生物标记用于制备心脏衰竭诊断组合物的用途及诊断装置制造方法

生物标记用于制备心脏衰竭诊断组合物的用途及诊断装置制造方法
【专利摘要】本发明提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于评估个体的心脏衰竭可能性；再者，本发明进一步根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏学会的A、B、C及D期或心脏衰竭的预后分类为死亡或再住院，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。再者，本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的装置。相较于BNP与传统生物标记，本发明通过使用代谢组学分析而辨识出新的生物标记，由此提供心脏衰竭患者更好的诊断值与预后值。
【专利说明】生物标记用于制备心脏衰竭诊断组合物的用途及诊断装置

【技术领域】
[0001] 本发明关于个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途以及含有该 生物标记的诊断装置。

【背景技术】
[0002] 心脏衰竭（heartfailure)是多种心血管疾病发展到最后阶段所呈现的一个临床 综合征。在过去数十年来，对于基础病理生理学与血液动力学的了解以及新颖药物与侵入 性治疗的发展已有大幅的进步。尽管如此，短期及长期与心脏衰竭相关的再住院率与死亡 率仍高，且需大量的健康照护资源。现有的治疗策略在心脏衰竭晚期的效果有限，迫切需要 新的介入性措施以降低在亚临床（sub-clinical)阶段时的不当分子进程，以避免心脏衰 竭病程进展到下一阶段。
[0003] 多种用于心脏衰竭的生物标记已被证实。B型利尿胜肽（B-typenatriuretic p印tide，BNP)及其N端片段已成为临床上有用于诊断心脏衰竭及预后的生物标记。最近的 研究显示，利尿胜肽亦提供无明显症状的具有中度风险的心血管疾病个人的预后。不幸的 是，此等生物标记无法对用于侵入性治疗的分子标靶提供额外资讯。此外，单一生物标记的 应用可能不足以用来评估心脏衰竭患者，需通过多种分子的组合以获得补偿。
[0004] 根据目前对心血管风险因子的认知，大部分心脏衰竭患者的病因仍无法解释。不 论何种异质病因，心脏衰竭的发展与心脏不能满足身体的代谢需求息息相关。整体代谢作 用中伴随的变化对于心脏衰竭特定性代谢组（metabolome)的临床应用（诊断与预后目 的）具有暗示性。目前心脏衰竭期别的评估并非根据致病机制，而是根据源自于美国心 脏病学会与美国心脏协会（AmericanCollegeofCardiologyandtheAmericanHeart Association，ACC/AHA)的共识。ACC/AHA将心脏衰竭分类成四个期别，举例而言，A期为尚 未发生心脏结构性病变，但具有罹患心脏衰竭的风险者（如具有冠心病但未出现梗塞的糖 尿患者者）期为具有心脏结构性病变（即心输出量下降、左心室肥大及心室心房扩张）， 但未发生任何心脏衰竭症状的个人；C期指发展出临床心脏衰竭的患者；D期指具有难治性 心脏衰竭且需使用进阶侵入性治疗（例如：双心室心律调节器、左心室辅助装置或移植）的 患者。
[0005] 除了ACC/AHA所定义的心脏衰竭期别，尚有依心脏衰竭功能状态所定义的其他分 类方式，称之为纽约心脏学会功能分类（I级至IV级），此分类涉及每日活动的症状与患者 的生活品质。I级：体能活动不受限制，普通体能活动不会造成过度疲劳、心悸或呼吸困难 (呼吸短促）；11级：体能活动稍受限制，静止时感到舒适，但普通体能活动会造成过度疲 劳、心悸或呼吸困难；III级：体能活动受到明显限制，静止时感到舒适，但少量的普通活动 就会造成过度疲劳、心悸或呼吸困难；IV级：无法进行任何体能活动而不发生不适，静止时 感到心功能不全，若进行任何体能活动则不适感会增加。
[0006] 发展多种生物标记的高产出量及潜力所带来的优势在于代谢组学为辨识代谢特 征的平台，该代谢特征与前心脏衰竭阶段至进阶心脏衰竭阶段的亚型（subtype)相关，且 独立于既定的传统风险因子所形成的限制。彻底了解心脏衰竭中波动的代谢作用，并配合 营养基因体学的研究进展，将有潜力发展出个人化的预防措施。
[0007] US2012/0286157A1揭露一种于个体中诊断心脏衰竭的方法，其中，该方法包括从 个体的样本中测定至少一种生物标记的量，该生物标记诸如甘露糖（mannose)、次黄嘌呤 (hypoxanthine)、谷氨酸盐（glutamate)、尿酸（uricacid)、天冬氨酸盐（aspartate)等。 此外，该专利也揭露该方法可用于辨识个体是否需要治疗心脏衰竭，或测定心脏衰竭疗程 是否成功。
[0008] 虽然几种生物标记（如甘露糖、次黄嘌呤、天冬氨酸盐）已被用于诊断心脏衰竭， 仍有医疗上的需求以寻找更具灵敏性及专一性的生物标记，以用于诊断心脏衰竭（特别是 在心脏衰竭早期阶段）及评估心脏衰竭预后。
[0009] 为了诊断心脏衰竭及评估心脏衰竭预后，本发明的目的用来测定代谢组学分析的 临床应用及重要性，以及探究心脏衰竭患者的复杂的整体代谢波动，且在不同心脏衰竭期 别或在侵入性治疗后复原阶段中提供灵敏评估。


【发明内容】

[0010] 有鉴于现有技术中的缺陷，本发明提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备 诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于评估个体的心脏衰竭可能性，其中，该生物标记选 自黄噪呤（xanthine)、亚精胺（spermidine)、丙酰肉碱（propionylcarnitine)、丁酰肉碱 (butyrylcarnitine)及对硫甲酚（p-cresylsulfate)所组成组的至少一种。
[0011] 于本发明的一具体实施例中，该生物样本选自血液、血浆、血清及尿液所组成组的 至少一种。
[0012] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0013] 于本发明的一具体实施例中，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的 至少一种。
