一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用，本发明提供的miRNA检测方法结合恒温指数扩增反应(EXPAR)和表面增强拉曼光谱(SERS)技术，简单易行、检测特异性高、且能同时检测多个目标miRNA。该方法包括如下步骤：通过恒温指数扩增反应扩增待测miRNA；将扩增产物、捕获探针-金属纳米颗粒复合物、以及报告探针进行混合杂交，再将杂交产物转移到硅片上，进行SERS检测。
【专利说明】一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于恒温指数扩增反应与表面增强 拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一类内源性进化保守的非编码RNA，其大小长约20?25个核 苷酸。miRNA在基因转录后调节和细胞功能中起着重要作用，参与多种调节途径，如细胞的 增殖、分化、凋亡及机体的免疫机制等。miRNA在许多肿瘤中起着原癌基因和抑癌基因的作 用，若miRNA表达水平异常，可导致癌症的发生。miRNA的核酸序列非常短，且丰度低，不同 miRNA序列之间只差几个碱基数，则需要精确的方法去检测miRNA。
[0003]目前，qRT_PCR(定量逆转录聚合酶链式反应）、miRNA微阵列和第二代测序技术是 主要的miRNA检测手段。其中，qRT-PCR是目前最为认可的miRNA定量检测手段，具有较高 的检测特异性和灵敏度，但是引物设计的难度较高，操作过程较为繁琐；miRNA微阵列的检 测特异性和灵敏度有待提高；第二代测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和数据 解析，从而限制了它们的广泛应用。
[0004] 核酸指数扩增反应（EXPAR)是一种在恒温条件下，对短链核酸序列以高效率呈指 数级扩增的技术方法，该方法利用线性扩增生成寡核苷酸产物作为新的引物结合到含有两 段重复序列的模板上，切口酶进行酶切后，又生成同样序列的寡核苷酸产物，造成了链式反 应，则寡核苷酸产物成指数级增长。EXPAR可在数分钟之内对目标分子扩增出IO6倍以上，其 扩增倍数堪比PCR技术，而与PCR所需时间更短，且反应不需要精确的热循环。但是，EXPAR 通常是以SYBRGreenI作为荧光指示剂，而SYBRGreenI具有一些缺点，如抑制扩增反应、 促进非特异扩增；此外，对含有多个目标miRNA的样品，该方法不能对同一样品中的多个目 标同时、分别进行检测。
[0005]SERS已广泛应用于生物大分子如核酸、蛋白质，小分子如葡萄糖，药物的检测，以 及哺乳动物细胞或组织的成像。尽管miRNA可以由SERS直接检测出，但miRNA核苷酸序列 结构的相似性会导致SERS峰的重叠而难以辨认。
[0006] 针对上述问题，有必要提供一种简单易行、检测特异性高、且能同时检测多个目标 miRNA的方法。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检 测的miRNA检测方法及其应用。本发明提供的miRNA检测方法结合恒温指数扩增反应 (EXPAR)和表面增强拉曼光谱（SERS)技术，简单易行、检测特异性高、且能同时检测多个目 标miRNA。
[0008] 本发明所述"miRNA"是指微小核糖核酸（MicroRNA)。
[0009] 第一方面，本发明提供了一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的 miRNA检测方法，包括如下步骤：
[0010] 1)提供或配置恒温指数扩增反应体系，扩增待测miRNA，通过恒温指数扩增反应 扩增待测miRNA，得到扩增产物，其中，所述恒温指数扩增反应体系中包括待测样品和扩增 模板；
[0011] 2)制备金属纳米颗粒，然后采用巯基修饰的捕获探针对所述金属纳米颗粒进行标 记，得到捕获探针-金属纳米颗粒复合物；
[0012] 3)提供报告分子修饰的报告探针；
[0013] 4)将步骤⑴所得的扩增产物、步骤⑵所得的捕获探针-金属纳米颗粒复合物、 以及步骤（3)所述的报告探针进行混合，得到反应液，所述反应液在55?95°C下孵育2? 10分钟后，自然冷却到室温，离心、洗涤、去上清，再将沉淀转移到硅片上，自然晾干后进行 SERS检测；
[0014] 其中，步骤（1)所述的扩增模板、步骤（2)所述的捕获探针、步骤（3)所述的报告 探针均为单链脱氧核糖核苷酸，所述捕获探针和报告探针互不相同，且不互补；
[0015] 所述扩增模板包括X序列和T序列，所述X序列和T序列之间具有切刻内切酶的 识别序列；所述X序列与待测miRNA互补，所述T序列包括C序列和R序列，所述C序列为 捕获探针的核苷酸序列，所述R序列为报告探针的序列。
[0016] 如本发明所述的，"所述X序列和T序列之间具有切刻内切酶的识别序列"是指具 有X序列和T序列的扩增模板经过EXPAR扩增后，产生的双链DNA能被切刻内切酶识别， 切刻内切酶能特异性的对与T序列互补的链进行酶切，产生大量与T序列互补的核苷酸链 (T，）。
[0017] 如本发明所述的，"T序列包括C序列和R序列"是指具有T序列的扩增模板经过 EXPAR扩增后，产生的与T序列互补的核苷酸链（Τ'）能与所述捕获探针和报告探针互补， 即Τ'经过本发明步骤（4)的反应后，能通过碱基配对的特异性结合作用，将反应液中的捕 获探针（C序列）和报告探针（R序列）富集在Τ'链上。
[0018] 在本发明一实施例中，所述EXPAR体系中包括至少一种待测miRNA和至少一种扩 增模板。
[0019] 在本发明一优选实施例中，各种扩增模板之间的X序列互不相同。
[0020] 在此优选条件下，不同的待测miRNA可以与不同的X序列互补，从而启动EXPAR扩 增反应。
[0021] 在本发明一优选实施例中，各种扩增模板之间的R序列互不相同。
