人血清ccl2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
【专利摘要】本发明提供了一种人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法。根据本发明一方面提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板，CCL2标准品，生物素标记抗人CCL2抗体以及链酶亲和素标记辣根过氧化物酶。根据本发明另一方面提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括制备：包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板、CCL2标准品、生物素标记抗人CCL2抗体以及链酶亲和素标记辣根过氧化物酶。根据本发明又一方面提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括加样、加生物素化抗体、加辣根过氧化物酶、显色以及终止步骤。
【专利说明】人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学检测领域，具体而言，涉及一种人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法。
【背景技术】
[0002]人单核细胞趋化蛋白-1(CCL2/Monocyte Chemotactic Protein-l,MCP_l)也被称为单核细胞趋化和激活因子，是趋化因子超家族中CC亚族的主要成员，具有很强的诱导和活化单核/巨噬细胞的能力。NK细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等细胞类型也对其有反应。人单核细胞趋化因子的cDNA编码的是一个99个氨基酸残基的前体蛋白，剪除一个23个氨基酸残基的疏水信号肽生成最终的76氨基酸残基的成熟蛋白。单核细胞、肥大细胞、成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多只能够细胞都可生成CCL2。
[0003]CCL2是7次跨膜的G蛋白偶联受体CCR2的配体。在炎症进程中发挥重要作用，它能在炎症发生时募集炎症细胞，诱导浸润。CCL2的升高常与败血症、狼疮性肾炎、多发性硬化、急性胰腺炎、类风湿性关节炎有关。在一些肿瘤诸如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、食管鳞状细胞癌发生时也能检测到CCL2的上调。
[0004]可见CCL2无论是对炎症的评估还是对肿瘤的监测都有很高的价值，将其作为疾病的指标的研究也越来越受到重视，CCL2有望成为实验室诊断的常规指标，用于肿瘤或肿瘤转移的辅助诊断。目前国外已有测定CCL2的ELISA试剂盒面市，但多为仅供科研应用，由于价格昂贵、操作耗时等因素还不适合用于临床，如R&D Systems的Immunoassay DCPOO系列。而国内测定CCL2的ELISA试剂盒，虽然价格适中，但试剂盒质量不稳定，灵敏度和准确度都达不到临床应用的要求。
[0005]因此，为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中的上述问题，本发明一方面提供了一种人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，另一方面提供了上述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备和使用方法。根据本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，成本低，稳定性好，具有较高的灵敏度和准确度；根据本发明另一方面提供的上述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备和使用方法，操作简单，步骤简化，用时较短。
[0007]本发明一方面提供了一种人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括:包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板，CCL2标准品，生物素标记抗人CCL2抗体，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶。
[0008]优选地，所述CCL2标准品由重组人CCL2制备，共8瓶，其含CCL2的浓度范围为
0-2000pg/ml ;所述生物素标记抗人CCL2抗体的浓度为83_125ng/ml。
[0009]进一步地，所述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒还包括洗涤液、稀释液、显色液A、显色液B和终止液。
