磺胺类药物的快速筛查方法
【专利摘要】本发明公开了一种磺胺类药物的快速筛查方法。本发明磺胺类药物快速筛查方法适用于霜剂、膏剂、乳剂、溶液剂、凝胶剂等化妆品及胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、口服液等止咳平喘类中成药和保健食品的快速检测，大大提高了检测通用性和检测效率。本发明方法具有操作简单、专属性强、灵敏度高、准确度高、技术适用、环保安全等特点，可在现场对非法添加的磺胺类化学成分进行快速检测，符合推广应用的相关原则和要求。经过简单培训即可实施该方法，每个样品的检测时间小于5分钟，每次检测成本约为10～20元。该方法漏检率为0，误检率为0，正确率为100%，检出限小于30μg/g。
【专利说明】磺胺类药物的快速筛查方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于磺胺类药物的检测【技术领域】，特别涉及中成药、保健食品和化妆品非 法添加的磺胺类药物的通用快速筛查方法。
【背景技术】
[0002] 临床研究表明，磺胺类药物具有抗菌消炎功效，在抗风湿类、抗菌类和止咳平喘类 中成药和保健食品以及祛痘类(抗粉刺、除螨)化妆品中可能添加。我国化妆品卫生规范、欧 盟化妆品规程、日本药事法等均明确规定了磺胺类药物为化妆品组分中禁用物质。国家局 在2011年05月25日发布的"关于严厉打击保健食品化妆品非法添加行为的通知"（国食 药监稽[2011]223号)中公布了化妆品中易非法添加的物质，其中包括21种磺胺，检测国家 标准为《化妆品中二i^一种磺胺的测定》（GB/T24800. 6- 2009)。磺胺类药物在畜禽养殖抗 感染治疗过程中使用比较普遍，在健康产品中非法添加的情况并不多，国内外文献很少报 道。由于磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，长期使用可能导致在人体中蓄积， 进而对人体机能产生危害，并导致病原体产生抗药性，有必要建立非法添加的快筛方法。
[0003] 目前关于磺胺类药物快速检测的研究报道主要集中在食品、生物、环境等样品的 残留成分方面，包括薄层色谱法、光谱法、免疫分析等。我国农业部规定用于监测猪肉中磺 胺类药物残留的快速检测方法为酶联免疫法，该方法影响因素较多，容易出现假阳性结果。 在非法添加方面，汕头市药品检验所开发了化妆品中磺胺类成分的理化快筛方法。理化快 筛方法是利用待测化学成分的溶解度、功能图等物理或和化学性质与基质成分的不同，通 过样品前处理技术排除基质干扰，再根据待测化学成分的理化性质进行定性分析。由于理 化快筛方法大多数利用待测成分的官能团发生某类特殊化学反应来达到鉴别的目的，容易 受基质影响，对前处理方法要求较高，适合常量分析，一般不能检测浓度太低的待测成分。
[0004] 与理化快筛方法不同，胶体金免疫技术具有高专属性和高灵敏度，适合微量和痕 量分析。由于胶体金免疫分析技术简单快速、结果准确、专属性强、环保安全、适合现场操 作，是快筛方法的主要发展方向之一。磺胺类胶体金免疫分析方法在食品残留物检测领域 已有广泛的应用，但在中成药、保健食品和化妆品非法添加检测领域还未见报道。到目前为 止，非法添加的快筛方法都是按照功能分类后研发的，一类健康产品的一类化学成分用一 种快筛方法。国内外已经开发了大量单一磺胺成分的残留检测胶体金试纸，如磺胺甲噁唑、 磺胺啼陡、磺胺对甲氧啼陡、磺胺邻二甲氧啼陡、磺胺喹[I惡啉等，单一磺胺成分胶体金试纸 的特异性较强，应用范围不广。
[0005] 本发明研发出高效的磺胺类药物通用胶体金快速筛查方法，即一种快筛方法同时 检测在不同类型健康产品中添加的同一类化学成分。通用快筛方法用于检测不同类型健康 产品中某类化学成分面对的主要问题是基质差异和目标成分浓度差异。对于磺胺类化学成 分快筛方法，中成药和保健食品的基质与化妆品的基质就存在明显区别，磺胺在其中的浓 度也差别较大。化妆品的主要基质为油脂、表面活性剂等，中成药和保健食品的基质则相比 复杂得多。作为口服制剂，以磺胺甲噁唑片和复方磺胺甲噁唑片为例，用于抗菌功能临床推 荐剂量为500mg/次和400mg/次，在胶囊剂和片剂中的浓度一般超过25%，在丸剂的浓度一 般超过1%。作为外用制剂，以磺胺嘧啶银软膏为例，用于抗菌功能的临床推荐规格为1%。两 者的磺胺浓度相差25倍以上。因此，中成药、保健食品与化妆品需要分别采取不同的前处 理方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中成药、保健食品和化妆品非 法添加的磺胺类药物的通用快速筛查方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 磺胺类药物的快速筛查方法，包括如下步骤： 1) 取样； 2) 将待检样品加入提取剂中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 3) 吸取上层溶液，滴加至PBS溶液中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 4) 吸取步骤3)获得的上层溶液，滴加于磺胺类药物胶体金检测卡的加样孔中； 5) 加样3?5分钟后，根据检测卡的C线和T线显色情况判读结果。
