抗pml蛋白核定位信号抗体的制备及其在apl诊断中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种抗PML蛋白核定位信号（NLS）抗体的制备及其在APL诊断中的应用。该抗体以SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作为免疫原制备得到。该抗体可用于区分PML蛋白和缺失核定位信号的PML蛋白，以及应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。另外，本发明还提供一种PML蛋白的定位方法。由此，为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础；同时，区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制，提供了新的依据。
【专利说明】抗PML蛋白核定位信号抗体的制备及其在APL诊断中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，特别涉及一种抗PML蛋白核定位信号(NLS)抗体的制备及其在APL诊断中的应用。
【背景技术】
[0002]急性早幼粒细胞白血病(APL)的发生与染色体易位密切相关，95%以上的APL为特征性的染色体t(15，17)易位，形成并表达PML-RARa融合蛋白。研究发现，PML-RARa融合蛋白可以被中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)切割成约52KDa和61KDa大小的两种变异蛋白。由于NE酶的这一特异性的切割作用，产生了一种缺失核定位信号(nuclear localizat1n signal, NLS)的突变型PML蛋白即PML(NLS-)蛋白和带上核定位信号的NLS-RARa蛋白。
[0003]PML蛋白作为一种肿瘤生长抑制因子，对不同组织起源肿瘤的发生发展具有一定抑制作用，PML基因的失活能够明显促进白血病的发生，同时PML蛋白参与多条凋亡途径以及DNA损伤修复。由于PML参 与形成PML-RAR α融合蛋白在APL的发生发展中扮演着重要的角色，对PML与肿瘤形成方面的研究越来越激烈。在正常细胞中，PML蛋白主要分布于细胞核内呈斑点状，属于核体(nuclear bodies, NBs)亚核区域的成分。只有个别PML蛋白如PMLVI b、PML Vll b，因缺乏NLS而定位于胞浆。PML蛋白具有内在的抗病毒活性，具有抑制肿瘤的生长、参与造血祖细胞分化、调苄基因转录、诱导细胞凋亡等多种生物学功能，所有这些功能的发挥与PML蛋白NBs内定位息息相关。而PML蛋白定位于NBs有赖于其自身的NLS序列，通过NLS介导PML蛋白入核，从而参与NBs的形成发挥其正常生物学功能。
[0004]所有PML蛋白的亚型均含有相同N-末端区域，即RBCC (ring finger, B-box,coiled-coil domain,总称RBCC)结构域，PML(NLS-)蛋白也含有RBCC结构域。目前，国际上普遍采用合成PML蛋白N-末端或者RBCC结构域部分多肽作为免疫原，免疫家兔或小鼠来制备特异性抗体，这样获得的抗体不仅能特异性检测野生型PML蛋白，同时也能检测PML(NLS-)蛋白，不能对二者进行区分。
[0005]因此，选择合适的特异性序列多肽作为免疫原，制备能有效区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白的抗体异常重要，可为APL临床诊断提供新的依据。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明提供一种能有效区分野生型PML蛋白与PML (NLS-)蛋白的抗体。
[0007]为实现上述目的，发明人经反复研究，创造性的发现以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作为免疫原可制备得到抗PML蛋白核定位信号抗体，能区分野生型PML蛋白与PML(NLS-)蛋白。具体地，本发明要求保护:
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
[0008]SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列与KLH的偶联复合体作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
[0009]上述制备得到的抗体在区分PML蛋白(野生型PML蛋白)和缺失核定位信号的PML蛋白(PML(NLS-)蛋白)中的应用。
[0010]一种PML蛋白特异性抗体，所述抗体为抗PML蛋白核定位信号抗体，由SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列作为免疫原制备得到。
[0011]本发明还提供一种PML蛋白特异性抗体的制备方法，该抗体可区分野生型PML蛋白与PML (NLS-)蛋白，可广泛用于APL研究和临床诊断中。
[0012]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
一种PML蛋白特异性抗体的制备方法，包括以下步骤:
(O制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联；
(3 )制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体。
