一种电化学膀胱癌dna传感器的制备方法
【专利摘要】本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学方法将玻碳电极表面羧基化，再将膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备膀胱癌DNA传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针DNA，探针DNA是识别元件，生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。其特征在于，获得高灵敏度的电化学膀胱癌DNA传感器。这种传感器灵敏度高，稳定性强，选择性好，其检测结果优于传统DNA检测方法。该制备方法包括：1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备；2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交；3.传感器的电化学信号检测。该传感器操作方法简单，便于实际推广应用。
【专利说明】一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及膀胱癌DNA检测技术，具体为一种电化学膀胱癌DNA传感器的制备 方法。该传感器将核酸杂交技术与电化学技术有机结合，通过循环伏安（CV)和差分脉冲 (DPV)法的峰信号来检测膀胱癌的特异DNA。
【背景技术】
[0002] 脱氧核糖核酸（DNA)对于所有生命体来说是一种最重要的基础生物分子。因此， 对于DNA序列的识别和定量分析在基因诊断，疾病预防以及微生物检测领域有着非常重要 的意义。近年来，随着生物技术的飞速发展和电子信息技术的长足进步，DNA序列检测技术 也突飞猛进，检测方法的研究也取得了重大进展。如荧光检测法，荧光耦合聚合酶链反应法 (PCR)，化学发光检测法，光密度成像检测法等这些DNA检测方法已经被应用于DNA的科学 研究和临床检测。但是，上述检测方法在检测过程中，操作难度大，技术较为复杂，所需专业 仪器昂贵，这些因素都使得DNA检测技术的发展收到了很大程度的制约。所以，新型电化学 DNA传感器的开发与应用有着极其重要的意义。
[0003] 目前，传统的DNA分子检测方法主要有荧光法（Audrey et al. Chem. Rev.，2008， 109-139)，这种方法通过荧光共振转移原理（FRET)使发光体在遇到目标DNA后其荧光强度 产生变化，通过对荧光信号的表征分析对目标DNA进行检测。但是，该方法前期样品制备复 杂，实验误差较大，实验周期长，所需仪器昂贵，不利于快速、准确、方便地检测DNA序列。另 外一种常用的DNA分子检测方法是压电晶体传感器法。这种传感器的构建依据是通过DNA 杂交前后的质量变化，对DNA分子进行检测。该方法操作相对简单，但实验中所需要的石英 晶体声微天平价格昂贵，并且检测的精度并不是很高。
[0004] 电化学检测法是近年来新发展的一种高效并且准确可靠的分析检测方法，该方法 在分析检测领域已经收到了人们广泛的关注和研究。因此，利用电化学法构建电化学DNA生 物传感器并应用于DNA序列的检测也逐渐成为了一项新的DNA检测技术。目前，电化学DNA 生物传感器的种类主要有发卡探针型传感器（Jin et al.，Biosens· Bioelectron· ·20〇7， 1126-1130)，适体型传感器（Yan et al·，Sens. Actuat.B-Chem·· 2011,1380-1385)，以及层 层自组装型传感器（Pandey et al.，Sens. Actuat.B-Chem·· 2011,333-340)。相对于传统 的DNA检测方法，电化学DNA检测法具有选择性高、灵敏度好、稳定性强、检测成本低廉、能 在复杂的体系中快速检测等特点。因此，新型电化学DNA传感器的创新开发具有非常重要 的实际意义。
[0005] 膀胱癌是目前世界上最常见的癌症之一，世界上患有膀胱癌疾病的患者多达2700 万人（Kim et al.，Biosens· Bioelectron· .2013,152-157)。由于膀胱癌的高复发率和癌 细胞扩散的高速率（Du et al.，J. Photochem. Photobiol. Β· 2014,1-10)，所以膀胱癌的早 期预防和诊断就显得非常重要。目前，对于膀胱癌的临床检测手段主要是通过常规的医学 仪器（如CT，Β超等）进行检查和确诊。这种传统的检查方法通常需要3至5天才可得到 检查结果，并且需要医师反复查看才能最终确诊。相比于这种方法，电化学检测法可以实现 高效，准确并且方便地对膀胱癌细胞进行体外检测。
【发明内容】
[0006] 针对传统DNA检测技术的不足，本发明要解决的主要技术问题是，开发一种新型 的电化学膀胱癌DNA传感器。该传感器具有很好的灵敏性，选择性和稳定性，适用于DNA分 析技术。其检测效率，检测灵敏度以及目标DNA选择性均优于传统DNA检测方法，且制备工 艺简单，成本低廉，适用性好，便于实际推广应用。
[0007] 本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法将 玻碳电极（GCE)表面羧基化，再将氨基标记的膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上， 制备膀胱癌DNA生物传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链 DNA(ssDNA)的组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针ssDNA，探针ssDNA是识别兀件， 生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（H)C)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)。 其特征在于，获得高灵敏度的电化学膀胱癌DNA传感器。这种传感器检测效率高，灵敏度 好，稳定性强，选择性好，其检测结果明显优于传统DNA检测方法。