[0010]进一步地，所述洗涤液为含吐温的磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含BSA的磷酸盐缓冲液，所述显色液A为含H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液，所述显色液B为含TMB的柠檬酸缓冲液，所述终止液为1-2M的H2SO4溶液。
[0011]本发明另一方面提供了所述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备，CCL2标准品的制备，生物素标记抗人CCL2抗体的制备，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶的制备。
[0012]进一步地，包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备过程为:取空白酶标反应板，每孔加入100-200 μ I的鼠抗人CCL2单克隆抗体，室温过夜孵育，弃去孔内液体，拍干后进行封闭。
[0013]进一步地，所述封闭过程为:每孔加入250_350μ I封闭液，孵育后弃去孔内液体，
拍干后风干。
[0014]可选地，所述封闭过程中的孵育条件为37°C孵育2个小时或者4°C过夜孵育。
[0015]优选地，包被的所述鼠抗人CCL2单克隆抗体的浓度为2000-2500ng/ml，所述封闭液为含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸盐缓冲液。
[0016]本发明又一方面提供了一种检测人血清中CCL2含量的方法，使用所述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括以下步骤:
[0017](I)加样:取所述CCL2标准品分别加入所述酶标反应板，作为标准孔；所述酶标反应板上除所述标准孔外为样品孔，所述样品孔内依次加入所述稀释液和检测样品，所述稀释液和检测样品的加入量相等，且所述稀释液和检测样品的加入量之和与所述CCL2标准品的加入量相等；所述酶标反应板的加样顺序为先于所述样品孔内加入所述稀释液，然后于所述标准孔内加入所述标准品，最后于所述样品孔内加入所述检测样品；
[0018](2)加生物素化抗体:取所述生物素标记抗人CCL2抗体加入所述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板；
[0019](3)加辣根过氧化物酶:取所述链酶亲和素标记辣根过氧化物酶加入所述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板；
[0020](4)显色:向所述标准孔和样品孔中分别依次加入所述显色液A和所述显色液B，避光反应15-20分钟；
[0021](5)终止:用所述终止液终止反应。
[0022]根据本申请提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法，能够带来以下有益效果:本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，成本低，稳定性好，具有较高的灵敏度(灵敏度可高达0.007ng/ml)和准确度，弥补了我国国内自主研发人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的空缺，为人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的临床应用奠定了基础；本发明另一方面提供的上述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备和使用方法，优化了试验条件，操作简单，步骤简化，用时较短，且能够取得较好的结果，为基础研究和临床提供服务，有助于提闻临床诊治水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1示出了本发明实施例提供的使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒检测人血清中CCL2含量的方法的流程示意图；
[0024]图2示出了本发明实施例提供的使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒检测人血清中CCL2含量的检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0025]下面参照附图详细介绍本发明的示例性实施例。提供这些示例性实施例的目的是为了使得本领域普通技术人员能够清楚地理解本发明，并且根据这里的描述能够实现本发明。附图和具体实施例不旨在对本发明进行限定，本发明的范围由所附权利要求限定。
[0026]根据本发明一方面提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括:包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板，CCL2标准品，生物素标记抗人CCL2抗体，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶。
