心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法；所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2及标准品组成；所述试剂R1的组成为：溶剂是pH7.0?7.6的缓冲液、溶质为表面活性剂、螯合剂、加速剂、防腐剂和纯化水；所述试剂R2为抗人H-FABP抗体胶乳试剂；所述标准品为所述标准品为含有定量H-FABP的重组蛋白。本发明解决了目前市场上乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好和检测线性范围窄等问题。另外，本发明试剂盒试剂在检测过程中具有操作简单、准确度高、重复性好、灵敏度高等特性，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪以及分光光度计上使用，具有广泛的应用前景。
【专利说明】心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种 利用乳胶增强免疫比浊法技术提高心脏型脂肪酸结合蛋白检测灵敏度的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI)是严重威胁人类健康的疾病 之一，近年来，其发病率及死亡率逐年上升，且有越来越年轻化的趋势。据统计，在中国每年 超过100万人死于AMI。现代治疗学认为，AMI发病后能迅速得到确诊并进行再灌注治疗， 对于降低死亡率及改善预后十分重要。
[0003] 在完全排除急性心肌梗死（AMI)之前，住院患者通常至少要接受6?12小时的检 测，才能考虑出院。因此，许多医院承认大多数此类患者（74%?88%)，需要进一步的检 测，这就给临床检测AMI提出了非常巨大的市场和挑战。迄今为止，临床应用的检测指标如 肌钙蛋白I (cTnl)、心肌型肌酸激酶同工酶（CKMB)，在AMI发病后的早期（2h?4h)阳性 率不高；肌红蛋白（MB)虽出现较早，但特异性较差。心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein, H-FABP)是近些年推出的心肌标志物，受到业界重视。
[0004] 脂肪酸结合蛋白（FABP)是一种小分子蛋白质（相对分子量为15000)，存在于 机体多种组织细胞的胞浆中，主要担负着结合脂肪酸并调节其细胞内代谢的功能。按照 组织特异性不同可以分为心脏型（Η-FABP)、小肠型（Ι-FABP)、肝脏型（L-FABP)、脂肪细 胞型（A-FABP)、脑细胞型（B-FABP)、肾脏型（K-FABP)、骨骼肌型（S-FABP)、牛皮癣相关性 (PA-FABP)、表皮型（E-FABP)9种亚型。它们分布于哺乳动物的心脏、小肠、肝脏、脂肪组织、 脑、表皮等组织细胞中，在蛋白质序列上显示有很大的同源性。9种FABPs都有不同的表达 模式，这些蛋白有多种功能，包括促进细胞摄取和运输脂肪酸，寻找参与特殊新陈代谢途径 的脂肪酸，参与基因表达和细胞生长的调节。
[0005] Η-FABP在心肌损伤后6?8小时左右达到浓度峰值，然后在24?30小时左右恢 复至正常水平。如此迅速恢复至正常水平得益于高肾清除率，这意味着Η-FABP不仅能够用 作AMI早期标志物，还是理想的心肌梗死复发诊断标志物。
[0006] 早期诊断AMI及评估心肌梗死面积大小新的心肌标记物必须在病人胸痛开始1? 2h内有较高的敏感度，也即在心肌发生不可逆损伤前。有研究表明，在急性心肌梗死患者 发病极早期，胞浆中的Η-FABP会迅速释放到血浆中，能够直接提示心脏患者的发病情况， 故可作为早期诊断心肌梗死程度的有效标志物，且因为其准确性、敏感性和特异性的原因， 目前还没有更优越的AMI标志物以取代它的位置。Η-FABP与其他心肌标志物在急性心肌梗 死中的价值比较很有意义。Η-FABP能及早发现超急期AMI患者。对于鉴别出需急诊住院、 冠状动脉造影、介入治疗的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛发病6h内的患者的早期诊 断和预后判断有很大帮助。Η-FABP如与传统的标记物cTnl、CK-MB结合起来一起检测，早 期检测H-FABP，恢复期检测cTnl，有利于筛选出有心脏疾患高风险的患者，不仅方便采取 积极的治疗策略，还可节约患者开支和实验室资源，Η-FABP与cTnl合理互补监测也许是将 来一种临床诊治缺血性心脏病的理想选择。