[0022] 在此优选条件下，采用不同的R序列即可对应不同的待测miRNA，经EXPAR扩增后， 不同待测miRNA的信息可通过不同的、对应的R序列得到放大。由于不同R序列所修饰的 报告分子不同，其报告基团也不同，不同报告基团的SERS特征峰也不同，因此，通过不同报 告基团的SERS特征峰可以读出待测样品中待测miRNA的信息。
[0023] 在本发明一优选实施例中，各种扩增模板之间的C序列相同。
[0024] 在此优选条件下，在步骤（4)只需采用一种捕获探针-金属纳米颗粒复合物可完 成多种miRNA的检测。
[0025] 在本发明一优选实施例中，各种扩增模板之间的C序列互不相同。
[0026] 在此优选条件下，在步骤（4)可采用两种或两种以上的捕获探针-金属纳米颗粒 复合物完成多种miRNA的检测。
[0027] 在本发明一实施例中，所述X序列不处于所述扩增模板的3'端。
[0028] 如本发明所述的，"所述X序列不处于所述扩增模板的5'端"是因为待测miRNA 作为引物结合到扩增模板上，聚合酶按照扩增模板的3'端向5'端方向在引物的3'添加序 列，因此，扩增模板的5'端若为X序列，会导致聚合酶的聚合反应中止。
[0029] 在本发明一优选实施例中，所述EXPAR体系中，每种待测miRNA至少对应一种扩增 模板。
[0030] 如本发明所述的，"每种待测miRNA对应至少一种扩增模板"是指一种待测miRNA 能作为一种或一种以上扩增模板的引物。这样可以使得每种待测miRNA至少对应一种报告 分子，从而进一步提高某些丰度很低辨认度较低、不易被区分的待测miRNA被检测出来的 概率。
[0031] 在此优选条件下，在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述每种待测miRNA作 为一种以上扩增模板的引物。
[0032] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述扩增模板中的T序列至少重复1次。
[0033] 在此优选条件下，所述扩增模板至少包括2个T序列。
[0034] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述EXPAR体系中，至少包括1个T 序列，其中，所述待测样品中，相对于丰度较高的待测miRNA，丰度较低的待测miRNA对应的 扩增模板含有更多重复次数的T序列。
[0035] 如本发明所述的，"扩增模板中的T序列至少重复1次"可以提高待测样品中丰度 相对较低的待测miRNA被检测出来的概率，比如，同一样品，相同EXPAR处理条件下，不同丰 度的miRNA被扩增的程度不同，经EXPAR扩增后，丰度低的miRNA和丰度高的miRNA之间的 浓度差距被进一步放大。若对丰度低的miRNA设计具有多个T序列的扩增模板（比如X-T-T 或X-T-T-T)，则相对于其它miRNA的扩增模板（比如X-T)，丰度低的miRNA的扩增效率就 更高，从而减少扩增后的丰度不同的miRNA之间的浓度差距，达到提高丰度低的miRNA更容 易被检测出来的目的。
[0036] 如本发明所述的，"同一个样品"或"待测样品"并不是局限于含一种miRNA的样品， 比如对同一种细胞或组织的总RNA提取物进行检测，可以同时检测总RNA中的多种miRNA。
[0037] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述的各种待测miRNA之间，至少有1个 喊基不相同。
[0038] 本发明提供的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，先 利用待测样品中的microRNA结合到扩增模板上作为引物启动EXPAR，通过指数扩增效应， 产生大量的单链核酸片段（主要是Τ'序列），在此将Τ'序列称之为DNA目标链，这些DNA 目标链可与相应的报告探针及修饰在AuNP上的捕获探针互补结合，报告基团在金的增强 作用下可测得SERS信号。
[0039] 如本发明所述的，所述"Τ'序列"为T序列的互补序列。
[0040] 由于EXPAR的高扩增效率和SERS的信号增强效果，该发明可以检测到极微量（比 如浓度低至〇. 5fM)的microRNA，并且具有非常好的特异性，可以区分出目标microRNA及其 序列相似的miRNA。另外，该发明可同时检测出肺癌细胞中多个目标microRNA，可能应用于 癌症的临床早期诊断。
[0041] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述的扩增模板的长度为45?130bp。
[0042] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述的扩增模板的长度为70?95bp。
[0043] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述的扩增模板中，所述T序列的长度为 20 ?30bp。
[0044] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述的扩增模板中，所述X序列的长度为 20 ?25bp。
[0045] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述捕获探针的长度为10?24bp。
[0046] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述报告探针的长度为10?15bp。
[0047] 在本发明一实施例中，所述捕获探针和报告探针的解链温度都不低于室温。
[0048] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应（EXPAR)体系中， 所述待测样品为从细胞或组织中裂解的待测样品、从细胞或组织中纯化的含miRNA的总 RNA、含有miRNA的待测血清裂解液或合成的miRNA样品，但不限于此。
[0049] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应（EXPAR)体系中， 所述待测样品来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺 癌、胰腺癌、膀胱癌或甲状腺癌的细胞或组织。