[0008] 本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法和 生物偶联的方法将膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上，制备灵敏度高，选择性强， 检测速度快的DNA生物传感器。该制备方法包括：
[0009] 1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备包括下面两个步骤：
[0010] 1. 1玻碳电极的竣基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为 50nm的氧化铝泥浆中抛光处理l-60min成表面镜面，然后在0· 1-2. Omol/L硝酸，无水乙醇 和超纯水中依次超声清洗l-60min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处 理干净后的玻碳电极在〇. 01-1. 〇m〇l/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活 化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.05?2mol/L氢 氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1-50圈，扫描速度为1?200mV/s,扫 描范围-2?2V.
[0011] 1.2单链DNA探针的组装：用微量进样器取0. 1-100 μ 1探针ssDNA和 0· 01_5mlEDC/NHS连接剂滴加到电极表面，于0_5〇°C恒温下密封静置1-24小时，再依次用 Tris-HCl缓冲液（pH为7. 0-9. 0)、二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针ssDNA,进而完 成膀胱癌DNA传感器的制备。
[0012] 2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
[0013] 将上述ssDNA/GCE电极置于0· 1-50ml -定浓度互补目标DNA杂交液中，1〇-1〇〇。〇 恒温反应l-l〇h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 0-9· 0)、二次水冲洗电极表面除 去未杂交的目标DNA，即完成了 DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA (dsDNA) 修饰的玻碳电极dsDNA/CdTe置于1-100 μ mol/L的亚甲基蓝（MB)溶液中浸泡卜100min，使 得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 0-9. 0)、二 次水冲洗除去未反应的MB分子。
[0014] 3.传感器的电化学信号检测
[0015] 采用循环伏安法（CV)和差分脉冲伏安法（DPV)进行检测，以不同修饰的金电极 作为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电 化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说 明均为〇. 01-lm〇l/L的Tris-HCl缓冲液（pH = 7· 0-9. 0)，扫描电位-2?2V，扫描速度为 l-100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为ssDNA/GCE探针与目标DNA杂交过程的循环伏安图：a.玻碳电极；b. ssDNA/ GCE ；c.MB/dsDNA/GCE
[0017] 图2为ssDNA/GCE探针与不同目标DNA杂交后的差分脉冲伏安曲线图：a.玻碳电 极；b.多错配序列DNA ;c.单碱基错配DNA ;d.完全互补DNA
【具体实施方式】：
[0018] 下面结合实施例进一步叙述本发明。
[0019] 本发明解决所述电化学膀胱癌DNA传感器的技术方案是，通过电化学蚀刻方法将 玻碳电极（GCE)表面羧基化，再将氨基标记的膀胱癌细胞特异DNA探针组装到玻碳电极上， 制备膀胱癌DNA生物传感器。以玻碳电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链 DNA (ssDNA)的组装，其中玻碳电极羧基化是为了固定探针ssDNA，探针ssDNA是识别元件，。 生物连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（H)C)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)。 所述的ssDNA探针序列可以根据A-T，G-C对应的原则得出。
[0020] 上述DNA链段是下述DNA编码序列：
[0021] 具有膀胱癌细胞特征的DNA编码序列，例如：
[0022] 5, -CAGTAGACGGGGGTGTCTCGCGAC-3,：
[0023] 实施例1
[0024] 1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备：
[0025] 1. 1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为 50nm的氧化错泥楽中抛光处理5min成表面镜面，然后在0. lmol/L硝酸，无水乙醇和超纯水 中依次超声清洗3min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻 碳电极在〇. 5mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超 纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0. lmol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基 化，采用循环伏安法扫描1圈，扫描速度为50mV/s，扫描范围-0. 4?1. 4V.
