一种细柱五加药材的质量控制方法
【专利摘要】本发明提供一种细柱五加药材的质量控制方法，有效解决五加皮规范化质量控制的需要，其步骤包括：a.紫丁香苷的测定，b.总黄酮的测定，c.总三萜的测定，d.确定药材中总黄酮含量与紫丁香苷含量的比及总三萜含量与紫丁香苷含量的比。采用组分结构来控制细柱五加药材的质量，体现中医药中配伍配比特色，避免了因测定一、二个化学成分而判断药材整体质量的片面性，为完整、准确评价细柱五加药材的质量提供了新的控制方法。这种方法简便、稳定、精密度高、易于掌握。
【专利说明】一种细柱五加药材的质量控制方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药材的质量控制方法，特别是涉及细柱五加药材的质量控制方 法，属于中药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 五加始载于本草学著作《神农本草经》，称之为"五加皮"，列为上品。"气味辛，温。 主心腹疝气腹痛，益气疗甓，小儿不能行，疽疮阴蚀。"此后在《名医别录》、《东华真人煮石 经》等历代医药著作中均有五加的记载和描述。但是由于古代文献对五加原植物的描述不 甚详细，而且五加属植物形态较为相似，经前人考证，五加皮来源于五加科（Araliaceae) 五加属（Acanthopanax Miq.)植物。
[0003] 经中国药典确定细柱五加 （Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)的干燥根 皮是中国药典中"五加皮"的唯一正品来源。五加皮为一味名贵滋补强壮药，具祛风湿，补 肝肾，强筋骨的特异功效。近三十年，国内外对细柱五加植物进行了较多的化学成分和药理 的研究。在化学成分方面，细柱五加含有五加属植物共有的木脂素类成分紫丁香甙，还含有 挥发油，豆留醇、β-谷留醇、异贝壳杉烯酸、羽扇豆烷型三萜等萜类以及多种微量元素、氨 基酸。此外还从根中分离出生物碱、多糖、强心苷。目前虽有文献针对细柱五加果实、叶等 部位中某一成分的测定方法，但未有对其真正药用部位（根皮）质量控制方法，各版药典也 未有对"五加皮"中成分测定方法，这严重制约了"五加皮"的规范化研究，因此，制定细柱 五加质量控制方法势在必行。
[0004] 中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效 成分、活性或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。如中国药典2010年版[一部]共 收载2165种药材及成药品种，均为一般检查项目，大部分为薄层色谱鉴别，其余为含量测 定（容量法、光谱法、液相色谱法、气相色谱法及薄层色谱扫描法）。显然，这些质量标准的 设置是模仿了化学药品的模式，其他国家如英国、印度、美国草药典，日本药局方中的汉药 及德国Commission Ε编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而 言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，结构关系明确，其含量和纯度直接表达其有效及 安全性。然而，中医用药的特点是配伍，同样越来越多的研究显示，道地药材中的化学成分 并不含有某一特有成分，亦不是某一成分含量越高越好，而是在组分与组分之间、组分内各 成分之间具有稳定有序的整体特征，即配伍配比，这一研究并未体现在细柱五加药材质量 控制中。
【发明内容】
[0005] 针对以上情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种细柱五加质 量控制方法，可有效解决五加皮规范化质量控制的需要，以保证五加皮临床用药的安全有 效和在医药领域其他方面的合理应用问题。
[0006] 本发明的技术方案如下，该种细柱五加质量控制方法的主要特点是：
[0007] a)细柱五加药材中紫丁香苷的测定：
[0008] ①对照品溶液制备：精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇使溶解，0. 45 μ m微孔 滤膜滤过；
[0009] ②供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入甲醇溶液，超声处理，0. 45 μ m微孔 滤膜滤过；
[0010] ③测定：吸取上述供试品及对照品溶液注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法进 行测定，得到色谱图，按峰面积换算成药材中紫丁香苷含量，色谱条件：色谱柱以十八烷基 硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈水溶液，检测波长265nm。
[0011] b)细柱五加药材中总黄酮的测定：
[0012] ①对照品溶液制备：精密称取芦丁对照品适量，加一定体积分数的甲醇溶液使溶 解；
[0013] ②供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入甲醇溶液，超声处理，过滤后取一定 量续滤液挥干后用一定体积分数的甲醇溶解后，加一定质量分数的A1C1 3溶液，用一定体积 分数的甲醇定容；
[0014] ③测定：上述供试品及对照品溶液于273nm处测定吸收度，按吸收度换算成药材 中总黄酮含量。
[0015] c)细柱五加药材中总三萜的测定：
[0016] ①对照品溶液制备：精密称取齐墩果酸对照品适量，加无水乙醇使溶解；
[0017] ②供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入90 %乙醇溶液，超声处理，过滤后取 一定量续滤液待用；