[0014] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括次黄噪呤（hypoxanthine)。
[0015] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine)〇
[0016] 于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34:4、酰 基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36: 3、二酰基磷 脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C32: 3、二酰基磷脂酰胆碱C40: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及 二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
[0017] 于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
[0018] 本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途， 所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏 学会的A、B、C及D期，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺及丙酰肉碱所组成组的至少一 种。
[0019] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0020] 于本发明的一具体实施例中，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的 至少一种。
[0021] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。
[0022] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。
[0023] 于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34:4、酰 基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、 二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36: 3、二酰基磷 脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱C40: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及 二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
[0024] 于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
[0025] 本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途， 所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭预后分类为死亡 或再住院，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一 种。
[0026] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0027] 于本发明的一具体实施例中，该氨基酸为必需氨基酸。
[0028] 于本发明的一具体实施例中，该必需氨基酸选自组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸所组成组的至少一种。
[0029] 于本发明的一具体实施例中，该必需氨基酸较佳选自亮氨酸、苏氨酸及色氨酸所 组成组的至少一种。
[0030] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括二甲基精氨酸 (dimethylarginine)、及二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
[0031] 于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括对称性二甲基精氨酸、及对 称性二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
[0032] 本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的诊断装置，其包括：检测器，用于检测 选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫甲酚及其组合所组成组的生物标记。
[0033] 于本发明的若干具体实施例中，代谢组学技术（metabonomics/metabolomics technology)可使用多变量统计技术（multivariatestatisticaltechniques)来分析高 度复杂的数据组，该数据组产生自高产出量光谱，如核磁共振（NMR)光谱及质谱（MS)。于本 发明的若干具体实施例中，可结合使用不同种类的光谱平台，如气相色谱_质谱法（GC-MS) 及液相色谱-质谱法（LC-MS)，其可带来补充分析结果的优势，因此可提供扩大的用以解释 与病理生理条件相关的生物性变异的代谢"窗（window)"。于本发明的某些具体实施例中， 辨识可用以说明具有心脏衰竭的患者及健康者的代谢物谱型（metaboliteprofile)间差异 的代谢物，能够显示该疾病的重要基本分子机制。