[0027]上述酶标反应板为96孔或48孔或其他规格的酶标反应板，且优选为可灵活拆卸的酶标反应板。需要注意的是，本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒中的包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板，优选地，被装入抽真空的不透光的锡箔纸袋子内，以延长鼠抗人CCL2单克隆抗体的活性，进而延长本试剂盒的使用寿命。
[0028]上述CCL2标准品由重组人CCL2制备，共8瓶，其含CCL2的浓度范围为0_2000pg/ml,分别为 2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml以及Opg/ml ;所述生物素标记抗人CCL2抗体的浓度为83-125ng/ml，优选地，该生物素标记抗人CCL2抗体的浓度为125ng/ml。
[0029]本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，还包括洗涤液，稀释液，显色液A、显色液B和终止液。其中，上述洗涤液为ρΗ7.2-7.4的含0.05%吐温-20 (Tween-20)的磷酸盐缓冲液(PBS)，上述稀释液为pH7.2-7.4的含0.1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)，显色液A为含体积比为0.054%的H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液，显色液B为含浓度为0.48g/l的TMB的柠檬酸缓冲液，终止液为1-2M的H2SO4溶液，优选地，终止液为IM的H2SO4溶液。
[0030]需要注意的是，上述洗涤液为浓缩的洗涤液，此浓缩倍数并不局限于某一个数，可以根据试剂盒生产的需要而确定，比如可以是20倍或40倍，使用本试剂盒进行检测时要进行相应倍数的稀释方可使用，且稀释前应将装有该洗涤液的试剂瓶上下颠倒反复混匀；上述显色液A和显色液B，优选地，装入棕色试剂瓶内，且该棕色试剂瓶的瓶口处设有滴头，通过该滴头滴出的一滴液体的容积为50 μ 1，以方便使用本试剂盒进行检测。
[0031]根据本发明的另一方面提供了上述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备，CCL2标准品的制备，生物素标记抗人CCL2抗体的制备，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶的制备。
[0032]上述包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备过程为:取空白酶标反应板，每孔加入100-200 μ I的浓度为2000-2500ng/ml的鼠抗人CCL2单克隆抗体，室温过夜孵育，弃去孔内液体，拍干后进行封闭。优选地，每孔加入150μ I的浓度为2000ng/ml的鼠抗人CCL2单克隆抗体，室温过夜孵育，弃去孔内液体，拍干后进行封闭。
[0033]需要说明的是，此处孵育和以下所有孵育，不管孵育条件和时间是怎样的，孵育时酶标反应板都应该盖上盖子或贴上封板膜，上述盖子和封板膜的罩住酶标反应板的所有孔，以防止酶标反应板内的液体挥发或溅出；此处拍干和以下所有拍干，最好让酶标反应板在不掉屑的吸水纸或棉毛巾上进行拍干，且每次拍干应更换干净的吸水纸或棉毛巾，对可拆卸的酶标反应板拍干时注意不要使板条掉离板框，以保证使用本试剂盒检测的准确性。
[0034]上述鼠抗人CCL2单克隆抗体也需要制备，其原浓度为50(^8/1111，用？!17.4的
0.1M的磷酸缓冲液(PB)稀释1:250-1:200，即稀释到浓度为2000_2500ng/ml。
[0035]上述封闭过程为:每孔加入250-350 μ I的封闭液37°C孵育2个小时或者4°C过夜孵育，优选地，每孔加入300μ I的封闭液，孵育后弃去孔内液体，拍干后风干备用。上述封闭液为含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸盐缓冲液(PBS)，优选地，封闭液为含有I % BSA和5%蔗糖的0.0lM的磷酸盐缓冲液。
[0036]需要注意的是，上述封闭液并不局限于含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸盐缓冲液，可以是现有技术中已有的含其他成分的封闭液，比如含酪蛋白，只要是能够对已包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板能够起到封闭作用的溶液即可，以减少非特异性结合背景的影响。
