一种胡芦巴总皂苷提取物的质量检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种胡芦巴总皂苷提取物的质量检测方法，它是以薯蓣皂苷元为总皂苷水解产物中的指标成分，采用高效液相色谱法进行检测，其中，色谱条件为：色谱条件：SSI?series?1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE?Kromasil?C18(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；流动相：甲醇(B)-水(A)[0-30min:90％B；30-35min:90％B-100％B；35-60min:100％B]；流速：0.8-1.0ml/min；柱温：30-40℃；进样量：10μl；检测波长为：203-210nm。本发明通过酸水解将胡芦巴总皂苷水解成薯蓣皂苷元，然后采用高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元的含量继而标定总皂苷的含量。此方法简便、可行，准确度优于紫外分光光度法，为测定胡芦巴提取物中总皂苷的含量提供了新手段。
【专利说明】一种胡芦巴总皂苷提取物的质量检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种胡芦巴总皂苷提取物中总皂苷的检测方法。
【背景技术】
[0002] 胡芦巴为豆科胡芦豆属植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种 子，原产于地中海东岸、中东、伊朗高原及西马拉雅地区，我国主要分布于四川、安徽、河南、 新疆等地，且南北各地均有栽培。胡芦巴在非洲、北美等国家作为调味品和开胃品使用，民 间也将其作为滋补品和营养品使用；埃及人将胡芦巴作为生活必需品 [1]。在中国胡芦巴属 于药食同源之品，始载于《嘉佑本草》。据《本草纲目》记载：胡芦巴，右肾命门药也，元阳不 足，冷气潜伏，不能归元者宜之。张子和《儒门事亲》云，有人病目不睹，思食苦豆，即胡芦巴， 频频不缺，不周岁而目中微痛，如虫行入眦，渐明而愈。按此亦因其益命门之功，所谓益火之 源，以消阴翳是也。《中国药典》记载本品味苦，性温，归肾经，具有温肾助阳，祛寒止痛之功 效 [2]，常用于治疗寒疝，腹胁胀满，寒湿脚气，肾虚腰酸，阳痿。
[0003] 胡芦巴种子中含有多种化学成分，其中主要为留体皂苷类、黄酮类、氨基酸类等成 分。现代药理研究发现胡芦巴具有降血糖、降血脂、抗糖尿病并发症、抗肿瘤、抗血脂异常、 抗氧化损害、解乙醇中毒、杀虫等生物活性 [3]。
[0004] 研究发现皂苷类成分为胡芦巴药材的主要药效成分。现代药理研究发现胡芦巴总 皂苷提取物具有防治糖尿病及糖尿病慢性并发症、调节血糖血脂等作用 [4]。胡芦巴总皂苷 可通过下调组织型转谷氨酰胺酶（tTG)实现对大鼠心肌的保护作用[5];胡芦巴总皂苷能够 降低大鼠酒精性脂肪肝的血清TNF-α水平，升高脂联素（adiponectin)水平，从而促进肝 脏脂肪氧化，减少脂质生成，实现对酒精性脂肪肝的治疗作用 [6] ;Sreemayee Chatterjee等 [7]研究发现胡芦巴提取物在肿瘤发生的所有阶段均有效，且其能影响小鼠肝脏抗氧化防御 系统，调节谷胱甘肽和过氧化脂质体水平；胡芦巴总皂苷对脑缺血具有保护作用 [8];胡芦 巴皂苷还有调节食源性代谢紊乱作用[9]。
[0005] 胡芦巴总皂苷作为胡芦巴药材的主要有效成分，市面上销售较大，但存在着不法 商贩用廉价皂苷掺假销售现象，而目前主要检测胡芦巴总皂苷的方法是紫外分光光度法， 但是此方法误差大、专属性不好，易受环境、仪器等外部因素影响。因此，建立一种较为准确 检测胡芦巴总皂苷含量的方法是极其迫切的。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术方案是提供了一种胡芦巴总皂苷提取物的检测方法。
[0007] 本发明提供了一种胡芦巴总皂苷提取物的检测方法，它是以薯蓣皂苷元为总皂苷 水解产物中的指标成分，采用高效液相色谱法进行检测，其中，色谱条件为：
[0008] 色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE KromasilC18(200_X4.6mm，5ym)，S/N:18201306;流动相：甲醇（B)-水（A) [0-30min:90%B ;30-35min:90%B-100%B ;35-60min:100%B];流速：0· 8-1. Oml/min ;柱 温：30-40°C ;进样量：10μ 1 ;检测波长为：203-210nm。
[0009] 进一步优选地，所述的检测波长为203nm;所述的柱温是35°C ;所述的流速： L 0ml/min〇