[0034] 于本发明的若干具体实施例中，分析方法可包括气相色谱法与质谱法。举例 而言，根据本发明的一具体实施例，该分析方法可包括气相色谱-飞行时间质谱法（gas chromatography-time-of-flightmassspectrometry,GC-T0FMS)及超效液相色谱-四 偶极-飞行时间质谱法(ultra-performanceliquidchromatography-quadrupoIe time-〇f-flightmassspectrometry,UPLC-QT0FMS)。于某些具体实施例中，可使用超过一 种分析方法以于患者样本中获得有关代谢物的数据。于若干具体实施例中，可将一种或多 种分析方法与多变数统计技术（multivariatestatisticaltechniques) -起使用，藉此 判定患者样本中的代谢物谱型。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 图1显示针对心脏衰竭的全代谢组学的诊断数值。收集来自不同心脏衰竭期别（A 期、B期及C期）患者及正常者的血浆样本，通过LC-MS/MS测定该样本的全代谢物浓度。图 1中，（A)正交投影潜在结构判别分析（OPLS-DA)得分图（scoreplot)显示正常对照组与 A期及C期的心脏衰竭患者间有明显的区别。为了区分正常对照组与C期患者，使用所有 全代谢组学数据组并计算出全代谢组学衍生参数，称之为t[l](如X轴所示）；为了区分正 常对照组与A期患者，使用所有全代谢组学数据组并计算出另一全代谢组学衍生参数，称 之为t[0](如y轴所示）。于t[l]标尺中，A期患者的集聚区相似于正常对照组，然而相较 于正常对照组于t[0]标尺上向上位移。（B)依同样的全代谢组学衍生参数计算方式，计算 出B期患者的t[l]与t[0]值。B期患者的得分图广布的区域位于A期、C期及正常对照组 间。
[0036] 图2显示心脏衰竭（HF)致病机制相关的代谢途径，辨别HF患者中尿素（urea) 循环（a)、生物蝶呤（biopterin)循环（b)、甲硫腺苷（methylthioadenosine，MTA)循环 (c)、甲硫氨酸循环（d)、鸟氨酸-脯氨酸-谷氨酸（e)、多胺（polyamine)合成（f)、多巴 胺（dopamine)合成（g)、甲基化（肌酸酐（creatinine)及磷脂酰胆碱）（h)、转硫化反应 (transsulfuration)(牛磺酸（taurine)) (i)、对硫甲酚合成（j)及噪呤（purine)代谢（k) 的变异。在HF患者中，代谢物（实线框）显著增加、代谢物（虚线框）显著减少、代谢物 (黑色）不变，而代谢物（灰色）则未检测。
[0037] 图3显示于急性心脏衰竭后的一系列追踪，BNP及tPS[l]数值示于32个患者中， 该些患者存活超过12个月，且于12个月结束时显著改善成纽约心脏学会功能分类级别I。N 表示正常对照组；M0、M6及M12分别表示出院前及出院后6个月与12个月的数值；tPS[l]: 根据四种代谢物（组氨酸、苯丙氨酸、亚精胺及次黄嘌呤）的组合所产生的参数，称之为 tPS[l]。
[0038] 图4显示BNP与一些目标代谢物及目标代谢物组合的诊断值。该ROC曲线是通过 B型利尿胜肽（B-typenatriureticpeptide、BNP)、t[2]及tPS[2]显示C期心脏衰竭的 诊断（相较于正常对照组）。t[2]:衍生自计算所有目标代谢物的参数；tPS[2]:根据四种 代谢物（组氨酸、苯丙氨酸、亚精胺及二酰基磷脂酰胆碱C34:4)的组合所产生的参数，称之 为tPS[2]。
[0039] 图5显示代谢组学的预后值。图5中，（A)该ROC曲线用以比较B型利尿胜肽 (BNP)、t[2]、tPS[2]及tPS[3]的预后值。⑶及（C)分别表示tPS[3]与BNP的卡本-麦 尔曲线（Kaplan-Meiercurve),用以预测所有案例的全因死亡（all-causedeath)与心脏 衰竭相关的再住院率的组合事件。tPS[3]:根据四种代谢物（二甲基精氨酸/精氨酸的比 率、亚精胺、丁酰肉碱及必需氨基酸总量）的组合所产生的参数，称之为tPS[3]。

【具体实施方式】
[0040] 以下特定的实施例用以例示本发明，本发明所属的【技术领域】人员可以轻易确信本 发明的其他优点及效果。本发明能以经制订的不同特定案例或应用来实施，说明的细节亦 能根据不同观点及应用而做出多种修改或变化，且不悖离本发明的范围及精神。
[0041] 尚需注意的是，本文中，除非特别表示或明确意指为单数，单数形式的术语"一 (a，an)"、"该（the)"须解释为亦涵盖复数。除非内文清楚指明，否则术语"或"可与术语 "及/或"互相取代。
[0042] 本文中，术语"个体"或"个人"可为动物，举例而言，该个体或个人可为哺乳动物， 再者，该个体或个人可为人类。该个体或个人可为男性或女性，该个体或个人亦可为患者， 其中，该患者为正进行牙科或医疗照护者，及/或为了失调或疾病而积极寻求医疗照护者。 [0043] 本文中者，术语"健康"意指不具有心脏衰竭或其他相关失调的个人。
[0044] 本文中，术语"代谢作用"意指发生于有机活体内的一套化学反应，用以维持生命。 代谢作用通常可分为两种类别：分解代谢与合成代谢。分解代谢为分解有机物质的一套化 学反应（例如从细胞呼吸作用中取得能量）；合成代谢为消耗能量来建构细胞组成物的一 套化学反应（例如蛋白质合成与核苷酸合成）。
[0045] 本文中，术语"生物标记"意指为分子种类，该分子种类作为过程、事件或状态（例 如：老化、疾病或曝露于有毒物质）的独特生物性或生物衍生性指标（例如：体内生化代谢 物）。
[0046] 本文中者，术语"代谢物"意指代谢作用的中间产物或产物。该术语"代谢物"一般 限制为小分子。"初级代谢物"为直接参与正常生长、发育及生殖的代谢物（例如：乙醇）； "次级代谢物"为未直接参与上述过程的代谢物，但其通常具有重要的生态功能（例如：抗 生素及色素）。有些抗生素使用初级代谢物作为前体，例如自初级代谢物色氨酸所产生的放 射菌霉素（actinomycin)。然而，为了本发明的目的，该术语"代谢物"意指参与在代谢途径 中的小分子（< 1000道尔顿（Dalton))中间产物及产物，该代谢途径如糖解作用、柠檬酸 (TCA)循环、氨基酸合成及脂肪酸代谢作用等等。