[0050] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应（EXPAR)体系 中，所述待测样品中的待测miRNA为miR-205、miR-126、miR-21、let-7、miR-468、miR-4529 或miR_196a2。
[0051] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应（EXPAR)体系中， 采用的DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶大片段或VentRexo-DNA聚合酶或 Klenow片段聚合酶。
[0052] 所述Phi29DNA聚合酶为从Bacillussubtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA 聚合酶，除了具有3' 一5'核酸外切酶校读功能，还具有特殊的链置换和连续合成特性；所 述BstDNA聚合酶（大片段）是BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的一部分，具 有5' 一 3'DNA聚合酶活性，但不具有5' 一 3'核酸外切酶活性；所述VentR(ex〇_)DNA聚 合酶是一种高保真的耐热DNA聚合酶，是VentRDNA聚合酶经基因工程改造而得，去除了 3' 一 5'核酸外切酶校读活性。
[0053] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述T序列之间具有切刻内切酶的识别位 点。
[0054] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、 Nt.AlwI、Nt.BbvCI或Nt.BstNBI切刻酶。
[0055] 本发明提供的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，先 利用待测样品中的microRNA作为引物结合到扩增模板上，在聚合酶的作用下进行复制延 伸，从而形成双链，此时内切酶酶切位点产生；在切刻内切酶的不断酶切的作用下和聚合酶 的链置换复制作用下，合成新的Τ'序列片段，新合成的Τ'序列作为引物结合到扩增模板 上，进入下一轮扩增；如此诱发整个反应对Τ'序列的指数扩增。
[0056] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的温度为 37 ?60。。。
[0057] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的温度 为37?40°C，所采用的DNA聚合酶为Klenow片段聚合酶。
[0058] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的温度 为52?55 °C，所采用的DNA聚合酶为VentRexcTDNA聚合酶。
[0059] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的温度 为55?60°C，所采用的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
[0060] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的时间为 10?60分钟。
[0061] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的时间 为10?20分钟。
[0062]在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶的浓度为0. 02?0. 24U/μ1。
[0063] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用 的DNA聚合酶的浓度为0. 03?0. 08U/μ1。
[0064]在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶的浓度为0. 06U/μ1。
[0065] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的切 刻内切酶的浓度为〇. 1?〇. 7U/μ 1。
[0066] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用 的切刻内切酶的浓度为〇. 2?0. 6U/μ 1。
[0067] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的切 刻内切酶的浓度为〇. 5υ/μ1。
[0068] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的扩 增模板的浓度为50?400ηΜ。
[0069] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用 的扩增模板的浓度为50?250ηΜ。
[0070] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的扩 增模板的浓度为150ηΜ。
[0071] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述的"采用巯基修饰的捕获探针对所述 金属纳米颗粒进行标记"时，每个金属纳米颗粒采用1000?3000倍的捕获探针进行标记， 其中，所述金属纳米颗粒的大小为52?70nm。。
[0072] 本领域技术人员可根据所采用的金属纳米颗粒的大小调整捕获探针的用量。
