基于刻蚀纳米银三角的快速荧光检测过氧化氢的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，包括：将可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，通过检测混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测，所述选定液相环境为适于过氧化氢刻蚀纳米银三角的液相反应环境。本发明具有抗干扰性强，操作简便，快速灵敏，检测限低，成本低廉等优点，适用于对复杂基质进行快速、高灵敏度的检测，且无需复杂前处理。
【专利说明】基于刻蚀纳米银三角的快速荧光检测过氧化氢的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种过氧化氢的检测方法，特别是一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法。
【背景技术】
[0002]过氧化氢(Hydrogen peroxide)化学式为H2O2,其水溶液俗称双氧水。外观为无色透明液体，是一种强氧化剂，其水溶液适用于伤口消毒及环境、食品消毒。过氧化氢不仅是一些高选择性氧化酶反应的副产物，而且是食品、制药、临床、环境和工业分析中一种重要的中间体，研究低浓度过氧化氢的检测方法在食品、医药的检测中具有重要意义。因此，方便、快速、准确地检测过氧化氢含量的方法显得尤为重要。
[0003]目前国内外有文献报道了许多过氧化氢的检测方法，如光谱法、化学发光法和电化学法等，但普遍存在灵敏度不高、稳定性不足或样品基质干扰性强等缺点，从而限制了它们的实际应用。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于提出一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其能实现对过氧化氢进行快速、灵敏的检测，成本低廉，易于操作，从而克服了现有技术中的不足。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
[0006]一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，包括:将可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，通过检测混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测，所述选定液相环境为适于过氧化氢刻蚀纳米银三角的液相反应环境。
[0007]进一步的，所述纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物的制备方法可以包括:将纳米银三角溶液与牛血清蛋白溶液混合反应，再加入荧光染料溶液，充分反应后形成所述纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物。
[0008]其中，所述纳米银三角的粒径优选为30_50nm。
[0009]所述荧光染料可选自但不限于异硫氰酸荧光素或四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯。
[0010]作为较为典型的实施方案之一，所述基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法具体可以包括如下步骤:
[0011](I)将牛血清蛋白溶液加入纳米银三角溶液，混合均匀后，静置过夜；
[0012](2)将荧光染料溶液加入至步骤(I)最终所获混合溶液中，混合均匀后，静置4h以上;
[0013](3)将步骤(2)最终所获混合溶液以不小于8000rpm的速度离心20min以上，沉淀以浓度为0.015M的柠檬酸三钠溶液重悬后，备用；
[0014](4)取可能含有过氧化氢的样品与步骤(3)最终所获重悬溶液混合均匀，并在室温下静置20min以上，并检测所获混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测。
[0015]进一步的，所述基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法包括:
[0016]1、取一系列不同浓度的过氧化氢标准样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，并检测由每一标准样品最终所形成的混合反应体系的荧光强度，以及，依据标准样品浓度与混合反应体系荧光强度的对应关系建立标准曲线.
