薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法
【专利摘要】本发明提供薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法。该法以肉桂醛、磷酸混合液做荧光衍生剂，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液为流动相展开剂，薄层色谱板为固定相，经薄层展开的氨基甲酸乙酯与荧光衍生剂反应后，结果可在普通紫外分析仪365nm,Rf值为0.85处观察到绿色荧光点，薄层板的最低载药量为50ng的氨基甲酸乙酯。如果按照酒中氨基甲酸乙酯5mg/L的限定标准，则本发明可以直接检测出2.5mg/L的EC，薄层板的点样量一般最大为20μL，方法所需样品少，快速，灵敏度高，步骤简单，所需设备少，且易于操作。可依据该法原理，研发出一种速测试剂盒，用于酒精饮料及发酵食品中氨基甲酸乙酯的快速检测。
【专利说明】薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测氨基甲酸乙酯含量的方法，具体涉及薄层色谱法半定量测定 氨基甲酸乙酯含量的方法。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,简称EC)是一种具有潜在致癌作用的化合物， 可导致肝癌、皮肤癌、肺癌和淋巴癌等疾病，是发酵食品和酒精饮料的伴随产物。EC早在 1943 年就被证实为致癌物质。1976 年，0ugh(0ugh C S. Ethyl carbamate in fermented beverages and foods. II . Possible formation of ethyl carbamate from diethyl dicarbonate additionto wine [J]· Agric FoodChem, 1976，24(2): 328-331.)发现在 酒精饮料中含有EC。研究表明，对啮齿类动物，EC是一种多位点致癌物，并且乙醇(酒精)对 其致癌性有促进作用。2007年，国际癌症研究所把EC对人类的致癌毒性由2B组(或可能令 人类患癌的物质）改为2A组(可能令人类患癌的物质)。目前氨基甲酸乙酯的污染，被认为 是食品中继黄曲霉毒素之后的又一重要问题，我国尚未制定酒精饮料和发酵食品中氨基甲 酸乙酯的限量标准。
[0003] 自发酵酒精饮料中发现EC以来，国内外都致力于简便、快速、准确的EC含量检测 方法研究，样品的前处理方法及检测方法都在不断改进。目前国内外对酒精饮料中EC的仪 器分析检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、薄层色 谱法、傅立叶变换红外光谱法等，其中最常用的是气相色谱-质谱法。上述检测方法准确度 高，但存在仪器设备昂贵、前处理方法复杂、人员专业技术要求高、检测成本高等缺点。因 此，建立简便、快捷、准确的检测方法成为了酒精饮料中EC检测迫切需要解决的重要内容。
[0004] 薄层色谱具有操作简单、快捷、灵敏度高和准确可靠等特点，广泛应用于食品营 养，合成药物和药物代谢，医学和临床，毒物分析和法医化学，农残检测等。对于使用薄 层色谱法检测氨基甲酸乙酯，国内外报道并不多见。国内的纳新力（纳新力，陈介华， 代海香.酒中氨基甲酸乙酯的薄层分析[J].卫生研究，1991，20(6):45-46.)运用薄层 色谱法在365nm下直接展开，方法的检测限为10mg/L，国外的Eugenie Jaryj (Eugenie Jaryj, Klemens Lorenz, Spangenberg B. A Simple Method for the Quantification of Urethane in Spirits [J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2008，31: 1969-1976.)使用薄层色谱法，展开后与EC衍生剂反应，结果 可见蓝色荧光点。
[0005] 本发明提供一种用于快速检测氨基甲酸乙酯的方法。该法基于Eugenie Jaryj的 研究，经过改进后可以使用更加廉价的薄层板，经展开后与肉桂醛衍生剂反应，结果可在普 通紫外分析仪365nm，Rf值为0. 85处观察到绿色荧光点，薄层板的最低载药量为50ng的 氨基甲酸乙酯。如果按照酒中氨基甲酸乙酯5mg/L的限定标准，则本发明可以直接检测出 2. 5mg/L的EC (薄层板的点样量一般最大为20 μ L)，因此本发明能够快速、简单、廉价检测 出至少2. 5mg/L的氨基甲酸乙酯。
【发明内容】