[0047] 本文中者，术语"代谢组学（metabolomics或metabonomics) "意指代谢物 谱型的系统研究，该代谢物谱型是在一给定条件下的生物系统的生物过程。"代谢组 (metabolome) "意指一组完整的小分子代谢物（如代谢中间产物、激素及其他讯号分子，以 及次级代谢物），该小分子代谢物于生物样本（如生物细胞、组织、器官或有机体）中被发现 且为细胞过程的最终产物。代谢组学为可提供由上至下、全面性及无偏执（unbiased)资讯 的技术平台。现有两种代谢组学方法：全面性代谢组学及目标代谢组学。
[0048] 本文中，术语"代谢物谱型"或"代谢物生物标记谱型"意指代谢物概况，其在健康 的个体中，相较于不健康的个体（如具有心脏衰竭个体）或在疾病的不同状态（如疾病的 不同阶段），会测定出不同含量（如增加或减少）。
[0049]本文中，术语"心脏衰竭（HF) "意指心脏功能受损的情况，导致心脏无法以足够的 速率或足够的量输送血液。心脏衰竭可为收缩期受损，造成心脏输出血液的量显著下降，因 而降低血流量。因此，收缩期心脏衰竭的特征为左心室的排出量（LVEF)显著降低，较佳地， 排出量低于50%。或者，心脏衰竭可为舒张期受损，即心室未能妥善放松，且通常伴随有心 室壁僵硬。舒张期心脏衰竭造成心室的充填不足，因而影响血液流量。因此，舒张期功能失 调亦导致舒张末期压力上升。故心脏衰竭可影响右心（肺循环）及左心（体循环）或两 者。测量心脏衰竭的技术为本领域所公知，包括超声波心动扫描仪、电生理学、血管造影，以 及血中胜肽生物标记（例如：B型利尿胜肽（B-typenatriureticpeptide,BNP)或其前肽 的N端片段）的测定。应理解心脏衰竭可持续发生或仅于某些压力或活动的情况下发生。 典型的心脏衰竭特征包括呼吸困难、胸痛、头晕、意识模糊，以及肺部及/或末梢水肿。根据 美国心脏病学会与美国心脏协会的2001指南，心脏衰竭可分为A、B、C及D期，A期：在未来 具有发展成心脏哀竭的1?风险，但未有功能或结构性心脏失调的患者；B期：具有结构性心 脏失调，但于任何时期皆无症状者；C期：在具有基本结构性心脏问题的情况下，先前或目 前有心脏衰竭症状，但以医疗处理者；D期：具有难治性心脏衰竭且需进阶侵入性治疗的患 者。
[0050]本文中，术语"全代谢物（globalmetabolite) "意指获得全面性且广泛的代谢物 谱型，其在特定条件或在不同条件的数个跨群组中，可用以比较大量的分析物。可通过分析 来自不同处理条件（如药物处理组与对照组）或不同病理生理情况（如糖尿病组与正常 组）的复制样本而获得全代谢物。为了此目的，将生物样品（细胞、血浆、尿液、唾液或病理 样品）进行分析（通过分析工具，如LC-MS)以产生数据组，随后进行单变数或多变数统计 分析。全代谢组学的目的在于辨别特征，该特征可系统性将大量的代谢物分组（种类）。
[0051]本文中，术语"目标代谢物"意指经定义的代谢物组的辨识与量化，该代谢物为结 构上已知且经标注，且根据经完整建立的生物化学途径而来。
[0052]本发明提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊 断组合物用于评估个体的心脏衰竭可能性，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉 碱、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。
[0053]根据本发明的一具体实施例，该生物样本选自血液、血浆、血清及尿液所组成组的 至少一种。
[0054]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0055]根据本发明的一具体实施例，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的 至少一种。
[0056]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。
[0057]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。
[0058]根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34:4、酰 基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、 二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36: 3、二酰基磷 脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C32: 3、二酰基磷脂酰胆碱C40: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及 二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
[0059] 根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
[0060] 根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭C期的患者中，一些与精氨酸代谢有关 的代谢物（如谷氨酰胺及瓜氨酸）的含量较低；次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、谷氨酸、脯氨酸、鸟 氨酸、精胺与亚精胺的含量则上升；芳香氨基酸（如酪氨酸及苯丙氨酸）的含量较高。此 夕卜，数种磷脂酰胆碱的含量降低，而牛磺酸的含量则增加。
[0061] 本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途， 所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏 学会的A、B、C及D期，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺及丙酰肉碱所组成组的至少一 种。