[0013]进一步，所述步 骤(3 )的免疫由首次免疫和加强免疫组成，首次免疫辅助采用完全福式佐剂，加强免疫辅助采用不完全福式佐剂。
[0014]上述制备的PML蛋白特异性抗体可应用于急性早幼粒细胞白血病诊断剂的制备中。
[0015]此外，本发明还提供一种PML蛋白的定位方法，该方法可定位PML蛋白的胞内位置，为PML蛋白的相关研究开辟新的途径。
[0016]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
一种PML蛋白的定位方法，包括以下步骤:
(O制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联；
(3 )制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体；
(4 ) PML蛋白定位:用上述制备的抗体血清，采用间接免疫荧光检测PML蛋白在胞内定位。
[0017]进一步，所述步骤(4)中，间接免疫荧光检测包括以下步骤:取靶细胞，转染前12h，将细胞按1x10 5/孔铺于24孔板中，转染48h后，弃去培养基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次，再用0.1% Triton透膜处理1min ;然后，用10%山羊血清室温封闭30min，加上抗体血清，4 °C过夜，PBS洗3次，加罗丹明标记的山羊抗鼠荧光二抗，37°C孵育Ih ;再PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min, PBS漂洗3次，用70%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。
[0018]进一步，所述抗体血清和山羊抗鼠荧光二抗均为1:200倍体积稀释。
[0019]本发明的有益技术效果是:
本发明通过分析PML蛋白NLS序列免疫原性，合成NLS多肽，以此多肽作为免疫原，制备了抗PML蛋白抗体，为进一步研究PML在基因转录层面诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤生长奠定了基础；同时，区别检测了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，为APL临床诊断以及深入研究APL的发病机制，提供了新的依据。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为NLS-RARa在宿主菌BL21中表达的检测结果；
图2为ELISA检测抗体效价(初次免疫)结果；
图3为ELISA检测抗体效价(加强免疫)结果；
图4为Western blot验证抗体特异性结果；
图5为间接免疫荧光验证抗体特异性——过表达PML蛋白免疫荧光结果；
图6为间接免疫荧光验证抗体特异性——正常人与M3型病人中性粒细胞免疫荧光结
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【具体实施方式】
[0021]以下参照附图对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行。
[0022]材料 1.1质粒、菌株和动物
E.coli BL21菌由重庆医科大学临床诊断实验室保存。
[0023]原核表达质粒PET-His-NLS-RARa 的构建:以 PCMV-HA-NLS-RARa 质粒为模板，分别以 Dl:5’ -TTA GGATCC ACAGTCAGTGCCCGGGC-3’ p2:5? -GCC AAGCTTTCACGGGGAGTGGGTGGC-3 ’为上下游引物，PCR扩增NLS-RAR α基因并在其两端分别弓丨入BamH和Hind酶切位点(下划线部分)，将其插入原核表达载体pET-his中，构建原核表达质粒pET-his-NLS-RARa，经酶切和测序验证其构建正确。真核表达质粒PCMV-HA-PML的构建参照文献《人联苯样水解酶(BPHL)在急性早幼粒细胞白血病发生中的分子机制研究》(初晨，重庆医科大学硕士学位论文，2012年5月)。PCMV-HA-PML(NLS-)的构建参照文献《RANBP9在急性早幼粒细胞白血病发生中的作用研究》(黎亮，重庆医科大学硕士学位论文，2012年5月)。PCMV-HA-NLS-RARa的构建参照文献《带核定位信号的维甲酸受体与Ubiquilinl蛋白相互作用的验证》(朱丹等，中南大学学报(医学版)，2010年07期)。
[0024]清洁级健康雄性BLAB/ c小鼠,6~8周龄,体重18~22 g,购自重庆医科大学实验动物中心。
[0025]1.2主要试剂
匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和牛血清白蛋白(albumin bovineserum albumin, BSA)完全福氏佐剂及不完全福氏佐剂、辣根酶标记山羊抗大鼠IgG均购自北京鼎国生物公司；N1-NTA spin kits蛋白纯化试剂盒购自Qiagen公司。蛋白Marker购自美国Fermentas公司；红细胞裂解液、人外周血中性粒细胞分离液购自天津灏洋生物；RIPA细胞裂解液、核染料DAPI，均购自碧云天生物技术研究所；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠的IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)和标记的羊抗兔IgG和罗丹明(TRITC)标记的羊抗鼠IgG均购自北京中山金桥生物技术有限公司。其它所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0026]1.3标本来源