[0018] ③测定：取一定量上述对照品溶液及一定量供试品溶液，水浴挥干溶剂后，准确 加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2mL、高氯酸0. 8mL，振摇；在60°C的水浴中加热 15min，取出，流水冷却至室温；再准确加入4mL冰醋酸，振摇，于547nm处测定吸收度，按吸 收度换算成药材中总三萜含量。
[0019] d)药材中总黄酮含量与紫丁香苷含量的比为10?100 : 1，总三萜含量与紫丁香 苷含量的比为200?900 : 1。
[0020] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤a中的流动相的流速 0.500?1.500ml/min，流动相为乙腈-水（20 : 80)，柱温20?40°C。
[0021] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤a中供试品溶液制备 为精密称取样品粉末约1. 〇g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处理 (250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，0. 45 μ m微孔滤膜滤过。
[0022] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤b中一定体积分数的甲 醇为体积分数30%的甲醇，一定质量分数的A1C1 3溶液为质量分数0. 8%的A1C13溶液。
[0023] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤b中供试品溶液制备 为精密称取样品粉末约1. 〇g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处理 (250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL挥干后用体积分数 30 %的甲醇lmL溶解并转移至5mL量瓶中，加质量分数0. 8 %的A1C13溶液0. 5mL，用体积 分数30%的甲醇定容。
[0024] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤c中供试品溶液制备为 精密称取样品粉末约0. lg，精密加入90%乙醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处理 (250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL备用。
[0025] 所述的细柱五加质量控制方法的延伸技术方案包括：步骤d中总黄酮含量与紫丁 香苷含量的比为15?40 : 1，总三萜含量与紫丁香苷含量的比为200?900 : 1。
[0026] 本发明把细柱五加药材中的紫丁香苷含量、总黄酮含量、总三萜含量作为一个整 体看待，注重三个指标的相互关系，避免了因测定一、二个化学成分而判断药材整体质量的 片面性，为完整、准确评价细柱五加药材的质量提供了新的控制方法。
[0027] 本发明具有方法简便、稳定、精密度高、易于掌握的特点。
[0028] 以下便结合实施例并附图，对本发明的【具体实施方式】作进一步的详述。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1紫丁香苷标准品265nm色谱图
[0030] 图2细柱五加样品265nm色谱图
【具体实施方式】
[0031] 下面结合细柱五加质量控制方法的实例说明本发明的【具体实施方式】。
[0032] 实施例1紫丁香苷测定方法的建立
[0033] 1材料及仪器
[0034] Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪（G1311A Quaternary Pump，G1379A Degasser,G1313A Autosampler,G1314A photodiode array Detector) ；HP ChemSation工 作站（美国 Agilent 公司）；Kromasil C18(5ym，4.6X250nm)色谱柱；KQ-250DE 型医用数 控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）jartorius电子分析天平（北京赛多利斯仪 器系统有限公司）；乙腈（色谱纯，南京化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，山东禹王实业 有限公司禹城化工厂）；其余试剂均为化学纯。紫丁香苷（111574-200201)购自中国药品 生物制品检定所。
[0035] 2测定方法的确立及样品的测定
[0036] 2. 1对照品溶液制备
[0037] 精密称取紫丁香苷对照品1.60mg，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度， 制成0. 16mg/mL紫丁香苷对照品溶液。
[0038] 2. 2供试品溶液制备
[0039] 精密称取样品粉末约1. 0g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处 理（250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液备用。
[0040] 2. 3色谱条件
[0041] 色谱柱：0DS_C18 (4. 6mm X250mm，5 μ m);流动相：乙腈-水（20 : 80);体积流量： lmL/min ;柱温：室温；检测波长：265nm ;灵敏度：0. 5AUFS ;按紫丁香苷峰计算，理论塔板数 在1500以上。