[0010] 本发明检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
[0011] a、对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，置容量瓶中，加入甲醇充 分溶解后，定容至刻度，制备成浓度为1.080mg/ml的对照品溶液，备用；
[0012] b、供试品溶液的制备：取胡芦巴总皂苷提取物，加入总皂苷提取物量10-90倍的 5% -25%硫酸溶液，超声处理使溶解，于100°C恒温水浴中回流水解1-5小时，期间每隔lh 取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀 用水洗至中性，即得水解产物；水解产物用甲醇溶解并定容，摇匀，0. 45 μ m微孔滤膜滤过， 取续滤液作为供试品溶液；
[0013] c、将供试品溶液注入液相色谱仪，测定薯蓣皂苷元的含量。
[0014] 其中，b步骤加入总皂苷提取物量30-40倍的15%硫酸溶液；所述的水解时间为4 小时。
[0015] 本发明检测方法是针对胡芦巴总皂苷提取物的质量进行检测，在确定此检测方法 之前，发明人对各种水解方法进行了比较，如直接回流水解法、加有机相回流水解法、加入 振荡作用水解法、加入超声作用水解法，实验结果表明加入超声处理的作用所得产物量最 高。因此，本发明加入超声处理的作用，较其他方法稳定性最好，准确度最高。且操作步骤 少（直接定容检测，无萃取操作），减少了有机溶剂的用量，避免萃取不完全，所得结果更准 确，可靠。
[0016] 本发明通过酸水解将胡芦巴总皂苷水解成薯蓣皂苷元，然后采用高效液相色谱法 测定薯蓣皂苷元的含量继而标定总皂苷的含量。此方法简便、可行，准确度优于紫外分光光 度法，为测定胡芦巴中总皂苷的含量提供了新手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1对照品在不同检测波长下的HPLC色谱图（注：A :210nm ;B :205nm ;C :203nm)
[0018] 图2样品在不同检测波长下的HPLC色谱图（注：A :210nm ;B :205nm ;C :203nm)
[0019] 图3样品在不同柱温下的HPLC色谱图（注：A :40°C ;B :35 °C ;C :30°C )图 4样品在不同流速下的HPLC色谱图（注：A :1. Oml/min ;B :0. 8ml/min)图5样品在 不同色谱柱下的 HPLC 色谱图（注：A:TIANHE Kromasil C18(200mmX4. 6mm, 5 μ m)，S/ N:18201306;B: Wondasil? C18(250mmX4.6mm，5ym)，S/N:3D8702-23;C: Inertsil? 0DS-3(250mmX4. 6mm, 5 μ m), S/N: 1A7133271)
[0020] 图 6 样品在 Angilent Technologies 1200Series 上的 HPLC 色谱图
[0021] 图7样品在SSI series 1500上的HPLC色谱图
[0022] 图8对照品溶液的色谱图
[0023] 图9空白溶剂（甲醇）的色谱图
[0024] 图10供试品溶液的色谱图（t = 30min)
[0025] 图11供试品溶液的色谱图（t = 60min)
[0026] 图12酸浓度考察趋势图
[0027] 图13水解时间考察趋势图
[0028] 图14酸液加入量考察趋势图
[0029] 图15水解后各部分的TLC图谱，其中，展开体系：氯仿：甲醇=9:1 ;
[0030] 1 :水解后的母液；2 :水解后水层的沉淀广物；3 :署截阜昔兀对照品；4 :水解如总 阜苷样品
[0031] 图16水解后各部分的TLC图谱，其中，展开体系：氯仿：甲醇：水=4:1:0. 1 ;
[0032] 1 :水解后的母液；2 :水解后水层的沉淀产物；3 :薯蓣皂苷元对照品；4 :水解前总 阜苷样品
[0033] 图17正交试验最优水解条件水解样品的HPLC图谱
【具体实施方式】
[0034] 实施例1本发明检测方法
[0035] 1仪器、材料与药材
[0036] 1. 1 仪器
[0037] SSI series 1500高效液相色谱仪（奥泰公司，紫外检测器，CSChrom Plus色谱 工作站）；Angilent Technologies 1200Series(紫外检测器）；BP211D型电子天平（德 国Sartorius公司）；紫外-可见分光光度仪（UV1100,上海天美科学仪器有限公司）， KQ-600DE型数控超声波清洗器（40K Hz，600W);优普UPT系列超纯水器（成都优普电子产 品有限公司）；电热恒温水浴锅DSY-1-4孔（北京国华医疗器械厂）；ZF-90型暗箱式紫外 透射仪（上海顾村电光仪器厂）。
[0038] 1. 2 材料