[0062]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0063]根据本发明的一具体实施例，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的 至少一种。
[0064]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。
[0065]根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。
[0066] 根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34:4、酰 基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、 二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36: 3、二酰基磷 脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38: 5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C32: 3、二酰基磷脂酰胆碱C40:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及 二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
[0067] 根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
[0068] 根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭期别（例如：A期、B期及C期）的判断上， 相较于BNP值，检验组合下列所组成组的至少二种生物标记的含量以及比对该生物标记的 参考值较为灵敏：黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、氨基酸、次黄嘌呤及磷脂酰胆碱。
[0069]本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途， 所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将所述个体心脏衰竭的预后分类为死亡 或再住院，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一 种。
[0070] 根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。
[0071] 根据本发明的一具体实施例，该氨基酸为必需氨基酸。
[0072] 根据本发明的一具体实施例，该必需氨基酸选自组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸所组成组的至少一种。
[0073] 根据本发明的一具体实施例，该必需氨基酸较佳选自亮氨酸、苏氨酸及色氨酸所 组成组的至少一种。
[0074] 根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括二甲基精氨酸 (dimethylarginine)、及二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
[0075] 根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括对称性二甲基精氨酸、及对 称性二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
[0076] 根据本发明的一具体实施例，在急性心脏衰竭后预后的状态预估中，以检验组合 四种代谢物（例如：组氨酸、苯丙氨酸、亚精胺及次黄嘌呤）的诊断值，相较于BNP，该诊断 值较为灵敏。
[0077] 根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭预后的判断上，相较于BNP值，检验组合 下列所组成组的至少二种生物标记的含量以及比对该生物标记的参考值较为灵敏：黄嘌 呤、亚精胺、丁酰肉碱、氨基酸、次黄嘌呤及磷脂酰胆碱。
[0078] 本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的诊断装置，其包括：检测器，用于检测 选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫甲酚及其组合所组成群组的生物标记。
[0079] 以下多个实施例用以例示本发明，以下所述的实施例不限制本发明的范围。
[0080] 实施例
[0081] 代谢组学分析的材料与方法
[0082] 一、患者与研究设计：
[0083] 本研究于2005年1月至2009年12月期间内招收具有B期及C期心脏衰竭患者， 于2008年5月至2009年12月，招收A期心脏衰竭患者与正常对照组。C期患者因急性心 因性肺水肿而住院的，其年龄为20至85岁，具有收缩期及舒张期心脏衰竭的患者皆包括其 中。B期患者，与其左心室的排出量（LVEF)无关，其具有后期急性心肌梗塞，且具有任何的 严重结构异常或〈40%的LVEF，但B期的患者无症状。A期患者为（1)具有冠状动脉疾病的 血管造影图像、> 50%的LVEF且无症状；或（2)具有风险因子，但无症状，亦无冠心病的血 管造影图像。正常对照组为年龄20-85岁，且无显著的全身性疾病，如高血压、糖尿病或冠 状动脉疾病，其未进行任何药物治疗，且LVEF> 60%。
[0084]排除条件包括：⑴具有全身性疾病，如甲状腺机能减退、失代偿性肝硬化(decompensatedlivercirrhosis)及全身性红斑性狼疮；（2)具有非心脏衰竭的失调，且 已妥协存活6个月；（3)卧床不起>3个月及/或无法独自站立的患者；（4)血清肌酸酐>3 毫克/分升（mg/dl)的患者；以及（5)患有严重冠状动脉疾病但未进行血管再造的患者。 从所有患者处皆获得知情同意。本研究设计及实行皆符合赫尔辛基宣言（Declarationof Helsinki)的原则，且经长庚纪念医院人体试验伦理委员会批准。