[0007] 本方法是胶乳颗粒增强免疫比浊法：将抗体结合到胶乳颗粒上，病人血清（或标 准品）中的被测抗原在缓冲液中与胶乳颗粒表面的抗体结合，使胶乳颗粒彼此交联，致使 溶液浊度增加。在一定范围内，反应液浊度与被测抗原的量呈线性相关。乳胶增强免疫比 浊法是测定血清中H-FABP浓度的常用方法，操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应 用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值，但是目前市场上的乳 胶增强免疫比浊法检测试剂盒抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好或检测线性范围 窄等问题，有待改进。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试 剂盒及其制备方法，建立一种通过抗人的心型脂肪酸结合蛋白抗体（或者单抗）与胶乳颗 粒偶联、采用胶乳增强比浊法来测定人体血清中H-FABP的含量的方法，运用该方法的试剂 盒具有操作简单，准确度高，重复性好，灵敏度高，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋 白仪以及分光光度计上使用。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 第一方面，本发明提供一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1、试剂 R2和标准品；
[0011] 所述试剂R1包括组分及含量如下：
[0012] 缓冲液 pH7.0?7.6 80?150mmol./L， 表面活ft剂 5?15ml/U
[0013] 蝥+fbW 30 ?80mmol/L, 加速剂 150 ?250mraol/L， 防腐剂 0. 5?2. 5%;
[0014] 所述试剂R2包括组分及含量如下：
[0015] 鼠抗人Η-ΡΛΒΡ胶乳颗粒 1?5%, 缓冲液 pll 6· 5?8. 5 30?80mM， 稳定剂 0. 1?1 rag/m 1? 无机 ft 100?20()mmol /1., 防腐剂 0. 5?2. 594;
[0016] 所述标准品包括6支不同浓度H-FABP重组蛋白、溶质含量均相同的标准品溶液。
[0017] 优选地，所述试剂R1、试剂R2中的缓冲液包括M0PS0缓冲液、巴比妥缓冲液、DIPSO 缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、盐酸溶液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
[0018] 优选地，所述试剂R1、试剂R2中的防腐剂包括叠氮化钠、硫柳汞、Proclin-300、苯 酚中的一种或几种。
[0019] 优选地，所述试剂R1中的表面活性剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性 齐IJ、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂中的一种或几种；
[0020] 优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂；
[0021] 优选地，所述非离子表面活性剂为Tween20。
[0022] 优选地，所述试剂R1中的螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基 三胺五乙酸、二亚乙基三胺五乙酸盐中的一种或几种。
[0023] 优选地，所述试剂R1中的加速剂包括葡聚糖4000?12000中的一种或几种。
[0024] 优选地，所述试剂R2中稳定剂包括无关蛋白、氨基酸、表面活性剂、助悬剂中的一 种或几种；所述无关蛋白包括牛血清白蛋白或明胶；所述表面活性剂包括T Ween20 ;所述助 悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖中的一种或几种。
[0025] 优选地，所述试剂R2中无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠、醋酸 钾中的一种或几种。
[0026] 优选地，所述标准品中不同浓度H-FABP重组蛋白具体是指H-FABP重组蛋白的含 量分别为 〇ng/ml、7. 8ng/ml、15. 5ng/ml、31ng/ml、62ng/ml、124ng/ml ;所述溶质及含量为 磷酸氢二钠1. 5?3g/L、磷酸二氢钠2. 5?5g/L、氯化钠30?80mmol/L、乙二胺四乙酸二 钠30?8Ctamol/L、牛血清白蛋白0. 5?1. 5%、鹿糖1?5%、叠氮化钠0. 5?1. 5%。，百分 比和千分比表示质量分数；
[0027] 第二方面，本发明提供一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法，所述 试剂R2的制备包括如下步骤 ：
[0028] 步骤1 :将抗人H-FABP抗体在pH值为4. 0?6. 0的溶液中进行酸化；
[0029] 步骤2 :将步骤1所得抗人H-FABP抗体溶液用碱溶液调节pH至7. 4?8. 2,加入 粒径为100?300nm的聚乙烯基苄基氯胶乳悬浮溶液，在37°C孵育2?4小时；
[0030] 步骤3 :将步骤2所得悬浮溶液用pH值为7. 0?8. 5的封闭液在37°C封闭5个小 时以上；所述封闭液的溶剂为50mmol/L MES缓冲液，溶质及其在所述封闭液中的含量为牛 血清白蛋白〇· lmg/ml、氯化钠150mM ;
[0031] 步骤4 :将步骤3所得悬浮溶液经离心或过滤后，取沉淀用含有稳定剂、无机盐和 防腐剂的缓冲液洗涤分散即得；
[0032] 所述洗涤为高速冷冻离心机离心或者是用孔径小于100nm的中空纤维管状进行 过滤。