[0006] 本发明提供薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法。以肉桂醛、磷酸混合液 做荧光衍生剂，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液为流动相展开剂，薄层色谱板为固定 相，经薄层展开的氨基甲酸乙酯与荧光衍生剂反应后，在紫外分析仪（365nm处，暗环境）可 肉眼观察到绿色的氨基甲酸乙酯荧光斑点，Rf值固定； 具体步骤为： (1) 取出薄层硅胶板于105°C ~110°C烘箱内活化半小时，放入干燥器中备用； (2) 配制展开剂，搅拌后倒入双槽薄层色谱展开缸中，静置0. 5~1小时，使之饱和； (3) 配制荧光衍生剂溶液：将肉桂醛，丙酮，磷酸混合，搅拌后备用； (4) 在距薄层硅胶板下端lcm处点样，于同一侧面上距薄层硅胶板上端2cm处铅笔标记 作为展开前沿线，点样样品为至少含有50ng的氨基甲酸乙酯待测液； (5) 在薄层展开缸中展开，展开剂到达展开前沿线后取出，晾干； (6) 将晾干后的薄层板浸于荧光衍生剂中后取出，之后再在烘箱反应5 - 20分钟； (7) 在紫外分析仪于365nm处暗环境条件下观察薄层板，此时薄层板背景颜色为蓝白 色，若在点有氨基甲酸乙酯的展据范围内有清晰的绿色斑点，此斑点即是氨基甲酸乙酯衍 生后的荧光斑点，若点样量中含有的氨基甲酸乙酯含量小于50ng时，斑点不可见。
[0007] 上述方法中，所述步骤（1)中，所述薄层硅胶板为青岛海洋薄层硅胶板，其规格为 G 或 GF，5cmX 10cm 或 10cmX 10cm。
[0008] 上述方法中，步骤（2)中所述展开剂的组成为甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程)和甲 醇，其体积比为甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(3-6): (3-10): (1-5);优选 甲基叔丁基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(4一6) : (5 - 7) : (2 - 4)。
[0009] 上述方法中，步骤（3)中所述荧光显色剂用量分别为，肉桂醛20 μ L- lmL，丙酮 10 - 80ml，磷酸0. 1 - 10ml ;优选肉桂醛为60- 200μ L，丙酮为30- 50mL，磷酸为2 - 5ml。
[0010] 上述方法中，步骤（4)中所述样品中的氨基甲酸乙酯含量在薄层硅胶板上的点样 量至少为50ng。
[0011] 上述方法中，步骤（6)中所述浸于荧光衍生剂中时间为广20秒钟，优选1~3秒钟； 反应为在烘箱80- 150°C，优选100- 140°C，反应5 - 20分钟，优选5 -12分钟。
[0012] 本发明的薄层色谱法与现有技术相比，具有以下优点： (1)本发明不需要用大型仪器即可检测出至少2. 5mg/L的氨基甲酸乙酯，Rf值为0.85。
[0013] (2)本发明所需样品少，成本低廉，步骤简单，反应条件易于控制，所需设备少，易 于操作。
[0014] (3)由于氨基甲酸乙酯极易溶于水和乙醇，薄层层析时斑点非常容易扩散，所以选 用适当的展开剂使斑点处于最佳的观察位置及减小扩散效应非常重要，本方法选用的展开 剂已尝试用于加标酒中氨基甲酸乙酯的检测，结果表明，斑点清晰，肉眼可观测。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明进一步详细说明：实施例中述及的Rf值，是薄层展开中 待分析物在特定的固定相和流动相中展开的固定常数，通过与标准品的Rf值比较，即可对 待分离物进行定性分析。在本发明中，展开后需与衍生剂反应，在365nm处观察，测量。通 过以下公式计算Rf值： _原点到斑点中心的距离 _=原点到溶刑前沿的距离 式中：原点即最初点样的位置；斑点即薄层展开后的样品点。
[0016] 实施例1 : (1) 取出薄层硅胶板5cmX 10cm于110°C烘箱内活化半小时，放入干燥器中备用； (2) 配制展开剂（甲基叔丁基醚：石油醚：甲醇=5:7:3 (体积比)，搅拌后倒入双槽薄层 色谱展开缸中，静置至少半个小时，使之饱和； (3) 配制荧光衍生剂溶液，肉桂醛160 μ L，丙酮40ml，磷酸2. 4ml于小烧杯中，搅拌后备 用； (4) 取出薄层板，在距薄层板下端lcm处点样，距薄层板上端2cm处铅笔标记作为展开 前沿，点样。第一样品点为20yL氨基甲酸乙酯标准溶液（5mg/L，40%乙醇水溶液)，在距离 第一个点水平2cm处点第二个点，样品为20 μ L的氨基甲酸乙酯标准溶液（10mg/L，40%乙 醇水溶液）和尿素溶液（l〇mg/L，40%乙醇水溶液）体积比1:1混合液；氨基甲酸乙酯为纯度 99%以上的购自阿拉丁试剂公司。
[0017] (5)在薄层展开缸中展开，展开剂到达划线前沿后取出，晾干； (6) 将晾干后的薄层板迅速浸于荧光衍生剂中后取出，之后再在烘箱130°C反应10分 钟； (7) 在紫外分析仪（365nm处，暗环境）观察薄层板，清晰可见蓝白色背景，第一点样处 上方有绿色荧光点（Rf值为〇. 85)，第二点样处有绿色荧光点（Rf值为0. 85)和蓝色荧光点 (Rf值为0. 26)。即，尿素与氨基甲酸乙酯可经薄层展开得到分离，由于不同组分在同一色 谱条件下因为分子本身极性的不同会迁移到薄层板的不同高度，分别测量原点到斑点中心 的距离，原点到溶剂前沿的距离，根据Rf值计算公式，与标准品的Rf值对比，即可进行定性 分析。