[0042] 2. 4方法学考察
[0043] 2. 4. 1线性关系考察
[0044] 取紫丁香苷对照品溶液（0· 16mg/mL)。分别进样1，5,10,15, 20 μ L。按上述色谱 条件测定峰面积。以紫丁香苷进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得 回归方程为Υ= 1204. 6Χ-0. 06, R = 0. 9994。结果表明紫丁香苷在0. 16yg?3. 2yg与 峰面积具有良好的线性关系。
[0045] 2. 4. 2精密度试验
[0046] 精密吸取紫丁香苷对照品溶液（0. 16mg/mL) 10 μ L，重复进样5次，测定紫丁香苷 峰面积，得其RSD为1.07%。
[0047] 2. 4. 3重复性试验
[0048] 取同一样品，平行5次取样，制备供试品溶液，进样测定，结果紫丁香苷峰面积的 RSD 为 1. 91%。
[0049] 2.4.4回收率试验
[0050] 采取加样回收法。取已知质量分数（含紫丁香苷为0. 096mg/g)样品约1. 0g，精密 加入紫丁香苷对照品溶液（〇. 16mg/mL)0. 6mL，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算 回收率，结果平均回收率为98. 75%，RSD为1.98% (η = 5)。
[0051] 2.5样品测定
[0052] 在上述色谱条件下，分别进样测定不同样品中紫丁香苷的含量。
[0053] 实施例2总黄酮测定方法的建立
[0054] 1 材料
[0055] KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）Jartorius电 子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；UV-2501PC紫外分光光度计（SHIMADZU); 甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；其余试剂均为化学纯。芦丁 (100080-200707)购自中国药品生物制品检定所。
[0056] 2对照品溶液制备
[0057] 称取经五氧化二磷减压干燥24h的芦丁对照品约1. Omg，精密称定，置于20mL量瓶 中，加入体积分数30%的甲醇溶解并稀释至刻度，作为测定总黄酮的对照储备液。
[0058] 3供试品溶液制备
[0059] 精密称取样品粉末约1. 0g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处 理（250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL挥干后用体积分数 30 %的甲醇lmL溶解并转移至5mL量瓶中，加质量分数0. 8 %的A1C13溶液0. 5mL，用体积 分数30%的甲醇定容，即为测定总黄酮用供试反应液。
[0060] 4线性关系考察
[0061] 精密量取芦丁对照储备液0,0. 5,1. 0, 2. 0, 3. 0,4. OmL，分别置于5mL量瓶中，加质 量分数0. 8 %的A1C13溶液0. 5mL，用体积分数30 %的甲醇定容，摇匀，即为各质量浓度芦丁 对照反应液。各浓度反应液于273nm处测定吸收度，以芦丁浓度X为横坐标，273nm处吸收 度Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为Y = 38. 44X-0. 0002, R = 0. 9998。结果表 明总黄酮含量在〇mg?0. 2mg与吸收度具有良好的线性关系。
[0062] 5样品测定
[0063] 各样品的供试反应液于273nm处测定吸收度，按吸收度换算成药材中总黄酮含 量。
[0064] 实施例3总三萜测定方法的建立
[0065] 1 材料
[0066] KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；Sartorius电 子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；UV-2501PC紫外分光光度计（SHIMADZU); 甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；其余试剂均为化学纯。齐墩果酸 (110709-200304)购自中国药品生物制品检定所。
[0067] 2对照品溶液制备
[0068] 称取经五氧化二磷减压干燥24h的齐墩果酸对照品约1. 6mg，精密称定，置于20mL 量瓶中，加入无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为测定总三萜的对照储备液。
[0069] 3供试品溶液制备
[0070] 精密称取样品粉末约0. lg，精密加入90%乙醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超 声处理（250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL，水浴挥干溶 剂后，准确加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2mL、高氯酸0. 8mL，振摇；在60°C的水 浴中加热15min，取出，流水冷却至室温；再准确加入4mL冰醋酸，振摇，即为测定总三萜用 供试反应液。
[0071] 4线性关系考察