[0039] 色谱柱 Kromasil C18 (200mmX4. 6mm，5 μ m)，S/N: 18201306 (中国 TIANHE)、 Wondasil? C18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)，S/N: 3D8702-23、 Inertsil? 0DS-3(250mmX4.6mm，5ym)，S/N:lA7133271 ;石英比色皿（JB760-68 标准）；甲醇、乙腈为 色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
[0040] 1. 3 药材
[0041] 胡芦巴药材于2012年9月1日购自成都荷花池药材市场，由四川大学刘海峰博士 鉴定为豆科植物胡芦巴（Trigonella foenum-graecum L.)的干燥成熟种子，标本存放于成 都中医药大学药学院中药化学实验室，标本编号为HLB-20120901-HHC。胡芦巴总皂苷提取 物共四批，其中二批由成都合盛有限公司提供，标本存放于成都中医药大学药学院中药化 学实验室，标本编号为HLBZZG-20131128-HS-1、HLBZZG-20131128-HS-2 ;另外两批由实验 室自制HLBZZG-20121010-ZZ;HLBZZG-20131107-ZZ。薯蓣皂苷元对照品（1.中国药品生物 制品检定所，批号：111539-200001 ;2.实验室自制，纯度达到98%以上）。
[0042] 2含量测定
[0043] 2. 1色谱条件的选择
[0044] 色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱： TIANHEKromasil C18(200mmX4.6mm，5ym)，S/N:18201306 ;流动相：甲醇（B)-水（A) [90:10];流速：1.0ml/min ;柱温：35°C ;进样量：10μ 1。
[0045] 2. 1. 1测定波长的考察
[0046] 根据薯蓣皂苷元的结构考虑，其为一种留烯醇（C27H420 3)，醇羟基和双键分别在A、 B环内，无共轭结构，不能在长波长下检测。参考以往文献的检测方法，因此考察203nm、 205nm、210nm下供试品溶液的吸收情况。结果表明，以203nm波长下的信息量较丰富而且色 谱峰的表观丰度高，具有最佳的信噪比和最小干扰，因此以203nm作为检测波长。结果如图 1，2。
【权利要求】
1. 一种胡芦巴总皂苷提取物的质量检测方法，其特征在于：它是以薯蓣皂苷元为总皂 苷水解产物中的指标成分，采用高效液相色谱法进行检测，其中，色谱条件为： 色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE Kromasil C18(200mmX4. 6mm, 5μπι)，S/N:18201306 ;流动相：甲醇（B)_ 水（A) [0-30min:90 % B ; 30-35min:90% B-100% B ;35-60min:100% B];流速：0· 8-1. Oml/min ;柱温：30-4(TC;进样 量：1〇μ 1 ;检测波长为：203-210nm。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的检测波长为203nm ;所述的柱 温是35°C ;所述的流速：1. Oml/min。
3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤： a、 对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，置容量瓶中，加入甲醇充分溶 解后，定容至刻度，制备成浓度为1.080mg/ml的对照品溶液，备用； b、 供试品溶液的制备：取胡芦巴总皂苷提取物，加入总皂苷提取物量10-90倍的 5% -25%硫酸溶液，超声处理使溶解，于100°C恒温水浴中回流水解1-5小时，期间每隔lh 取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀 用水洗至中性，即得水解产物；水解产物用甲醇溶解并定容，摇匀，0. 45 μ m微孔滤膜滤过， 取续滤液作为供试品溶液； c、 将供试品溶液注入液相色谱仪，测定薯蓣皂苷元的含量。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：b步骤加入总皂苷提取物量30-40倍 的15%硫酸溶液；所述的水解时间为4小时。
【文档编号】G01N30/02GK104062372SQ201410289093
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】邓赟, 李秀茹, 刘海峰, 姚晨 申请人:成都合盛生物技术有限公司