[0073] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒的大小为12?100nm。
[0074] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为金，大小为50? 70nm〇
[0075] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为金，大小为52? 60nm〇
[0076] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为金，大小为 63nm〇
[0077] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为银，大小为80? IOOnm0
[0078] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒的大小为12?60nm。
[0079] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒的大小为56nm。
[0080] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为贵金属纳米颗粒，所 述贵金属包括金（Au)、银（Ag)或铜（Cu),但不限于此。
[0081] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒可以采用硼氢化钠、柠 檬酸钠或抗坏血酸还原制备。
[0082] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒，所 述金纳米颗粒分别采用檬酸钠、盐酸羟胺进行分步还原方法制得。
[0083] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)中，所述巯基修饰在捕获探针的3'端或5'端。
[0084] 本发明所述步骤（2)中，所述巯基修饰的捕获探针能通过巯基吸附金属，从而标 记在金属纳米颗粒表面。
[0085] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述报告分子为染料分子，所述染料分子 包括罗丹明类（如：四甲基罗丹明TAMRA或罗丹明6GR6G)、3H-吲哚菁类（如：cy3或cy5)、 FAM、TET、HEX、R0X、异硫氰酸荧光素（FITC)、YakimaYellow或氟化硼二吡咯（BODIPY)，但 不限于此。
[0086] 在本发明一实施例中，所述步骤（4)中，所述反应液中，所述捕获探针和所述报告 探针的摩尔数比为1?3:1。
[0087] 在本发明一实施例中，所述步骤（4)中，所述反应液中，所述捕获探针和所述报告 探针的终浓度分别为〇. 5?3μM。
[0088] 在本发明一实施例中，所述步骤（4)中，所述反应液自然冷却到室温所用的时间 为40?60分钟。
[0089] 本发明实施例步骤（4)可以根据对应的待测分子的信号及强度选择匹配的激光 器以及功率、光谱收集时间，比如，可以选择633, 532, 785nm激光器，功率分别选择17, 50， IOOmW,时间为零点几秒到十几分钟，但不限于此。
[0090] 第二方面，本发明提供了如第一方面所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光 谱检测的miRNA检测方法在制备miRNA检测试剂盒中的应用。
[0091] 本发明提供了基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及 应用具有如下有益效果：
[0092] (1)本发明提供的miRNA检测方法灵敏度高，其结合了EXPAR的高扩增效率和 SERS的信号增强效果，检测限达到0. 5fM;
[0093] (2)本发明提供的miRNA检测方法特异性好，可以区分出目标miRNA及其一个碱基 错配序列和相似序列；
[0094](3)检测实际样品量少，费时较少，成本较低；比如，本发明一优选实施例中，仅需 1μg总RNA待测样品；EXPAR反应仅需20min，DNA杂交需Ih;EXPAR扩增反应不需要精确 的热循环仪器。
【专利附图】
【附图说明】
[0095]图1为本发明实施例提供的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA 检测方法的示意图；
[0096] 图2为本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS检测可行性分析的结果；包括图A?C，其中，图A为miR-205启动的EXPAR的实时监测结果；图B为PAGE胶分析EXPAR扩 增产物的结果；图C为SERS对EXPAR扩增产物的检测结果。
[0097] 图3为本发明实施例提供的EXPAR扩增条件的优化的结果；包括图A?D，其中， 图A为Vent(exo_)DNA聚合酶浓度对EXPAR扩增的影响；图B为Nt.BstNBI切口酶浓度对 EXPAR扩增的影响；图C和D为扩增模板浓度对EXPAR扩增的影响。
[0098] 图4为本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS方法检测microRNA的灵敏度评 价的结果；包括图A?B，其中，图A为SERS信号随着miR-205浓度变化的结果；图B为 1651CHT1处的拉曼峰强度与miRNA浓度的函数关系。
[0099] 图5为本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS方法检测microRNA的可重复性的 实验结果。
[0100] 图6为本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS方法检测microRNA的特异性评价 的结果。