[0018] 实施例2: (1) 取出薄层硅胶板5cmX 10cm于110°C烘箱内活化半小时，放入干燥器中备用； (2) 配制展开剂甲基叔丁基醚：石油醚：甲醇=5:7:3 (体积比)，搅拌后倒入薄层展开缸 中，静置至少半个小时，使之饱和； (3) 配制荧光衍生剂溶液，肉桂醛160 μ L，丙酮40ml，磷酸2. 4ml于小烧杯中，搅拌后备 用； (4) 取出薄层板，在距薄层板下端lcm处点样，距薄层板上端2cm处铅笔标记作为展开 前沿，点样。第一样品点为20yL氨基甲酸乙酯标准溶液（5mg/L，40%乙醇水溶液)，在距离 第一个点水平2cm处点第二个点，样品为20 μ L氨基甲酸乙酯标准溶液（10mg/L，40%乙醇 水溶液)和市售龙方三星白兰地酒（1:1)混合液；氨基甲酸乙酯为纯度99%以上的购自阿拉 丁试剂公司； (5) 在薄层展开缸中展开，展开剂到达划线前沿后取出，晾干； (6) 将晾干后的薄层板迅速浸于荧光衍生剂中后取出，之后再在烘箱130°C反应10分 钟； (7)在紫外分析仪（365nm处，暗环境）观察薄层板，清晰可见蓝白色背景，第一点样处 上方有绿色荧光点（Rf值为〇. 85)，第二点样处有绿色荧光点（Rf值为0. 85)和经薄层展开 的白兰地酒。即，白兰地酒与氨基甲酸乙酯可经薄层展开得到分离，白兰地酒中的化合物对 EC薄层展开基本没有影响。
[0019] 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明 的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出 其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的 精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护 范围之内。
【权利要求】
1. 薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，以肉桂醛、磷酸混合液做 荧光衍生剂，以甲基叔丁基醚、石油醚、甲醇混合液为流动相展开剂，薄层色谱板为固定相， 经薄层展开的氨基甲酸乙酯与荧光衍生剂反应后，在紫外分析仪可肉眼观察到绿色的氨基 甲酸乙酯荧光斑点，Rf值固定；具体步骤为： (1) 取出薄层硅胶板于105°C ~110°C烘箱内活化半小时，放入干燥器中备用； (2) 配制展开剂，搅拌后倒入双槽薄层色谱展开缸中，静置0. 5~1小时，使之饱和； (3) 配制荧光衍生剂溶液：将肉桂醛，丙酮，磷酸混合，搅拌后备用； (4) 在距薄层硅胶板下端lcm处点样，于同一侧面上距薄层硅胶板上端2cm处铅笔标记 作为展开前沿线，点样样品为至少含有50ng的氨基甲酸乙酯待测液； (5) 在薄层展开缸中展开，展开剂到达展开前沿线后取出，晾干； (6) 将晾干后的薄层板浸于荧光衍生剂中后取出，之后再在烘箱反应5 - 20分钟； (7) 在紫外分析仪于365nm处暗环境条件下观察薄层板，此时薄层板背景颜色为蓝白 色，若在点有氨基甲酸乙酯的展据范围内有清晰的绿色斑点，此斑点即是氨基甲酸乙酯衍 生后的荧光斑点，若点样量中含有的氨基甲酸乙酯含量小于50ng时，斑点不可见。
2. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，所 述步骤（1)中，所述薄层硅胶板为青岛海洋薄层硅胶板，其规格为G或GF，5cmX 10cm或 10cmX 10cm。
3. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（2)中所述展开剂的组成为甲基叔丁基醚、石油醚(高沸程)和甲醇；其体积比为甲基叔丁 基醚：石油醚(高沸程）：甲醇=(3 - 6): (3 -10): (1 - 5)。
4. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（2)中所述展开剂的组成为甲基叔丁基醚、石油醚(高沸程)和甲醇；其体积比为甲基叔丁 基醚：石油醚(高沸程）：甲醇==(4一6) :(5 - 7) :(2 - 4)。
5. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（3)中所述荧光显色剂用量分别为，肉桂醛20yL - lmL，丙酮10-80ml，磷酸0. 1-10ml。
6. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（3)中所述荧光显色剂用量分别为，肉桂醛为60- 200 μ L，丙酮为30- 50mL，磷酸为2- 5ml 〇
7. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（4)中所述样品中的氨基甲酸乙酯含量在薄层硅胶板上的点样量至少为50ng。
8. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（6)中所述浸于荧光衍生剂中时间为1~20秒钟，反应为在烘箱80- 150°C反应5 - 20分 钟。
9. 根据权利要求1所述的薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法，其特征是，步 骤（6)中所述浸于荧光衍生剂中时间为1~3秒钟，反应为在烘箱100- 140°C反应5 -12分 钟。
【文档编号】G01N30/90GK104142378SQ201410365881
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】黄惠华, 王浩, 周端, 刘智钧, 黄秋婷 申请人:华南理工大学