[0033] 优选地，所述步骤1中人H-FABP抗体包括鼠抗人H-FABP抗体、兔抗人H-FABP抗 体、羊抗人H-FABP抗体中的一种或多种；所述溶液包括甘氨酸缓冲液、盐酸溶液、MES缓冲 液中的一种或多种。
[0034] 优选地，所述步骤2中聚乙烯基苄基氯胶乳悬浮溶液中溶剂为pH7. 4?8. 2溶液 为M0PS0缓冲液、DIPSO缓冲液或PBS缓冲液中的一种或多种。
[0035] 优选地，所述步骤4中稳定剂包括无关蛋白、氨基酸、表面活性剂、助悬剂中的一 种或几种；所述无关蛋白包括牛血清白蛋白或明胶；所述表面活性剂包括T Ween20 ;所述助 悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖中的一种或几种；所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸 钠、硫酸钾、醋酸钠、醋酸钾中的一种或几种；
[0036] 所述防腐剂包括叠 氮化钠、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一种或几种；
[0037] 所述缓冲液包括M0PS0缓冲液、巴比妥缓冲液、DIPSO缓冲液、Tris缓冲液、MES缓 冲液、盐酸溶液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
[0038] 本发明的检测原理是是胶乳颗粒增强免疫比浊法。将抗体结合到胶乳颗粒上，病 人血清（或标准品）中的被测抗原在缓冲液中与胶乳颗粒表面的抗体结合，使胶乳颗粒彼 此交联，致使溶液浊度增加。在一定范围内，反应液浊度与被测抗原的量呈线性相关。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0040] (1)本发明加入葡聚糖，加快抗原抗体的免疫反应速度，明显缩短检测时间，与现 有其他方法学技术相比，检测时间紧需10分钟；
[0041] (2)本发明加入悬浮剂和表面活性剂，悬浮剂可以提高溶液的密度和粘度，使胶乳 颗粒能够长期悬浮在溶液中不会沉降而起到很好的稳定作用；表面活性剂使胶乳粒子的表 面形成机械性或电性的保护膜，可以抑制胶乳颗粒的絮凝；根据胶乳颗粒的比重，通过适当 助悬剂调节缓冲液比重和粘度，能够使胶乳颗粒稳定悬浮而不会沉降；聚乙烯基苄基氯胶 乳颗粒是一种核壳形式的胶乳颗粒，其胶乳核是甲苯乙烯聚合物，胶乳壳为乙烯基苄基氯 的聚合物，是一种疏水性胶乳。在壳的表面具有高密度的氯甲基基团，这些活性表面功能基 团能够在温和的水溶液中直接与抗体、抗原或其它配体的氨基基团反应，通过一步反应产 生一种稳定的共价化合物，明显提高了试剂稳定性；
[0042] (3)本发明检测试剂盒，通过组分及含量的优化，使得检测线性范围宽，可在 3. 00ng/ml?120. 00ng/ml线性范围内保持良好相关性，而市售试剂（如安徽拓特生物工程 有限公司剂盒）的检测范围只有5. 00?100ng/ml ;
[0043] (4)本发明检测试剂盒在制备中，将抗体经酸处理，使得更多可利用的H-FABP抗 原结合位点暴露，提高胶乳抗体的反应活性，从而可以减少胶乳试剂制备中抗体的用量，降 低成本，同时也提高分析灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0045] 图1为显示6种不同含量的H-FABP参考标准的标准曲线；
[0046] 其中，每个点代表不同含量H-FABP的参考标准，X轴表示H-FABP的含量，Y轴表示 吸光度；
[0047] 图2为采用日立全自动生化分析仪对50份人血清（包含正常和异常标本）按各自 参数同时进行测定，对测定值进行相关分析，以本发明检测试剂盒与试剂市售H-FABP(英 国朗道公司试剂盒）的乳胶增强免疫比浊法试剂进行比较；
[0048] 其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是英国朗道公司 试剂盒测定的病人血清结果，相关系数R 2 = 0. 9947,回归方程为y = 0. 9854X+0. 3527 ;
[0049] 图3为对本发明检测试剂盒的线性范围进行验证；
[0050] 其中，X轴表示的是本发明检测试剂盒试剂实际测试结果，Y轴表示的是稀释理论 浓度，相关系数为R 2 = 〇. 9966,回归方程为y = 1. 0002X+1. 5965。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0052] 实施例1
[0053] 本实施例涉及一种H-FABP检测试剂盒的配制，包括组分及含量如下：
[0054] 试剂 R1 :
[0055]
【权利要求】
1. 一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和标准 品； 所述试剂R1包括组分及含量如下： 缓冲液 pH7, 0?7. 6 80 ?150麵〇 I /1,， 表_'活性剂 5?15ml/U 整 ft 剂 3 0 ?8 Oramo I / 丨.， 加速剂 150 ?2 5 Oramo 1 /L， 防腐剂 0, 5?2. 5%〇; 所述试剂R2包括组分及含量如下： 抗人H-FABP胶乳颗粒 〗?51, 缓冲液 pH 6· 5?8. 5 30?80minol/L, 稳定剂 0. 1?Img/nil， 无机 --? 100 ?20 Ommo 1 /L? P方腐剂 0. 5?2. 5%n 所述标准品包括6支不同浓度Η-FABP重组蛋白、溶质及含量均相同的标准品溶液。