[0026] 1. 2用微量进样器取5 μ 1探针ssDNA和0· 1ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面， 于20°C恒温下密封静置2h，再依次用Tris-HC1缓冲液（pH为7. 0)、二次水冲洗电极表面以 除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
[0027] 2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
[0028] 将上述ssDNA/GCE电极置于5ml -定浓度互补目标DNA杂交液中，25°C恒温反应 2h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7.0)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标 DNA，即完成了 DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电 极dsDNA/CdTe置于5 μ mol/L的亚甲基蓝（MB)溶液中浸泡5min，使得MB分子嵌入DNA双 链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 0)、二次水冲洗除去未反应的MB分 子。
[0029] 3.传感器的电化学信号检测
[0030] 采用循环伏安法（CV)和差分脉冲伏安法（DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作 为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化 学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液均为0. Olmol/ L的Tris-HCl缓冲液（pH为7. 0)，扫描电位-0. 8?0. 6V，扫描速度为10mV/S。观察峰型 变化，记录还原峰电流值。
[0031] 实施例2
[0032] 1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备：
[0033] 1. 1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为 50nm的氧化铝泥浆中抛光处理lOmin成表面镜面，然后在lmol/L硝酸，无水乙醇和超纯水 中依次超声清洗5min，去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹千电极表面。处理千净后的 玻碳电极在〇. lmol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在 超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入lmol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基 化，采用循环伏安法扫描5圈，扫描速度为100mV/s，扫描范围-0. 6?1. 4V.
[0034] 1. 2用微量进样器取20 μ 1探针ssDNA和0· 1ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面， 于35?恒温下密封静置1小时，再依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 2)、二次水冲洗电极表 面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
[0035] 2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
[0036] 将上述ssDNA/GCE电极置于2ml -定浓度互补目标DNA杂交液中，30?叵温反应 3h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 2)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标 DNA，即完成了 DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电 极dsDNA/CdTe置于10 μ mol/L的亚甲基蓝（MB)溶液中浸泡lOmin,使得MB分子嵌入DNA 双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 2)、二次水冲洗除去未反应的MB 分子。
[0037] 3.传感器的电化学信号检测
[0038] 采用循环伏安法（CV)和差分脉冲伏安法（DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作 为工作电极，钼片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化 学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明 均为0. 02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH为7. 2)，扫描电位-0· 9?0· 7V，扫描速度为50mV/ s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
[0039] 实施例3
[0040] 1.电化学膀胱癌DNA传感器的制备包括下面两个步骤：
[0041] 1. 1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为 50nm的氧化铝泥浆中抛光处理20min成表面镜面，然后在lmol/L硝酸，无水乙醇和超纯水 中依次超声清洗lOmin,去除电极表面杂质，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的 玻碳电极在1. 〇m〇l/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在 超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入〇. 8m〇l/L氢氧化钠溶液中进行表面羧 基化,采用循环伏安法扫描10圈，扫描速度为30mV/s，扫描范围-0. 6-1. 8V.