[0085] 二、血液样本与试验
[0086] 于出院前及出院后6个月与12个月，将血液样本收集于含有EDTA的管中。同 后续章节所描述的代谢组学工作流程分析血浆。以分级BNP试验（TriageBNPTest) (Biosite，SanDiego,CA)三重复测量BNP，该试验以荧光免疫分析法进行血浆BNP的定量。 其它测量，包括肾功能、血红素及C反应蛋白，于核心实验室中进行。
[0087] 三、疾病管理计划
[0088]C期患者由HF小组进行照护，该小组由三位专门从事HF照护的心脏病专家、一位 心理学家、一位膳食助理及两位个案经理所组成。
[0089] 四、后续追踪计划
[0090] 预期每个月来自医院纪录、与患者的医生进行个人沟通、电话访谈，以及患者例行 探访的医生门诊以获得后续数据。"再住院率"定义为与心脏衰竭相关的再住院率。三位心 脏病专家组成的委员会不考量患者的临床可变值而对所有的住院率进行裁定，决定何为与 心脏衰竭恶化相关的事件。将"全因死亡（all-cause)"选择作为终点（endpoint)的原因 为在患者分群中HF与其他并发症的相互关系。最严重的事件被认为于后续的期间的终点。 为了预后的目的，仅分析与HF相关的再住院率与全因死亡的复合事件。
[0091] 五、血浆代谢组分析
[0092] (1)通过LC-TOFMS分析血浆全代谢物
[0093]于50微升（ii1)血浆中添加200ii1乙腈（ACN)，将该混合物震荡30秒，超声波 震荡15分钟，接着以10,OOOXg离心25分钟，收集上清液且放入分离式玻璃管，该沉淀物 以200iU50%甲醇重新萃取。将甲醇上清液与乙腈上清液两种水性溶液收集在一起并于 氮气蒸发器中干燥，将残留物保留并储存于_80°C。为了代谢组学分析，将该残留物溶于 IOOiil95:5水/乙腈，并以14,OOOXg离心5分钟。收集澄清的上清液以进行LC-MS分 析。
[0094]使用ACQUITYTMUPLC系统（WatersCorp.，Milford,USA)且于 100 毫米 (mm)X2.ImmAcquityL7微米〇m)的C8柱上完成液相色谱分离，将该柱维持于45°C 以及流速〇. 5毫升/分钟（ml/min)。使用线性梯度：0至2. 5分钟：1至48%B;2. 5至 3分钟：48至98%B;3至4. 2分钟：98%B;4. 3至6分钟：1%B，将样本自LC柱中洗脱 (elute)，并用以重新平衡。移动相为0.1 %甲酸于水中（溶剂A)以及0.1 %甲酸于乙腈中 (溶剂B)。
[0095] 将该洗出液（eluent)导入TOGMS系统（SYNAPTGl高解析质谱仪，Waters Corp. ,Milford,USA),并于ESI正离子模式下操作，其条件如下：去溶气体（desolvation gas)设定为700公升/小时（1/h)，温度300°C;锥孔气体（conegas)设定为251/h，且 来源温度设定为80°C;毛细管电压与锥孔电压分别设定为3, 000V与35V;MCP检测器电压 设定为1，650伏特（V);数据取得率设定为0. 1秒且内扫描延迟为0. 02秒，该数据于质心 模式（centroidmode)下自20至990m/z下收集。为了取得准确的质量，磺胺二甲氧啼陡 (sulfadimethoxine)的锁定质量（lock-mass)为浓度60纳克（ng)/毫升（ng/ml)而流速 为6y1/min(ESI正离子模式下，[M+H]+离子为311. 0814Da)。
[0096]使用MassLynxV4. 1 及MarkerLynx软件（WatersCorp.，Milford,USA)处理 原始质谱数据。各质量离子的强度关于总离子数，其经标准化以产生数据矩阵（data matrix)，该数据矩阵包括滞留时间、m/z值及经标准化的峰面积。通过SMCA-P软件（版 本13. 0,UmetricsAB,Umea,瑞典）分析多变数数据矩阵，于使用帕雷托标度化（Pareto scaling)前先进行OPLS-DA模式。将SIMCA-P用于多变数数据分析与表现。
[0097] 接着将于两群组间显示显著差异的确切分子质量数据提交至数据库中搜寻，使用 内部数据库或线上数据库HMDB(http: //www.hmdb.ca/)及KEGG(http: //www.genome,jp/ kegg/)。为了鉴定特定的代谢物，在与进行谱型实验相同的条件下，将标准品进行UPLC-MS/ MS分析。于每秒0. 1质谱及大约4m/z的中型隔离视窗下收集MS/MS质谱。碰撞能设定为 自5至35V。
[0098] 根据包括KEGG与HMDB的数据库以MetaboAnalyst软件进行有潜力的生物标记的 构建、相互作用及途径分析，藉此辨识受影响的代谢途径并将其视觉化。通过大量的分析来 评估可能的生物性要素。
[0099] (2)血浆目标代谢物的定量（浓度测定）
[0100] 目标代谢物分析以AbsolutelDQ?pl80 试剂盒（BiocratesLifeScienceAG, Innsbruck，澳洲）来实施。该试剂盒用以辨识及定量184种代谢物，这些代谢物涵盖五种 代谢物种类，包括90种甘油磷脂（glycerophospholipid)与15种鞘脂（sphingolipid) (76种磷脂酰胆碱、14种溶血磷脂酰胆碱（Iysophosphatidylcholine)及15种神经鞘磷脂 (sphingomyelin))、19种生物胺、40种酰基肉碱（acylcarnitine)、19种氨基酸及六碳糖。 于96孔盘中将每10yL的血浆样本与经同位素标定的内标物混合，并在氮气流中干燥。以 5%异硫氰酸苯酯（卩1161^118〇1：11；[0073仙丨6，？11'0将氨基酸与生物胺衍生20分钟，随后于 氮气中干燥。加入300yL的萃取溶液（5mM乙酸胺于甲醇中），反应30分钟后将混合物以 IOOXg离心2分钟。随后将滤液以150iiL等分转移至微孔盘中，再以150iiL水稀释，藉此 使用LC-MS/MS进行氨基酸与生物胺分析。将残留的滤液与试剂盒的MS流动溶剂400iiL 混合，并进行流动注射分析暨串联式质谱仪分析（flowinjectionanalysiscoupledwith tandemmassspectrometricanalysis,FIA-MS/MS)。