[0008] 优选的，取样方法如下： ① 化妆品：固体、半固体剂型，取0. 1?0. 5g ;水剂，取0. 1?0. 5mL ; ② 中成药或保健食品：胶囊剂，取1/4?1粒内容物；片剂，压碎成粉末，取1/4?1片 量；丸剂、颗粒剂、散剂，取每次服用量的1/8 ; 口服液，取0. 1?0. 5mL。
[0009] 优选的，所述提取剂为0. 05?0. 2mol/L的盐酸或1%?5%的氢氧化钠溶液。 [0010] 优选的，所述提取剂为〇· 05?0· 2mol/L的盐酸。
[0011] 优选的，步骤2)，将待检样品加入1.0?2. OmL提取剂中。
[0012] 优选的，步骤3)，滴加2?3滴至5?10mL PBS溶液中。
[0013] 优选的，步骤4)，滴加2?3滴于加样孔中。
[0014] 优选的，步骤5)，检测结果判读方法如下： ① 阴性：T线和C线都显色； ② 阳性：Τ线无显色、C线显色； ③ 无效：c线未显色，将待检样品稀释后重新检测。
[0015] 磺胺类药物胶体金检测卡的制备方法，包括以下步骤： 1) 分别将磺胺类抗原、羊抗鼠 IgG喷在硝酸纤维素膜上，作为T线和C线，烘干，得包被 膜； 2) 制备胶体金标记的磺胺单克隆抗体复合物，将其包被在聚酯膜或玻璃纤维上，得到 金标结合垫； 3) 制备样品塾； 4) 检测卡的组装：磺胺类药物胶体金检测卡由PVC模板和PVC背板组成，在PVC背板 上按顺序粘上样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫。
[0016] 本发明的有益效果是： 1)本发明磺胺类药物快速筛查方法适用于霜剂、膏剂、乳剂、溶液剂、凝胶剂等化妆品 及胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、口服液等止咳平喘类中成药和保健食品的快速检测， 大大提高了检测通用性和检测效率，同时也为建立在多类健康产品中非法添加抗生素、激 素类等化学成分的通用快筛方法提供示范性研究。
[0017] 2)本发明方法具有操作简单、专属性强、灵敏度高、准确度高、技术适用、环保安全 等特点，可在现场对非法添加的磺胺类化学成分进行快速检测，符合推广应用的相关原则 和要求。
[0018] 3)本发明属便携式现场检测技术，可产品化为快速筛查试剂盒。经过简单培训即 可实施该方法，每个样品的检测时间小于5分钟，每次检测成本约为10?20元。
[0019] 4)该方法操作安全，无致癌、剧毒、高毒、易燃易爆试剂，不使用有机溶剂。
[0020] 5)该方法漏检率为0,误检率为0,正确率为100%。
[0021] 6)本发明快筛方法检出限小于30 μ g/g (小于临床推荐剂量的1/300)。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是磺胺类药物胶体金检测卡的操作示意图； 图2是磺胺类药物胶体金检测卡筛查结果判定示意图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐述本
【发明内容】
。
[0024] 磺胺类检测卡其相关材料的制备： 磺胺类半抗原制备方法是： 称取对乙酰氨基苯磺酰氯8. 5g和氨基苯甲酸甲酯3. 5g于50mL的锥形瓶中，加入吡 啶28mL，搅拌使其充分溶解，通风橱中安装回流装置，温度达到100度时，回流lh，室温冷却 后，冰浴持续搅拌lh，有黄色沉淀产生。收集反应液离心，将沉淀用20mL 2mol/L NaOH溶解 后，煮沸去吡啶，继续回流lh室温冷却后，用4mol/l盐酸调pH至4,有灰色沉淀产生。再收 集反应液离心，l〇〇〇〇r/ S离心15分钟，用40mL的蒸馏水重悬，乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸 乙酯层，减压，干燥。
[0025] 磺胺母核全抗原的合成： 取磺胺类半抗原4mg溶于0. 4mL二甲基甲酰胺，再加入20mg的EDC，搅拌溶解，分成等 体积两份；BSA和0VA各称取10mg，分别用1. 5mL的0. 01m〇l/L pH7. 4的PBS溶解，再分别 加入前面两份溶液中，分别用〇. 01m〇l/L PH7. 4的PBS透析3天，8h换一次透析液，制得包 被抗原和免疫抗原。
[0026] 磺胺类抗体的制备： 用磺胺类载体蛋白结合的免疫抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫剂量为200ug/ 次，采用快速佐剂，背部皮下注射。首次免疫，用磺胺类载体蛋白免疫抗原与等体积费氏完 全佐剂1:1混合，充分混匀，3周后加强免疫；加强免疫，用磺胺类载体蛋白免疫抗原与等体 积费氏不完全佐剂1:1混合，充分混匀，连续免疫2次，每次间隔3周，最后一次免疫后10? 15天端尾采血并分离血清，采用间接ELISA法测定多抗血清效价，结果测定抗体血清效价 在 1:8000 ?1:10000 之间。