[0042] 1. 2用微量进样器取15μ 1探针ssDNA和1. 5ml EDC/NHS连接剂滴加到电极表面， 于37?恒温下密封静置1小时，再依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7· 5)、二次水冲洗电极表 面以除去未组装的探针ssDNA，进而完成膀胱癌DNA传感器的制备。
[0043] 2.电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交
[0044] 将上述ssDNA/GCE电极置于2ml -定浓度互补目标DNA杂交液中，37?恒温反应 1. 5h后取出，依次用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 5)、二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标 DNA，即完成了 DNA分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA(dsDNA)修饰的玻碳电 极dsDNA/CdTe置于20 μ mol/L的亚甲基蓝（MB)溶液中浸泡3min，使得MB分子嵌入DNA双 链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲液（pH为7. 5)、二次水冲洗除去未反应的MB分 子。
[0045] 3.传感器的电化学信号检测
[0046] 采用循环伏安法（CV)和差分脉冲伏安法（DPV)进行检测，以不同修饰的金电极作 为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指示剂，应用电化 学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线、差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明 均为0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH为7· 5)，扫描电位-0· 5-1. 0V，扫描速度为100mV/ s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
【权利要求】
1. 一种电化学膀胱癌DNA传感器，其特征在于：这种电化学膀胱癌DNA传感器以玻碳 电极为基底电极，依次进行电极羧基化和探针单链DNA的组装，其中玻碳电极羧基化是为 了固定探针单链DNA，探针DNA是识别元件，生物连接剂是1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基） 碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
2. 权利要求1所述的电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法，所述方法包括： (1) 玻碳电极的羧基化：将玻碳电极浸入一定浓度的氢氧化钠溶液中进行表面羧基 化，采用循环伏安法扫描一定圈数，扫描速度为1?200mV/s，扫描范围-2?2V ; (2) 单链DNA探针的组装：用微量进样器取一定量的探针单链DNA和EDC/NHS连接剂 滴加到电极表面，于0_50°C恒温下密封静置1-24小时，再依次用Tris-HCl缓冲液，pH为 6. 0-9. 0,二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针单链DNA，进而完成膀胱癌DNA传感器 的制备。
3. 权利要求1所述的电化学膀胱癌DNA传感器的制备方法，所述方法包括： (1) 玻碳电极的羧基化：将玻碳电极浸入一定浓度的氢氧化钠溶液中进行表面羧基 化，采用循环伏安法扫描一定圈数，扫描速度为1?200mV/s，扫描范围-2?2V ; (2) 单链DNA探针的组装：用微量进样器取一定量的探针单链DNA和EDC/NHS连接剂 滴加到电极表面，于0_50°C恒温下密封静置1-24小时，再依次用Tris-HCl缓冲液，pH为 6. 0-9. 0,二次水冲洗电极表面以除去未组装的探针单链DNA，进而完成膀胱癌DNA传感器 的制备； (3) 电化学膀胱癌DNA传感器与目标DNA的杂交：将上述单链DNA/GCE电极置于 0. l-50ml -定浓度互补目标DNA杂交液中，在一定温度和时间下反应后取出，依次用 Tris-HCl缓冲液，pH为6. 0-9. 0,二次水冲洗电极表面除去未杂交的目标DNA，即完成了 DNA 分子在电极表面的杂交。然后将得到的双链DNA修饰的玻碳电极置于一定浓度的亚甲基蓝 溶液中浸泡一段时间，使得MB分子嵌入DNA双链结构中；将处理好的电极用Tris-HCl缓冲 液，pH为6. 0-9. 0,二次水冲洗除去未反应的MB分子； (4) 传感器的电化学信号检测：采用循环伏安法和差分脉冲伏安法进行检测，以不同 修饰的金电极作为工作电极，钼片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，亚甲基蓝为指 示剂，应用电化学工作站测试不同修饰电极的循环伏安曲线，差分脉冲伏安曲线。检测底液 均为一定浓度的Tris-HCl缓冲液，pH为6. 0-9. 0,扫描电位-2?2V，扫描速度为l-100mV/ s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，在步骤（1)之前，还应对玻碳电极表面进行预处 理：先将玻碳电极在粒径用氧化铝泥浆抛光处理l_3〇min，然后在0. 1-1. Omol/L硝酸，无水 乙醇和超纯水中依次超声清洗l-10min，最后用高纯氮气吹干电极表面；处理后的玻碳电 极在0. 01-1. Omol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在 超纯水中浸泡备用。
5. 根据权利要求2或3所述的方法，在步骤⑴中，氢氧化钠溶液为0. 05?2mol/L， 循环伏安法扫描圈数为1-50圈。
6. 根据权利要求2或3所述的方法，在步骤⑵中，探针单链DNA的用量为 0· 1-100 μ 1，EDC/NHS 连接剂用量为 KC1 溶液为 0· l-5ml。
7. 根据权利要求3所述的方法，在步骤（3)中，杂交反应温度为10-KKTC，反应时间为 1-1011，亚甲基蓝溶液的浓度为1-10(^111〇1/1，浸泡在亚甲基蓝溶液中的时间为1-1001^11。
8.根据权利要求3所述的方法，在步骤（4)中，采用循环伏安法和差分脉冲伏安法进行 检测，Tris-HCl缓冲液浓度为0· Ol-lmol/L。
【文档编号】G01N27/327GK104297314SQ201410457943
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】许世超, 张晨, 张雪平, 黄丹丹, 王才富, 郑永彬 申请人:天津工业大学