该分析以正极及负极电喷洒离子化 模式来进行。通过多反应监视（multiplereactionmonitoring,MRM)完成辨识与定量， 并通过订定经同位素标定的标准品而将之标准化。于LC-MS分析中，MS配合UPLC(Waters Corp,Milford,USA) 一起使用，而代谢物于反相柱（2.ImmX50mm,BEHC18,WatersCorp, Milford，USA)中分离。移动相由溶剂A(0. 2%甲酸于水中）与溶剂B(0. 2%甲酸于乙腈中） 的梯度混合物所组成（0分钟0 %B，3. 5分钟60 %B，3. 8分钟0 %B，3. 9分钟0 %B)。以流 速900iiL/min进行洗脱。柱温维持在50°C。FIA使用等强度法（isocraticmethod)，以试 剂盒的MS流动溶剂作为移动相，其具有不同的流动条件（Omin，30iiL/min;I. 6min，30iiL/ min;2. 4min，200uL/min;2. 8min，200uL/min;3min，30uL/min)。所对应的MS如以下设 定：暂留时间0. 019-0. 25秒；3. 92KV正电压模式；I. 5KV负电压模式；氮气作为碰撞气体 介质；来源温度为150°C。用于LC-MS的参数为：暂留时间0. 006至0. 128秒；来源温度为 150°C;电压为3. 20KV;氮气作为碰撞气体介质。用于目标MS数据分析的数据输入与前处 理步骤使用TargetLynx(Waters,MA，USA)完成。通过自动化的代谢产物浓度计算将整合的 MetIDQ软件（Biocrates，Innsbruck,澳洲）应用于流线型（streamline)数据分析。
[0101] (3)血楽中对硫甲酚与硫酸卩引哚酚（indoxylsulfate)的定量
[0102] 血浆样本的制备是使用500L甲醇（以40ng/mld4-硫酸吲哚酚作为内标准品） 将蛋白质沉淀，接着于4°C以12,OOXg离心10分钟。收集上清液用于对硫甲酚与硫酸吲哚 酌分析。于XevoTQMSAcquityUPLC系统（WatersCorp，Milford，USA)中实施LC-MS/ MS。于反相AcquityUPLCBEHC18柱（1.7iim，100mmX2.1mm)中完成分离。该柱维持于 40°C，流速为0. 5ml/min。将样本自LC柱中洗脱是使用线性梯度：0至0. 5分钟：10-20%B; 0. 5至3分钟：20至70%B;3至3. 5分钟：98%B;5. 1至7分钟：10%B用于再平衡。移 动相为水（溶剂A)及甲醇（溶剂B)。串联式四极质谱法中的质谱离子化、分裂及获得条件 的优化使用负极模式的电喷洒离子化（electrosprayionization,ESI)。条件如下：去溶 气体设定为10001/h，温度500°C;锥孔气体设定为301/h，且来源温度设定为150°C。毛细 管电压与锥孔电压分别设定为800V与30V。质谱法操作于多反应监测（MRM)模式，暂留时 间及内扫描延迟时间分别为〇. 2秒及0. 1秒。数据的收集与处理使用Masslynx软件（版 本 4. 0)。
[0103] (4)统计分析
[0104] 该结果表示为连续变数的平均值土SD以及分类变数的数目（百分比）。通过适当 的两样品的t_tests、AN0VA及卡方检定（Chi-square)比较数据。使用指定的软件来进行代 谢物组学分析。为了最大化各组间的代谢谱型的辨识差异，利用正交投影潜在结构判别分 析（OPLS-DA)模式，并以SIMCA-P(版本13. 0,UmetricsAB,Umea,瑞典）来进行。计算该模 式中各变数的投影值中变数投影重要性（variableimportanceintheprojection,VIP) 的值，以该值表示对该类别的贡献。较高的VIP值表示对各组间的区分有较强的贡献。这些 变数的VIP值大于I. 0时被认为具有显著性差异。代谢物组学以及HF的BNP的诊断值通 过接受者操作特征（receiveroperatingcharacteristic,R0C)曲线的曲线下面积（area underthecurve,AUC)表不。
[0105] 依进度表或最后一个可取得的探访来收集后续数据。ROC曲线以及Kaplan-Meier 分析被用来测定第一个经定义的事件（死亡、或与HF相关的再住院率）的预测器 (predictor)。为了Kaplan-Meier分析，该截断值（cutoffvalue)设定为各变数的平 均值来获得对数等级（Logrank)的数据。该AUC及对数等级的值被用来显示具有HF 患者的代谢物组学的预后及BNP。所有的统计分析以双尾及使用SPSS软件进行（版本 15. 0,SPSS,Chicago,IL，USA)。小于0? 05的P值被认为具显著性。
[0106] 实施例1:用以诊断及判断心脏衰竭期别的全代谢组学分析
[0107] 1.各组病人的基本特性
[0108] 本实施例总共招收234名个体，其包括51名正常个体以及183名处于A期（n= 43)、B期（n= 67)及C期（n= 73)的患者，其基线特性与实验室数据如表1所示。在大 部份的变数中，可注意到自正常对照组至A、B及C期患者间有显著的改变趋势。相较于正 常对照组，处于C期的患者的BNP含量明显较高，QRS波群则较宽，但总胆固醇、低及高密 度脂蛋白胆固醇（lowandhighdensitylipoproteincholesterol)、钠、血红素、白蛋白 (albumin)及预估的肾小球过滤率（estimatedglomerularfiltrationrate)则较低。就 年龄而言，各组病人之间虽然没有显著的差异，但其年龄皆大于正常对照组。此外，患者中 的男性比例也较高。冠状动脉疾病是HF患者的主要病因。
[0109]

【权利要求】
