒸馏水定容到100mL
[0046] 3)包被液缓冲液（0· 05mol/L，pH = 9. 6 碳酸钠缓冲液，CB) :NaC030. 0795g， NaHC030. 147g溶于蒸馏水，定容到50mL
[0047] 4)稀释液（0· Olmol/L，pH = 7· 4 磷酸盐缓冲液，PBS) :Na2HP04 · 12H20 2. 96g， NaH2P04 · 2H20 (λ 2964g，NaCl 8. 0g，KC1 (λ 2g 溶于蒸馏水，定容到 lOOOmL
[0048] 5)洗涤液（0· 01mol/L，pH = 7. 4，PBST):由稀释液中加体积分数(λ 05%吐温制成
[0049] 6)封闭液：质量百分比为1 %的卵清蛋白（OVA)溶液，溶剂为PBS
[0050] 7)底物液：柠檬酸0. 5106g Na2HP04 · 12H20 1. 8408g溶于蒸馏水，定容到50mL，称 取4mg邻苯二胺溶于10mL上述溶液中，临用前加入15 μ L 30%的H202
[0051] 8)终止液：2mol/L硫酸溶液。
[0052] 实施例1
[0053] (1) 50nm AgNPs 即 50nm 银粒子全抗原
[0054] 1) 50nm AgNPs 的制备
[0055] 称取27. 8mg的AgN03溶解于100mL蒸馏水中溶解，再转移到三角烧瓶中，缓慢搅 拌下油浴加热至沸腾，快速加入3mL 1 %的柠檬酸三钠溶液，继续沸腾35分钟，冷却后用棕 色瓶收集，41*:存备用，所得溶液即为50nm AgNPs。
[0056] 2)免疫抗原和包被抗原的制备
[0057]
【权利要求】
1. 一种50nm银粒子的定量检测方法，步骤包括： a、 制备50nm银粒子的免疫原和包被抗原； b、 将免疫原注射到动物体内，制得50nm银粒子高特异性抗体； c、 制备酶标抗体； d、 用吸光度法测定50nm银粒子含量，利用直接竞争酶联免疫法将标准品与待测样竞 争抗体的反应，酶标抗体的酶可以促使底物液发光，从而测得吸光度值，即可通过标准曲线 来定量检测50nm银粒子含量。
2. 如权利要求1所述的测试方法，其特征在于： 所述步骤a中50nm银粒子的免疫原的制备方法为： 在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到50nm银粒子溶液中，在搅拌15-20min后，分别加入 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光下 搅拌3-4h，然后再调节pH9?10,加入牛血清白蛋白溶液，4°C下搅拌5-6h，将所得溶液装入 透析袋中，用蒸馏水透析12小时以上，避光低温保存。
3. 如权利要求2所述的测试方法，其特征在于：所述巯基乙酸溶液质量百分比浓度为 9. 9 %，50nm银粒子溶液溶液浓度100 μ g/mL，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺 盐酸盐溶液浓度为10mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为10mg/mL，牛血清白蛋白浓度为 10g/L，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:2:4 ;纳米银粒子溶液、巯基乙酸溶液和牛血清白 蛋白溶液的体积比为400:1:10。
4. 如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤b中高特异性抗体的制备方 法为： 将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶，对动物进行多次免疫，制得50nm银粒子高 特异性抗体。
5. 如权利要求4所述的测试方法，其特征在于：所述多次免疫方法为：第一次动物免疫 将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量〇. 5mg?lmg/kg/次，免疫注射，免疫三周后，进 行六次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，进行免疫注射，免疫剂量 0. 5mg?lmg/kg/次，六次加强免疫间隔为2-3周，经六次加强免疫后，从动物静脉采血， 血清室温20-25°C静置0. 5-lh，在冰箱4°C静置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性 抗体。
6. 如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤c酶标抗体的制备方法为： 取辣根过氧化物酶l〇mg溶于0. 4mL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸钠缓冲液即CB缓冲液，待 溶解后加入25%戊二醛0. lmL，然后37°C温育2小时；之后加入0-4°C无水乙醇2mL，2500r/ min离心15分钟，倾去上清液；取沉淀以80%乙醇4mL混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒 置，使乙醇充分流出；沉淀用lmL 0.05mol/L pH9.6CB缓冲液溶解，加入0.5-lmL50nm银粒 子抗体，放在冰箱内过夜后，用少量的NaH2P0 4调至中性即可。最后用饱和硫酸铵溶液沉淀 法将其纯化，纯化抗体于4°C或_20°C保存。
7. 如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤d具体为： 1)包被：将包被抗原与水以1:50?1:200稀释后制成稀释液，优选1:100,用稀释液 包被96孔酶标板，每孔加稀释液80?150 μ L，优选100 μ L，放置4°C过夜，取出用洗涤液 PBST洗涤2?6次，每次2?6分钟，优选洗涤3?5次，每次3?5分钟。 2) 封闭：加入质量百分比浓度为1%?5% OVA溶液，优选1%的OVA;每孔100? 200 μ L，优选150?200 μ L，封闭没有包被抗原的多余的部分，30°C?40°C温育0. 5?2. 0 小时后，取出用洗涤液PBST洗涤2?6次，每次2?6分钟，优选37°C温育0. 5?1. 0小时 后，取出用洗涤液PBST洗涤3?5次，每次3?5分钟。 3) 竞争：加入50 μ 1/孔不同浓度含50nm银粒子的溶液和样品溶液，然后加入分别加 入50yL酶标抗体，使之发生竞争反应。30°C?40°C下温育1?5小时，优选37°C下温育 3小时，使待测物质和固相抗原同时竞争酶标抗体上的结合位点，取出用洗涤液PBST洗涤 2?6次，每次2?6分钟，优选洗漆3?5次，每次3?5分钟。 4) 检测：加入底物液显色，每孔80?120 μ L，优选每孔100 μ L，温育30分钟后，用 2mol/L的H2S04终止液停止反应。用多功能酶标仪测定各孔在490nm时的吸光强度。 5) 、根据吸光强度和含50nm银粒子的溶液浓度绘制工作曲线，根据工作曲线求得待测 样品溶液中50nm银粒子的含量。
【文档编号】G01N33/535GK104251902SQ201410513013
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】张明翠, 吴瑕玉 申请人:安徽师范大学