人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了四种胰高血糖素样肽-1，公开了能够识别上述四种多肽的单克隆，公开了能识别上述四种多肽的多克隆抗体，本发明还公开了一种检测血清、或者血浆GLP-1总含量的ELISA试剂盒，包括有生物活性的GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-37)和GLP-1(9-36)NH2肽、四种肽链BSA融合蛋白、能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记多克隆抗体。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效检测GLP-1缺乏相关性疾病的有效工具。CCTCC NO ：C20141082014.07.01
【专利说明】人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种多肽及其单克隆、多克隆抗体和试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 2010年的统计资料显示中国现有成人糖尿病患者达9240万（发病率10% )，更 令人担忧的是还有巨大数量的成人糖耐量受损者（Impaired glucose tolerance, IGT)。如 何更有效地预防糖尿病，特别是2型糖尿病（type2diabetets mellitus，T2DM)发生、有效 地控制病情发展、减少并发症的发生，已经成为全民族共同关注的焦点之一。
[0003] 胰岛α细胞分泌胰高血糖素、β细胞分泌胰岛素，两者作用互为相反，在维持机 体血糖浓度中起至关重要作用。在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰 高血糖素，而在肠粘膜的L细胞中，胰高血糖素原基因表达的产物经前激素转换酶剪切， 其中羧基端的段肽链即为胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)。GLP-1 有2种生物活性形式，分别为61^-1(7-37)和61^-1(7-36)順2,61^-1约80%的循环活性 来自GLP-l(7-36)。生物活性GLP-1在体内被二肽酶（DPP-IV)、中性肽链内切酶（NEP)降 解成无活性的GLP-1 (9-37)和GLP-1 (9-36)NH2,半衰期极短仅2min。
[0004] 研究已证实，GLP-1以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减 少胰岛胰高血糖素分泌从而降低血糖。正常人在进餐后，GLP-1开始分泌，进而促进胰岛 素分泌，以减少餐后血糖的波动。但对于T2DM患者，其"肠促胰素效应"受损，主要表现 为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减小，但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用 并无明显受损。动物实验和临床研究已经证明GLP-1可通过多种机制明显地改善T2DM动 物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量的 作用尤为显著，这为T2DM的治疗提供了一个非常好的前景。同时GLP-1的这种葡萄糖浓 度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治 疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。此外，动物和临床研究显示，一些治疗措 施，如胃转流术治疗非肥胖型糖尿病、胃部分切除术治疗肥胖症以及中医药治疗糖尿病等， 均能通过调节循环GLP-1水平来达达到治疗目的，同时通过监测治疗前后外周血中GLP-1 水平来指导、调整治疗方案。
[0005] 近年来，多个制药企业，如美国的礼来公司、默克公司、百时美施贵宝公司，瑞士罗 氏制药等均在研制GLP-1相关药物，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入 市场，表明GLP-1在不久的将来必定成为IGT、T2DM的常用治疗药物之一。
[0006] 在GLP-1作为新的治疗方法应用于临床之前，必须完成一个重要的基础工作，那 就是要建立快速、准确的测定方法判断患者体内是否真正存在GLP-1分泌不足！准确地监 测GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及不同个体用药剂量等均是必不 可少的前提，此外检测方法的建立也是进一步研究GLP-1在IGT、T2DM、代谢综合征等GLP-1 缺乏相关性疾病的发病机制及早期预防研究的实验基础。目前在国内定量检测患者血液中 总GLP-1含量的ELISA试剂盒尚未见报道。
【发明内容】
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[0007] 本发明的目的在于提供一种人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒，所述的这种 人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒要解决现有技术中没有合适的检测患者血液中总 GLP-1含量的ELISA试剂盒的技术问题。
[0008] 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
[0009] GLP-1(7-37):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG
[0010] 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
[0011] GLP-1(7-36):HAEGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR
[0012] 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
[0013] GLP-1(9-37):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGRG
[0014] 一种人源性GLP-1肽链，氨基酸序列如下：
[0015] GLP-1(9-36):EGTFTSDVSSTLEGQAAKEFIAWLVKGR
[0016] 本发明还提供了一种单克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4 所述的多肽。
[0017] 本发明还提供了一种多克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4 所述的多肽，并由HRP标记。
[0018] 进一步的，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO :C2014108的杂交瘤细胞株 所分泌的。
[0019] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO :C2014108。
[0020] 本发明提供了一种试剂盒，含有权利要求1?4所述的多肽、或者权利要求5所述 的单克隆抗体、或者权利要求6所述的多克隆抗体。
[0021] 进一步的，所述的试剂盒用于检测血清、或者血浆中的生物活性和失活的GLP-1 总含量。
[0022] 本发明还提供了一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方 法，包括如下步骤：
[0023] 1) -个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCC NO :C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀释，加于微孔板中，每 孔l〇〇ul，置2?5°C冰箱中，20?50小时后取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干，于微孔板 中加入0. 5% BSA-PBS，每孔100ul，置30?40°C水浴中1?3小时，取出，用蒸馏水冲洗 2?6次，拍干；
[0024] 2) -个配置标准液的步骤，先配置缓冲液，所述的缓冲液为0. 5 % BSA-0. 05% TWeen20-PBS，然后取合成肽抗原GLP-1 (9-36)NH2,用缓冲液配，配制成74. 5uM的溶液冷冻 保存；
[0025] 3)取上述GLP-l(9-36)融合蛋白（74. 5umol/L)用封闭液封闭，每孔100ul，置 30?40°C水浴中1?3小时，取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干；
[0026] 4)力卩入 HRP-标记兔抗 GLP-1 抗体，用 ρΗ7· 2,0· 5 % BSA-0. 05 % Tween20-0. 15molPBS作1:1500稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2?5°C冰箱中，20? 50小时后取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干；
[0027] 5)加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色；
[0028] 6)使用主波长492nm，付波长640nm比色；
[0029] 7)每个96孔酶标板均设0?2980nmol/L标准曲线和空白孔，以吸光度为横坐标， 以浓度为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本的吸光度值在标准曲线上查出该样本GLP-1 的浓度。
[0030] 本发明提供的单克隆、多克隆抗体，可用于建立其它的免疫检测方法测定人源性 GLP-1总含量，如胶体金快速检测、免疫比浊法等。
[0031] 本发明的一种杂交瘤细胞株，其分类命名为：杂交瘤细胞株2D11-2,该细胞株保 藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)中，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武 汉市武汉大学（武汉市武昌珞珈山），保藏日期为2014年7月1日，保藏号为CCTCC N0: C2014108。
[0032] 本发明提供的ELISA试剂盒，测定血清中GLP-1线性范围为1490nmol/L? 23. 5nmol/L，分析灵敏度为23. 5nmol/L。经过初步临床检测分析，健康成人空腹血清总 GLP-1参考范围为79. 5±39. 7nmol/L。IGT和T2DM患者空腹血清总GLP-1含量高于糖耐量 正常组，在餐后1小时糖耐量正常组血清总GLP-1水平显著升高，2h恢复至空腹水平。但是 在IGT和T2DM患者血清中，餐后lh GLP-1不升反而显著降低，2h接近空腹水平。初步临床 检测结果证实本发明不仅提供了辅助IGT和T2DM等早期诊断的血液学指标，而且为GLP-1 类生物制剂临床应用提供了必要的监测指标。也为一些治疗糖尿病、肥胖症的其它疗法提 供了疗效检测指标。此外除了 IGT和T2DM，最近有研究报道代谢综合征、冠心病、阿尔茨海 默病（Alzheimer's disease, AD)均与GLP-1分泌异常有关，本发明提供的各种GLP-1多肽 及其抗体、ELISA试剂盒均在相关疾病发病机制、防治研究中起重要作用。
[0033] 本发明是针对2型糖尿病（T2DM)患者的这种"肠促胰素效应"受损，以及人工合 成GLP-1制剂能促进胰岛β细胞再生和修复、有效改善T2DM动物模型或患者的血糖情况， 建立血液中GLP-1总含量ELISA检测方法。检测结果发现IGT、T2DM患者空腹GLP-1总体 水平较正常人偏高，但餐后GLP-1分泌显著不足。GLP-1总含量ELISA定量检测试剂盒的建 立将在IGT、T2DM等GLP-1分泌异常相关性疾病的早期诊断、治疗及疗效监测领域发挥重要 作用。
[0034] 本发明提供的四种人源性GLP-1肽链及其单克隆、多克隆抗体和定量ELISA试剂 盒，为临床提供快速、稳定、可靠的GLP-1缺乏相关性疾病的诊断、治疗及疗效检测的有效 工具。
【专利附图】
【附图说明】：
[0035] 图1是GLP-1总含量ELISA检测标准曲线。
[0036] 图2是正常体检者血清总GLP-1含量分布。
【具体实施方式】：