1. 一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于 评估个体的心脏衰竭可能性，其特征在于，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰 肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，该生物样本选自血液、血浆、血清及尿液所 组成组的至少一种。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括氨基酸。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、 组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所 组成组的至少一种。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。
6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱，该磷 脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36: 2、酰基-烷基磷脂酰 胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱 C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰 基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂 酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，该磷脂酰胆碱选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
8. -种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于 评估可能性，根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏学会的A、B、C及D期， 其特征在于，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺及丙酰肉碱所组成组的至少一种。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括氨基酸。
10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，该氨基酸选自于谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨 酸、组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸 所组成组的至少一种。
11. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。
12. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱，该磷 脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆碱C34: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36: 2、酰基-烷基磷脂酰 胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰胆碱 C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰 基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂 酰胆碱C36:5、二酰基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40: 4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成组的至少一种。
13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，该磷脂酰胆碱选自酰基-烷基磷脂酰胆碱 C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱C34:4所组成组的至少一种。
14. 一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用 于评估可能性，根据所述可能性将所述个体心脏衰竭的预后分类为死亡或再住院，其特征 在于，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。
15. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括氨基酸。
16. 如权利要求15所述的用途，其特征在于，该氨基酸为必需氨基酸。
17. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，该必需氨基酸选自组氨酸、异亮氨酸、亮 氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸所组成组的至少一种。
18. 如权利要求17所述的用途，其特征在于，该必需氨基酸选自亮氨酸、苏氨酸及色氨 酸所组成组的至少一种。
19. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括二甲基精氨酸、及 二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
20. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，该生物标记进一步包括对称性二甲基精 氨酸、及对称性二甲基精氨酸/精氨酸的比率。
21. -种用于诊断心脏衰竭的装置，其包括： 检测器，用于检测选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫甲酚及其组合所组成 组的生物标记。
【文档编号】G01N33/68GK104515860SQ201410482479
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】王兆弘, 萧明熙, 郑美玲 申请人:长庚大学