[0037]上述CCL2标准品的制备:以重组人CCL2/MCP-1 (279_MC_010)作为标准品，取25 μ g的重组人CCL2/MCP-1 (279-MC-010)加入Iml的含I % BSA的PBS溶液充分溶解，得液浓度为10 μ g/ml的标准品溶液，稀释5000倍至2000pg/ml，以2000pg/ml作为最高点浓度，再做2倍倍比稀释,共稀释6个梯度,得 1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml以及31.25pg/ml，另外取标准品稀释液作为最低点浓度，即Opg/ml。此处标准品的稀释液为pH7.2-7.4的含0.1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。
[0038]上述生物素标记抗人CCL2抗体的制备:以生物素化人CCL2/MCP-1抗体(BAF279)作为第二抗体，原液浓度为50μ g/ml，用pH7.2-7.4的含0.1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1:600-1:400，即稀释到浓度为83-125叩/1111。
[0039]上述链酶亲和素标记辣根过氧化物酶的制备:用含5-10% BSA的0.0lM的PBS作为稀释液稀释到其工作浓度，即做I: 200稀释。该链酶亲和素标记辣根过氧化物酶购自R&D公司，货号为DY998。
[0040]其他相关溶液的制备或配制实施例如下:
[0041](I)磷酸盐包被缓冲液(0.lmol/L，ρΗ7.4):取3600ml的ddH20(双蒸水)，加入
11.84g 的 NaH2PO4.2H20(磷酸二氢钠)和 116g 的 Na2HPO4.12H20(磷酸氢二钠)，调 pH 至
7.3-7.45，加 ddH20 定容至 4L。
[0042](2)封闭溶液:取 0.145g 的 NaH2PO4.2H20(磷酸二 氢钠)、1.45g 的Na2HPO4.12H20 (磷酸氢二钠)、1.5g的ACA (6-氨基己酸)和4.38g的NaCl (氯化钠)，加入450ml的ddH20 (双蒸水)，调pH至7.3-7.5，再加入2.0g的BSA (牛血清白蛋白)、17.5g的鹿糖和0.25ml的Procilin300,然后加ddH20定容至500ml。
[0043](3)显色液A:取450ml的ddH20(双蒸水)加入8.2g的醋酸钠、1.58g的柠檬酸和
0.27ml的30%的H2O2，调节pH至5.3，用ddH20定容至500ml，分装，4°C储存。
[0044](4)显色液B -M 400ml的ddH20 (双蒸水)加入0.186g的EDTA (乙二胺四乙酸)、
0.96g的柠檬酸、0.54ml的1M的Na0H、50ml的丙三醇和0.24g的TMB-HCl (四甲基联苯胺二盐酸盐)调节pH值3.0，用ddH20定容至500ml，分装，4°C储存，整个配制过程应注意避光。
[0045](5)终止液-M 400ml的ddH20(双蒸水)加入13.9ml的12M的浓H2SO4,混勻，用去离子水定容至500ml，分装4°C储存。
[0046]图1示出了本发明实施例提供的使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒检测人血清中CCL2含量的方法的流程示意图。参照图1，本发明又一方面提供了一种检测人血清中CCL2含量的方法，使用权利要求1至5中任一项所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，即本发明又一方面提供了一种上述人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
[0047](I)加样:取上述CCL2标准品分别加入上述酶标反应板,作为标准孔；上述酶标反应板上除上述标准孔外为样品孔，该样品孔内依次加入上述稀释液和检测样品，该稀释液和检测样品的加入量相等，且上述稀释液和检测样品的加入量之和与上述CCL2标准品的加入量相等；所述酶标反应板的加样顺序为先于所述样品孔内加入所述稀释液，然后于所述标准孔内加入所述标准品，最后于所述样品孔内加入所述检测样品；
[0048](2)加生物素化抗体:取所述生物素标记抗人CCL2抗体加入上述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板；
[0049](3)加辣根过氧化物酶:取上述链酶亲和素标记辣根过氧化物酶加入上述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板；
[0050](4)显色:向上述标准孔和样品孔中分别依次加入上述显色液A和显色液B，避光反应15-20分钟；
[0051](5)终止:用上述终止液终止反应。
[0052]需要说明的是，使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒进行检测前，应将本试剂盒的整体(包括酶标反应板和其包含的各种试剂)静置于室温平衡30分钟左右，因本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的保存的优选条件为4°C，若不平衡至室温因检测过程中孵育条件不足对检测结果有一定影响；上述洗板均为洗板3-5次，每次洗板将上述酶标反应板的所有孔内均加入300-350 μ I的配制好的上述洗涤液，混匀后静置3-5分钟，拍干(前文已介绍)，然后进行下一次洗板。