[0072] 精密量取齐墩果酸对照储备液0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmL，水浴挥干后，准确加入 新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2mL、高氯酸0. 8mL，振摇；在60°C的水浴中加热15min， 取出，流水冷却至室温；再准确加入4mL冰醋酸，振摇，即为各质量浓度齐墩果酸对照反应 液。各浓度反应液于547nm处测定吸收度，以齐墩果酸浓度X为横坐标，547nm处吸收度Y 为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为Y = 37. 33X+0. 0785, R = 0. 9991。结果表明总 三萜含量在〇mg?0. 08mg与吸收度具有良好的线性关系。
[0073] 5样品测定
[0074] 各样品的供试反应液于547nm处测定吸收度，按吸收度换算成药材中总三萜含 量。
[0075] 实施例4细柱五加含量测定
[0076] 取不同产地产地细柱五加药材按实施例1、实施例2、实施例3的方法分别测定紫 丁香苷、总黄酮、总三萜含量，结果如下表所示：
[0077]
【权利要求】
1. 一种细柱五加药材的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤： a) 细柱五加药材中紫丁香苷的测定： ① 对照品溶液制备：精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇使溶解，〇. 45 μ m微孔滤膜 滤过； ② 供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入甲醇溶液，超声处理，〇. 45 μ m微孔滤膜 滤过； ③ 测定：吸取上述供试品及对照品溶液注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法进行测 定，得到色谱图，按峰面积换算成药材中紫丁香苷含量，色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷 键合硅胶为填料；流动相为乙腈水溶液，检测波长265nm。 b) 细柱五加药材中总黄酮的测定： ① 对照品溶液制备：精密称取芦丁对照品适量，加一定体积分数的甲醇溶液使溶解； ② 供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入甲醇溶液，超声处理，过滤后取一定量续 滤液挥干后用一定体积分数的甲醇溶解后，加一定质量分数的A1C1 3溶液，用一定体积分数 的甲醇定容； ③ 测定：上述供试品及对照品溶液于273nm处测定吸收度，按吸收度换算成药材中总 黄酮含量。 c) 细柱五加药材中总三萜的测定： ① 对照品溶液制备：精密称取齐墩果酸对照品适量，加无水乙醇使溶解； ② 供试品溶液制备：精密称取样品粉末，加入90%乙醇溶液，超声处理，过滤后取一定 量续滤液待用； ③ 测定：取一定量上述对照品溶液及一定量供试品溶液，水浴挥干溶剂后，准确加入新 配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2mL、高氯酸0. 8mL，振摇；在60°C的水浴中加热15min， 取出，流水冷却至室温；再准确加入4mL冰醋酸，振摇，于547nm处测定吸收度，按吸收度换 算成药材中总三萜含量。 d) 药材中总黄酮含量与紫丁香苷含量的比为10?100 : 1，总三萜含量与紫丁香苷含 量的比为200?900 : 1。
2. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤a中的流动相的流 速0. 500?1.500ml/min，流动相为乙腈-水（20 : 80)，柱温20?40°C。
3. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤a中供试品溶液制 备为精密称取样品粉末约1. 〇g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处理 (250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，0. 45 μ m微孔滤膜滤过。
4. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤b中一定体积分数 的甲醇为体积分数30 %的甲醇，一定质量分数的A1C13溶液为质量分数0. 8%的A1C13溶 液。
5. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤b中供试品溶液 制备为精密称取样品粉末约1. 〇g，精密加入甲醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处 理（250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL挥干后用体积分数 30 %的甲醇lmL溶解并转移至5mL量瓶中，加质量分数0. 8 %的A1C13溶液0. 5mL，用体积 分数30%的甲醇定容。
6. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤c中供试品溶液制 备为精密称取样品粉末约〇. lg，精密加入90%乙醇20mL，称重，记录重量，浸12h后，超声处 理（250kw，36kHz) 30min，静置至室温，补足重量，过滤后取续滤液0. 5mL备用。
7. 如权利要求1所述的细柱五加的质量控制方法，其特征在于步骤d中总黄酮含量与 紫丁香苷含量的比为15?40 : 1，总三萜含量与紫丁香苷含量的比为200?900 : 1。
【文档编号】G01N30/06GK104090046SQ201410352833
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】韦敏, 郑生智, 吕晔, 张贵君 申请人:江苏省中国科学院植物研究所