[0017]I1、取可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，并检测最终所形成的混合反应体系的荧光强度，再与标准曲线比对，从而测得样品中所含过氧化氢的浓度。
[0018]进一步的，所述荧光强度为在所述荧光染料的发射波长下检测到的荧光强度。
[0019]与现有技术相比，本发明至少具有如下优点:该基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法依据过氧化氢刻蚀纳米银三角，而纳米银三角上标记有荧光染料，得到荧光强度不同的混合溶液，可以通过测定光荧光强度定量分析结果，检测简便快速，灵敏度高，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1是本发明基于银纳米三角刻蚀的过氧化氢荧光检测方法的原理图；
[0022]图2是本发明实施例1中所建立的过氧化氢浓度-荧光强度标准曲线；
[0023]图3是本发明实施例1中纳米银三角-牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素复合物透射电镜图；
[0024]图4是本发明实施例1中纳米银三角-牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素复合物与浓度为100 μ M的过氧化氢溶液孵育后的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0025]如前所述，鉴于现有技术中的不足，本发明提供了一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其通过在银纳米三角表面吸附牛血清蛋白后与异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯等荧光分子偶联，得到银纳米三角-牛血清白蛋白-荧光染料复合物，在过氧化氢刻蚀银纳米三角后，纳米复合物的荧光信号增强，而依据不同数量的过氧化氢对纳米银三角的刻蚀程度不同，使显示的荧光强度不同，从而实现定量检测过氧化氢的含量，该检测方法操作简便，不易受到样品基质的干扰，因而也不需要沉淀去除蛋白等较繁琐耗时的样品前处理，这为检测复杂基质，包含食品，例如牛奶等液态饮料中低浓度过氧化氢的含量提供了快速、高灵敏的检测方法。
[0026]本发明的方法包括:将可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，通过检测混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测，所述选定液相环境为适于过氧化氢刻蚀纳米银三角的液相反应环境。
[0027]例如，作为较为具体的实施方案之一，该方法可以包括如下步骤:
[0028](I)将牛血清蛋白溶液加入至纳米银三角溶液中，使牛血清蛋白的终浓度为
0.5mg/mL,混合均勻，静置过夜。
[0029](2)按照荧光染料与牛血清蛋白的质量比为1:3至1:6，将荧光染料溶液加入至步骤(I)最终所获的混合溶液，混合均匀，静置4h ；
[0030](3)将步骤(2)最终所获的混合溶液在8000rpm离心20min，沉淀以浓度为0.015M的朽1檬酸三钠溶液重悬，同时浓缩10倍。
[0031](4)取可能含有过氧化氢的测试样品与步骤(3)中所获重悬溶液按照1:1的体积比混合均匀，并在室温下静置20min，检测混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测。
[0032]而在一更为具体的实施案例中，该方法可以包括
[0033](I)纳米银三角的制备。40mL水溶液体系，包括400μ?，0.01Μ硝酸银溶液，600 μ L, 0.1M柠檬酸三钠溶液，96yL，30wt% H2O2室温下强力搅拌1min。然后，快速注入400 μ L，0.1M硼氢化钠溶液。
[0034](2)取40mL纳米银三角溶液。将200 μ L牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到纳米银三角胶体溶液中，混合均匀，静置过夜。再将300yL荧光染料(lmg/mL)加入到上述混合溶液中，混合均匀，静置4h。混合溶液8000rpm离心20min，用0.015M柠檬酸三钠溶液重悬，同时浓缩10倍。
[0035](3)吸取不同浓度(如:0、0.025、5、30、50、100μΜ)过氧化氢lOOuL，加入到(I)中所述的重悬液中，振荡混匀，静置20min，检测混合反应体系的荧光强度。
[0036]进一步的，在前述步骤(I)中，所述纳米银三角胶体溶液体积可以为10?100mL。
[0037]前述步骤⑴中所使用的牛血清蛋白溶液体积还可以为50?500 μ L，浓度还可以为 I ?lOmg/mL。
[0038]前述步骤(I)中所使用的荧光染料溶液体积还可以为30?300μ L，浓度还可以为I ?lOmg/mL。
[0039]更为具体的，该实施方案中的方法还可以为:
[0040](I)制备10?10mL纳米银三角胶体溶液。将50?500 μ L牛血清蛋白溶液(I?10mg/mL)加入到纳米银三角胶体溶液中，混合均匀，静置过夜。再将30?300 μ L荧光物质(I?10mg/mL)加入到上述混合溶液中，混合均勻，静置4h。混合溶液8000rpm离心20min,用0.015M柠檬酸三钠溶液重悬，同时浓缩10倍。
[0041](2)吸取不同浓度(如:0、0.025、5、30、50、100μΜ)过氧化氢lOOuL，加入到(I)中所述的重悬液中，振荡混匀，静置20min，检测混合反应体系的荧光强度。
[0042]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0043]实施例1该过氧化氢的检测方法原理如下式所示:
[0044]2Ag+H202 — 2Ag++20r
[0045]该方法具体如下:
[0046](I)纳米银三角-牛血清蛋白(BSA)-异硫氰酸荧光素(FITC)复合物的制备。取40mL纳米银三角溶液，将200 μ L牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到纳米银三角胶体溶液中，混合均匀，静置过夜。再将300 μ L异硫氰酸荧光素(lmg/mL)加入到上述混合溶液中，混合均匀，静置4h。混合溶液8000rpm离心20min，用0.015M柠檬酸三钠溶液重悬，同时浓缩10倍。
[0047](2)过氧化氢标准曲线的制作。吸取不同浓度(如:0、0.025、5、30、50、100μΜ)过氧化氢溶液10uL,加入到步骤(I)中所述的重悬液中，振荡混匀，静置20min，检测混合反应体系的突光强度(激发波长494nm,发射波长518nm)。以过氧化氢浓度为横坐标,突光强度为纵坐标，得到的标准曲线如图2所示,检测线性范围为0.025-100 μ M,检测灵敏度可达到 8ηΜ。
[0048]另外，请参阅图3、4系纳米银三角-牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素复合物在与浓度为100 μ M的过氧化氢溶液孵育前、后的透射电镜图。
[0049](3)鲜奶样品中过氧化氢的检测。将鲜奶稀释20倍，取溶液100μ L，加入到步骤(I)中所述的重悬液中，振荡混匀，静置20min，检测混合反应体系的荧光强度(激发波长494nm，发射波长518nm)。参照标准曲线可以计算出牛奶样品中过氧化氢的浓度。
[0050]实施例2该方法具体如下:
[0051](I)纳米银三角-牛血清蛋白-四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯复合物的制备。取40mL纳米银三角胶体溶液。将200 μ L牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到纳米银三角胶体溶液中，混合均匀，静置过夜。再将300μ L四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯(lmg/mL)加入到上述混合溶液中，混合均匀，静置4h。混合溶液8000rpm离心20min，用0.015M柠檬酸三钠溶液重悬，同时浓缩10倍。
[0052](2)吸取不同浓度(如:0、0.025、5、30、50、100μΜ)过氧化氢溶液lOOuL，加入到步骤(I)中所述的重悬液中，振荡混匀，静置20min，检测混合反应体系的荧光强度(激发波长546nm，发射波长576nm)。过氧化氢的检测结果，亦可得出与实施例1相近之标准曲线。
[0053](3)鲜奶样品中过氧化氢的检测:与实例I中方法相似。
[0054]应当理解，以上实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效形式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于包括:将可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，通过检测混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测，所述选定液相环境为适于过氧化氢刻蚀纳米银三角的液相反应环境。
2.根据权利要求1所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于所述纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物的制备方法包括:将纳米银三角溶液与牛血清蛋白溶液混合反应，再加入荧光染料溶液，充分反应后形成所述纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物。
3.根据权利要求1所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于所述纳米银三角的粒径为30-50 nm。
4.根据权利要求1或2所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于所述荧光染料包括异硫氰酸荧光素或四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯。
5.根据权利要求1所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将牛血清蛋白溶液加入纳米银三角溶液，混合均匀后，静置过夜； (2)将荧光染料溶液加入至步骤(I)最终所获混合溶液中，混合均匀后，静置4h以上； (3)将步骤(2)最终所获混合溶液以不小于8000rpm的速度离心20 min以上，沉淀以浓度为0.015 M的柠檬酸三钠溶液重悬后，备用； (4)取可能含有过氧化氢的样品与步骤(3)最终所获重悬溶液混合均匀，并在室温下静置20 min以上，并检测所获混合反应体系的荧光强度，实现对样品中所含过氧化氢的检测。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于包括: 1、取一系列不同浓度的过氧化氢标准样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，并检测由每一标准样品最终所形成的混合反应体系的荧光强度，以及，依据标准样品浓度与混合反应体系荧光强度的对应关系建立标准曲线； I1、取可能含有过氧化氢的样品与纳米银三角-牛血清蛋白-荧光染料复合物在选定液相环境中混合反应，并检测最终所形成的混合反应体系的荧光强度，再与标准曲线比对，从而测得样品中所含过氧化氢的浓度。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的基于刻蚀纳米银三角的荧光检测过氧化氢的方法，其特征在于所述荧光强度为在所述荧光染料的发射波长下检测到的荧光强度。
【文档编号】G01N21/64GK104165876SQ201410418331
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】彭池方, 刘春丽, 段小慧, 宋珊珊 申请人:江南大学