[0053]需要注意的是，使用本试剂盒时的孵育条件并不局限于上述室温孵育I个小时，可以是室温孵育1-2个小时，也可以是37°C孵育0.5-1个小时，只不过室温孵育I个小时为上述步骤(2)与步骤(3)中最优选地孵育条件，且上述步骤(2)与步骤(3)中的孵育条件也可以不一致。另外，此处的室温和其他的室温一般都是指25°C。
[0054]上述步骤(I)中，加入上述CCL2标准品的量为50_200μ 1，优选地，加入上述CCL2标准品的量为100 μ I,则加入上述稀释液和检测样品的量均为25-100 μ I,优选地,加入上述稀释液和检测样品的量均为50 μ I。
[0055]需要注意的是，上述步骤(I)中，样品孔内也可以不加入上述稀释液，即不对检测样品做2倍稀释，但是这样本底会偏高，且稀释法比未稀释法相比稳定性要高。另外，如果要采用未稀释法进行使用本试剂盒，则加入上述CCL2标准品的量与加入上述检测样品的量应相等。由此可知，无论是否采用稀释法进行使用本试剂盒，原则上上述标准孔与样品孔内的液体的量是一致的。
[0056]还需要注意的是，上述步骤⑴中的加样顺序，若采用稀释法，则上述酶标反应板的加样顺序为先于上述样品孔内加入上述稀释液，然后于上述标准孔内加入上述标准品，最后于上述样品孔内加入上述检测样品；若不采用稀释法，则上述酶标反应板的加样顺序为先于上述标准孔内加入上述标准品，然后于上述样品孔内加入上述检测样品。此加样顺序并不局限于此，但若采用稀释法则必须先加入稀释液，标准品和检测样品先加哪个都是可以，只不过后续的步骤要与该次序一致，这样可以保证每个孔的反应时间是一直的，先加样的孔也是先终止的孔，因稀释液不与包被抗体反应所以应最先加入酶标反应板。
[0057]上述步骤(I)结束后直接进行步骤(2)，其间并不需要孵育、洗板，则为一步法，但使用本试剂盒并不局限于一步法，也可以采用传统的两步法，即上述步骤(I)结束后进行室温孵育1-2个小时，洗板，拍干，然后进行上述步骤(2)。
[0058]使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒若采用两步法，则最长耗时为5个多小时，但5个小时的反应时间无论对于临床推广还是对于酶联免疫检测(ELISA)本身来说都显得过长。本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒中所应用的包被抗体为单克隆抗体，生物素化抗体为多克隆抗体，只要二者识别的抗原表位不是一个，理论上就可将二抗与标本同时加入微孔，让两种抗体同时与标本中各自的抗原表位结合而不会产生竞争并相互影响，这样不仅可以将反应时间缩短，也有助于降低本底、提高试剂盒检测结果的稳定性。
[0059]综上所述,把反应时间从“加抗原反应2小时、加抗体反应2小时、加酶反应I小时”缩短到“同时加抗原和抗体反应I小时、加酶反应I小时”的模式，经实验发现顺利显色，且梯度与浓度变化一致，说明一步法可行，不存在抗原表位的竞争。因此决定将一步法作为使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的最为优选的使用方法，有利于将人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒推广普及于临床。
[0060]需要说明的是，上述步骤(4)中加入上述显色液A和显色液B后应混匀，再避光反应15-20分钟；上述步骤(5)除了用上述终止液终止反应，还包括获得检测结果。
[0061]上述获得检测结果包括定性结果和定量结果，定性结果采用目测方法，分别对比样品孔与标准孔的颜色，即可得出检测结果，颜色越深表示含CCL2的浓度越高；定量结果采用酶标仪测定波长450nm的吸光度，通过标准孔的吸光度的OD值和浓度绘制标准曲线，再通过样品孔的吸光度的OD值和标准曲线得出每个样品孔中含CCL2的浓度值。
[0062]实施例1:
[0063](I)人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的部分重要条件为:用浓度为2000ng/ml的鼠抗人CCL2单克隆抗体包被，生物素标记抗人CCL2抗体的浓度为125ng/ml ；
[0064](2)检测样本介绍:第I组为用于对比的乳腺癌标本8份，第2组为肿瘤转移阳性标本16份，第3组为肿瘤转移阴性标本16份，第4组为黄河医院体检对照8份；
[0065](3)加样:取CCL2标准品分别加入酶标反应板，每孔加入100 μ 1，作为标准孔；酶标反应板上除上述标准孔外为样品孔，样品孔内依次加入50μ I的稀释液和50μ I的检测样品；
[0066](4)加生物素化抗体:取生物素标记抗人CCL2抗体加入酶标反应板的标准孔和样品孔，每孔加入50 μ I,封板,室温孵育I个小时,用洗涤液洗板5次，拍干；