[0037] 实施例1设计和合成人源性生物活性和无活性GLP-1多肽
[0038] 按照NCBI官方网站上发布的人生物活性、无活性GLP-1氨基酸序列，进行人工生 物合成、纯化（图1合成肽链的氨基酸序列）。
[0039] 实施例2 GLP-1多肽及其单克隆及多克隆抗体特征
[0040] 制备生物合成GLP-1的7-37、7-36、9-37、9-36多肽与BSA融合蛋白。采用 GLP-1 (9-36)NH2融合蛋白，用加强免疫法免疫家兔制备多克隆抗体，并标记辣根过氧化物 酶。采用杂交瘤细胞融合技术，制备GLP-1 (9-36)NH2单克隆抗体。
[0041] 表1鉴定兔抗GLP-1 (9-36) NH2融合蛋白多克隆抗体与GLP-1的7-37、7-36、 9-37、9-36多肽BSA融合蛋白抗原的反应性（反应滴度），抗血清经三倍系列稀释后与多 肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中 的吸光度（0D)和梯度曲线，以证实所制备的兔抗GLP-1 (9-36)NH2多克隆抗体能够识别 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)、GLP-1 (9-37)、GLP-1 (9-36)抗原肽，并有较高的效价。
[0042] 以GLP-1 (9-36)NH2为抗原制备的单克隆抗体，再采用GLP-1 (7-37)、 GLP-1 (7-36)、GLP-1 (9-37)抗原肽分别同时筛选。表2显示所筛选到的单克隆抗体 (2D11-2)，与各GLP-1抗原肽融合蛋白反应曲线，表明所筛选到的鼠抗GLP-1 (9-36) NH2融 合蛋白单克隆抗体同样识别其它GLP-1多肽BSA融合蛋白，效价相近。将该杂交瘤细胞株 (2D11-2)进行克隆扩大培养后，送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏号为 CCTCC NO :C2014108 ;
[0043] 在分析GLP-1多克隆抗体与抗原反应特性实验中，通过棋盘法初步筛选确定 GLP-1的四个抗原肽融合蛋白均以250nmol/L浓度、100ul/孔包被ELISA板，室温过夜，反 应板封闭后，将不同稀释度抗血清l〇〇ul/well加入反应孔内，室温1小时后洗涤三次，再加 lOOul/well以1:2000稀释HRP偶联的羊抗兔IgG，室温1小时后再洗涤四次，加 HRP底物 溶液（TMB和过氧化氢）并显色10分钟，读取0D492/640nm值。GLP-1单克隆抗体筛选方法 同上，酶标记的显色抗体换成HRP偶联的羊抗鼠 IgG。
[0044] 表1.兔抗GLP-1多克隆抗体与GLP-1抗原肽反应特性
[0045]
【权利要求】
1. 一种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。
4. 一种人源性GLP-1肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
5. -种单克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽。
6. -种多克隆抗体，其特征在于：能够识别权利要求1、2、3、或者4所述的多肽，并由 HRP标记。
7. 如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为CCTCC NO : C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的。
8. -种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO :C2014108。
9. 一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求Γ4所述的多肽、或者权利要求5所述的单 克隆抗体、或者权利要求6所述的多克隆抗体。
10. 如权利要求9所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒用于检测血清、或者 血浆中的生物活性和失活的GLP-1总含量。
11. 一种采用ELISA的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，其特征在于包括 如下步骤： 1) 一个制备反应板的步骤，在所述的制备反应板的步骤中，采用保藏号为CCTCC NO : C2014108的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液作1:1000稀释，加于微孔板中，每 孔lOOul，置2?5°C冰箱中，2(Γ50小时后取出，用蒸馏水冲洗2飞次，拍干，于微孔板中加入 0. 5% BSA-PBS，每孔100ul，置3(T40°C水浴中1?3小时，取出，用蒸馏水冲洗2?6次，拍干； 2) -个配置标准液的步骤，先配置缓冲液，所述的缓冲液为0. 5%BSA-0. 05%Tween20 -PBS，然后取合成肽抗原GLP-1 (9-36) NH2,用缓冲液配，配制成74. 5uM的溶液冷冻保存； 3) 取上述GLP-l(9-36)融合蛋白74. 5umol/L用封闭液封闭，每孔100 ul，置3(T40°C 水浴中Γ3小时，取出，用蒸馏水冲洗2飞次，拍干； 4) 加入 HRP-标记兔抗 GLP-1 抗体，用 ρΗ7· 2,0· 5% BSA-0. 05% Tween 20-0. 15molPBS 作1:1500稀释，加于微孔板中，每孔100ul，置2~5°C冰箱中，2(Γ50小时后取出，用蒸馏水冲 洗2?6次，拍干； 5) 加邻苯二胺底物显色，室温15分钟，用2mol硫酸终止显色； 6 )使用主波长492nm，付波长640nm比色； 7)每个96孔酶标板均设0?2980nmol/L标准曲线和空白孔，以吸光度为横坐标，以浓 度为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本的吸光度值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓 度。
【文档编号】G01N33/543GK104267194SQ201410489841
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】范列英, 刘颖冰 申请人:上海市东方医院