2. 根据权利要求1所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1、试剂R2中的缓冲液包括M0PS0缓冲液、巴比妥缓冲液、DIPS0缓冲液、Tris缓冲液、MES 缓冲液、盐酸溶液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1、试剂R2中的防腐剂包括叠氮化钠、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一种或几种。
4. 根据权利要求1所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中， 所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面 活性剂； 所述螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、二亚乙基三胺 五乙酸盐中的一种或几种； 所述加速剂包括葡聚糖4000?12000中的一种或几种。
5. 根据权利要求1所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 R2中稳定剂包括无关蛋白、氨基酸、表面活性剂、助悬剂中的一种或几种；所述无关蛋白包 括牛血清白蛋白或明胶；所述表面活性剂包括T Ween20 ;所述助悬剂包括乙二醇、丙三醇、 麦芽糖中的一种或几种； 所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠、醋酸钾中的一种或几种。
6. 根据权利要求1所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述标准 品中不同浓度Η-FABP重组蛋白具体是指Η-FABP重组蛋白的含量分别为0ng/ml、7. 8ng/ml、 15. 5ng/ml、31ng/ml、62ng/ml、124ng/ml ;所述溶质及含量为磷酸氢二钠1· 5?3g/L、磷酸 二氢钠2. 5?5g/L、氯化钠30?80mmol/L、乙二胺四乙酸二钠30?80mmol/L、牛血清白蛋 白0· 5?1. 5%、鹿糖1?5%、叠氮化钠0· 5?1. 5%〇。
7. -种根据权利要求1?6中任一项所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备 方法，其特征在于，所述试剂R2的制备包括如下步骤 ： 步骤1 :将抗人H-FABP抗体在pH值为4. 0?6. 0的溶液中进行酸化； 步骤2 :将步骤1所得抗人H-FABP抗体溶液用碱溶液调节pH至7. 4?8. 2,加入粒径 为100?300nm的聚乙烯基苄基氯胶乳悬浮溶液，在37°C孵育2?4小时； 步骤3 :将步骤2所得悬浮溶液用pH为7. 0?8. 5的封闭液在37°C封闭5个小时以 上；所述封闭液的溶剂为50mmol/L MES缓冲液，溶质及其在所述封闭液中的含量为牛血清 白蛋白0· lmg/ml、氯化钠150mM ; 步骤4 :将步骤3所得悬浮溶液经离心或过滤后，取沉淀用含有稳定剂、无机盐、防腐剂 的缓冲液洗涤分散即得；所述洗涤为高速冷冻离心机离心或者是用孔径小于l〇〇nm的中空 纤维管状进行过滤。
8. 根据权利要求7所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤1中抗人H-FABP抗体包括鼠抗人H-FABP抗体、兔抗人H-FABP抗体、羊抗人 H-FABP抗体中的一种或多种；所述溶液包括甘氨酸缓冲液、盐酸溶液、MES缓冲液中的一种 或多种。
9. 根据权利要求7所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤2中聚乙烯基苄基氯胶乳悬浮溶液中溶剂为pH7. 4?8. 2的M0PS0缓冲液、 DIPSO缓冲液或PBS缓冲液中的一种或多种。
10. 根据权利要求7所述的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤4中稳定剂包括无关蛋白、氨基酸、表面活性剂、助悬剂中的一种或几种；所述 防腐剂包括叠氮化钠、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一种或几种；所述缓冲液包括M0PS0 缓冲液、巴比妥缓冲液、DIPSO缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、盐酸溶液、甘氨酸缓冲液中 的一种或多种。
【文档编号】G01N33/68GK104215772SQ201410401484
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】李伟奇, 赵小凤, 房君江, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司