[0067](5)加辣根过氧化物酶:取链酶亲和素标记辣根过氧化物酶加入酶标反应板的标准孔和样品孔，每孔加入100μ 1，封板，室温孵育I个小时，用洗涤液洗板5次，拍干；
[0068](6)显色:向标准孔和样品孔中分别依次加入一滴显色液A和显色液B，避光反应15-20分钟；
[0069](7)终止:向标准孔和样品孔中分别加入100 μ I的终止液，混匀后，用酶标仪测定波长450nm的吸光度，获得OD值，绘制标准曲线(见图2，X轴为标准品浓度值，Y轴为OD值)，计算并获得检测结果(见表1和表2)。
[0070]表1本发明实施例提供的使用本发明提供的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒检测样品的OD值
[0071]
【权利要求】
1.一种人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括:包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板，CCL2标准品，生物素标记抗人CCL2抗体，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，其中，所述CCL2标准品由重组人CCL2制备，共8瓶，其含CCL2的浓度范围为0_2000pg/ml ;所述生物素标记抗人CCL2抗体的浓度为83-125ng/ml。
3.根据权利要求2所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，还包括洗涤液、稀释液、显色液A、显色液B和终止液。
4.根据权利要求3所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，其中，所述洗涤液为含吐温的磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含BSA的磷酸盐缓冲液，所述显色液A为含H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液，所述显色液B为含TMB的柠檬酸缓冲液，所述终止液为1-2M的H2SO4溶液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备，CCL2标准品的制备，生物素标记抗人CCL2抗体的制备，链酶亲和素标记辣根过氧化物酶的制备。
6.根据权利要求5所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其中，包被有鼠抗人CCL2单克隆抗体的酶标反应板的制备过程为:取空白酶标反应板，每孔加入100-200 μ I的鼠抗人CCL2单克隆抗体，室温过夜孵育，弃去孔内液体，拍干后进行封闭。
7.根据权利要求6所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其中，所述封闭过程为:每孔加入250-350 μ I封闭液，孵育后弃去孔内液体，拍干后风干。
8.根据权利要求7所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其中，所述封闭过程中的孵育条件为37°C孵育2个小时或者4°C过夜孵育。
9.根据权利要求7或8所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其中，包被的所述鼠抗人CCL2单克隆抗体的浓度为2000-2500ng/ml，所述封闭液为含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸盐缓冲液。
10.一种检测人血清中CCL2含量的方法，使用权利要求1至5中任一项所述的人血清CCL2酶联免疫检测试剂盒，包括以下步骤: (1)加样:取所述CCL2标准品分别加入所述酶标反应板，作为标准孔；所述酶标反应板上除所述标准孔外为样品孔，所述样品孔内依次加入所述稀释液和检测样品，所述稀释液和检测样品的加入量相等，且所述稀释液和检测样品的加入量之和与所述CCL2标准品的加入量相等；所述酶标反应板的加样顺序为先于所述样品孔内加入所述稀释液，然后于所述标准孔内加入所述标准品，最后于所述样品孔内加入所述检测样品； (2)加生物素化抗体:取所述生物素标记抗人CCL2抗体加入所述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板； (3)加辣根过氧化物酶:取所述链酶亲和素标记辣根过氧化物酶加入所述酶标反应板的标准孔和样品孔，室温孵育I个小时，洗板； (4)显色:向所述标准孔和样品孔中分别依次加入所述显色液A和所述显色液B，避光反应15-20分钟； (5)终止:用所述终止液终止反应。
【文档编号】G01N33/68GK104198727SQ201410417760
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】张健, 卢奕, 李会强, 黄昕, 郭宏伟, 邹春林 申请人:广西南宁隆吉维特生物科技有限公司