[0101] 图7为本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS方法检测microRNA的普遍性评 价的结果；包括图A?B，其中，图A为反应检测出的SERS信号的结果；图B为1590CHT1和 1651cm-1处的SERS强度分析结果。
[0102] 图8?9本发明实施例提供的基于EXPAR的SERS方法检测实际样品的结果。
【具体实施方式】
[0103] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0104] 本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品；本发明涉及的 英文说明：υ/μ1 :单位每微升；mmol/L:毫摩尔每升；μπι〇1/1(μΜ):微摩尔每升；nmol/ L(nM):纳摩尔每升；pmol/L(pM)皮摩尔每升；fmol/L(fM)fmol/L;yg/mL:微克每毫升； dNTPs:四种脱氧核糖核苷酸。
[0105] 表1中的microRNAs和DNA寡核苷酸由大连宝生物公司合成；dNTPs、RNA酶抑制 剂andDEPC水购自大连宝生物公司；Vent(exo_)DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻酶购自New EnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA);其他试剂均为市售商品。
[0106]本发明实施例米用LabRAMHRRamanSpectrometer(H0RIBAJobin-Yvon,France) 检测报告基团的SERS光谱。
[0107] 表1.合成序列
[0108]
[
【权利要求】
1. 一种基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法，其特征在于， 包括如下步骤： 1) 提供或配置恒温指数扩增反应体系，扩增待测miRNA，通过恒温指数扩增反应扩增 待测miRNA，得到扩增产物，其中，所述恒温指数扩增反应体系中包括待测样品和扩增模 板； 2) 制备金属纳米颗粒，然后采用巯基修饰的捕获探针对所述金属纳米颗粒进行标记， 得到捕获探针-金属纳米颗粒复合物； 3) 提供报告分子修饰的报告探针； 4) 将步骤（1)所得的扩增产物、步骤（2)所得的捕获探针-金属纳米颗粒复合物、以及 步骤（3)所述的报告探针进行混合，得到反应液，所述反应液在55?95°C下孵育2?10分 钟后，自然冷却到室温，离心、洗涤、去上清，再将沉淀转移到硅片上，自然晾干后进行SERS 检测； 其中，步骤（1)所述的扩增模板、步骤（2)所述的捕获探针、步骤（3)所述的报告探针 均为单链脱氧核糖核苷酸，所述捕获探针和报告探针互不相同，且不互补； 所述步骤（1)中，所述扩增模板包括X序列和T序列，所述X序列和T序列之间具有切 刻内切酶的识别序列；所述X序列与待测miRNA互补，所述T序列包括C序列和R序列，所 述C序列为捕获探针的核苷酸序列，所述R序列为报告探针的序列。
2. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测 方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶为 Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段、VentR excTDNA聚合酶或Klenow片段聚合酶。
3. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测 方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI、 Nt. BbvCI 或 Nt. BstNBI 切刻酶。
4. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方 法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应采用的时间为10?60分钟。
5. 权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法， 其特征在于，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的DNA聚合酶的浓度为 0·03 ?0· 08U/ul。
6. 如权利要求1所述基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法， 其特征在于，所述步骤（1)中，所述恒温指数扩增反应体系中，采用的切刻内切酶的浓度为 0· 2 ?0· 6U/ul。
7. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方 法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述扩增模板中的T序列至少重复1次。
8. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方 法，其特征在于，所述步骤（2)中，所述金属纳米颗粒的大小为12?100nm。
9. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方 法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述报告分子为染料分子。
10. 如权利要求1所述的基于恒温指数扩增与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方 法在制备miRNA检测试剂盒中的应用。
【文档编号】G01N21/65GK104278088SQ201410491409
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】张春阳, 叶丽平, 胡娟 申请人:深圳先进技术研究院