急性早幼粒细胞白血病病人血(初诊)及正常人血皆由重庆医科大学附属第一医院提供，病人为18-35岁女性。正常人血来源于24岁男性。
[0027]实验步骤及结果
2.1原核表达NLS-RARa蛋白制备
蛋白的诱导表达与纯化:将原核表达质粒PET-His-NLS-RAR α转化宿主菌BL21 (DE3)，诱导温度为37°C，诱导时间4 h，IPTG I mmol/L，超声裂解，离心后分别取沉淀和上清电泳。纯化时采用镍柱亲和层析法进行非变性条件下纯化:溶菌酶+超声裂解法裂解细菌，Smmol /I,咪唑浓度挂柱纯化，10mmol /I,和 20mmol/L 洗漆，250mmol/L 和 300mmo1 /I,洗脱。
[0028]Western blot鉴定蛋白:200 ng/孔纯化蛋白，12.5%的分离胶SDS-PAGE电泳，电泳后转至PVDF膜，封闭液封闭I h (5%脱脂奶粉的TBST液)，Ant1-His抗体按1:1 000稀释4 1:孵育过夜，二抗山羊鼠IgG按1:2000稀释，室温孵育I h，最后应用ECL化学发光法显色。
[0029]检测及结果:米用I?春红膜染色和Western blot对外源蛋白NLS-RARa进行检测，在37 °C诱导条件下，转化PET-Hi s-NLS-RAR α质粒的菌株内检测到有外源蛋白NLS-RARα的表达,蛋白分子量大小61KDa,与预期分子量大小相符，而未经诱导组则检测不到相应蛋白的表达。检测结果见图1，图中代号为:A:丽春红染色；B:ffestern blot ；M:蛋白marker ；1:未诱导上清；2:未诱导沉淀；3:诱导组上清；4:诱导组沉淀；5:阴性对照组；6:阳性对照组。 [0030]2.2 NLS序列分析及免疫原的制备
NLS多肽制备:从Gene Bank中获取PML蛋白全长560个氨基酸，其中NLS序列位于476到490之间，其序列为CKRKCSQTQCPRKVIK。采用Fmoc固相合成法，在AB1-431A多肽合成仪上进行合成，使用HPLC进行纯化。
[0031]分析:采用DNAstar软件对NLS序列进行分析,其中易形成二硫键,因此合成两条多肽，多肽信息见表1。
[0032]表1合成NLS多肽信息
【权利要求】
1.一种PML蛋白特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (O制备多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联； (3 )制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的PML蛋白特异性抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)的免疫由首次免疫和加强免疫组成，首次免疫辅助采用完全福式佐剂，加强免疫辅助采用不完全福式佐剂。
3.权利要求1或2制备的PML蛋白特异性抗体在制备急性早幼粒细胞白血病诊断剂中的应用。
4.一种PML蛋白的定位方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备多肽:合成SEQID NO:1所示的氨基酸序列； (2)制备多肽偶联复合体:采用戊二醛连接法，将纯化后的多肽与KLH交联； (3 )制备抗体血清:以多肽偶联复合体作抗原，免疫家兔或小鼠制备抗体血清，分离，即得PML蛋白特异性抗体； (4 ) PML蛋白定位:用上述制备的抗体血清，采用间接免疫荧光检测PML蛋白在胞内定位。
5.根据权利要求4所述的PML蛋白的定位方法，其特征在于，所述步骤(4)中，间接免疫荧光检测包括以下步骤:取靶细胞，转染前12h，将细胞按MO 5/孔铺于24孔板中，转染48h后，弃去培养基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次，再用0.1% Triton透膜处理10 min ;然后，用10%山羊血清室温封闭30min，加上抗体血清，4°C过夜，PBS洗3次，加罗丹明标记的山羊抗鼠荧光二抗，37°C孵育Ih ;再PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min, PBS漂洗3次，用70%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。
6.根据权利要求5所述的PML蛋白的定位方法，其特征在于:所述抗体血清和山羊抗鼠荧光二抗均为1:200倍体积稀释。
7.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
8.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列与KLH的偶联复合体作为免疫原在制备抗PML蛋白核定位信号抗体中的应用。
9.权利要求7或8所述的抗体在区分PML蛋白和缺失核定位信号的PML蛋白中的应用。
10.一种PML蛋白特异性抗体，其特征在于:所述抗体为抗PML蛋白核定位信号抗体，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作为免疫原制备得到。
【文档编号】G01N33/574GK104031149SQ201410267344
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】刘北忠, 阳小群, 蒋开玲, 钟梁 申请人:重庆医科大学附属永川医院