[0027] 取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌磺胺类的阳性细胞株并扩 大培养，注射进小鼠体内诱导腹水；抽取腹水后采用辛酸硫酸铵法纯化，-20度保存。
[0028] 羊抗鼠 IgG的制备： 以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体作为免疫原免疫健康的山羊，得到羊抗鼠 IgG。
[0029] 磺胺类药物胶体金检测卡的特征在于：在PVC板上依次衔接样品垫、金标结合垫、 包被膜和吸水垫。
[0030] 磺胺类药物胶体金检测卡的制备： 制备方法如下： 1) 包被膜的制备 用0· 01M Tris-HCl (ρΗ8· 0)缓冲液将磺胺类包被抗原稀释到0· 5?1. Omg/mL，喷至 硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30 μ L，为检测线（T线）；羊抗鼠 IgG稀释到0. 3mg/mL? 0. 5mg/mL，喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30 μ L，为控制线（C线)，C、T线的间距为 4. 5mm ;烘箱45°C中烘干，得包被膜； 2) 金标结合垫的制备 用高纯水将氯金酸稀释至浓度0. 01% (体积比)，磁力搅拌加热煮沸，每100mL氯金酸中 迅速加入0. 7mL的柠檬酸三钠，继续煮沸，至颜色保持红色不再发生改变停止加热，冷却至 室温后补充损耗的高纯水，得胶体金溶液； 取颗粒半径为20nm?40nm的胶体金溶液，调pH到7. 5?8. 0,在搅拌下按10 μ g抗 体/mL胶体金溶液加入磺胺类单克隆抗体，最后每lmL加入lOOyL 10%BSA使其稳定， 12000rpm离心30min，弃上清液，将沉淀用十分之一倍初始胶体金体积的溶液(含0. 01M Tris (ρΗ8· 5)、2%?5%蔗糖、2%BSA、0. 1%。?0· 5%。NaN3)重悬，得磺胺单克隆抗体-胶体 金复合物； 将磺胺单克隆抗体-胶体金复合物用〇. 01M Tris-HCl(pH8. 0)、2%?5%蔗糖、5% BSA、 1%。?5%〇TritonX-100、0· 5%?1%胆酸、0· 1%。?0· 5%〇NaN3溶液稀释至5%?10%，取玻璃纤 维，每张涂布30mL，烘干，得金标结合垫；或者把磺胺单克隆抗体-胶体金复合物每100 μ L 用 0· 01Μ Tris-Hcl (ρΗ8· 0)缓冲液、5%BSA，0. 1%。?0· 5%。NaN3 稀释至 150 ?300 μ L，再 加20%蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上，烘干，得金标结 合垫； 3) 样品垫的制备 取玻璃纤维，涂布 20 ?30mL 的含 0· 01Μ Tris-HCl (ΡΗ8. 0)、1% BSA、1% TWEEN-20、 0. 1%。?0. 5%。NaN3 的溶液，37°C烘干。
[0031] 4)检测卡的组装 检测卡的组装：磺胺类药物胶体金检测卡由PVC模板和PVC背板组成，在PVC背板上按 顺序粘上样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫；样品垫压金标结合垫2-4cm，金标结合垫 压膜l-2cm，吸水纸压膜l-2cm。包被膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线、控制线。 用衔接胶带把样品垫、金标结合垫及NC膜衔接起来，胶带压膜2-3cm。用切割机将贴好的板 切割成3mm宽的条。PVC模板包括加样孔（S)、检测区、控制区，其盖于PVC背板上，加样孔 (S)对应于样品垫，检测区能显示检测线（T)，控制区能显示控制线（C)。将制成的检测卡放 入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
[0032] 磺胺类药物的快速筛查方法(参见图1)，包括如下步骤： 1)取样； 2) 将待检样品加入提取剂中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 3) 吸取上层溶液，滴加至PBS溶液中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 4) 吸取步骤3)获得的上层溶液，滴加于磺胺类药物胶体金检测卡的加样孔中； 5) 加样3?5分钟后，根据检测卡的C线和T线显色情况判读结果。
[0033] 取样方法如下： ① 化妆品：固体、半固体剂型，取〇. 1?〇. 5g ;水剂，取0. 1?0. 5mL ; ② 中成药或保健食品：胶囊剂，取1/4?1粒内容物；片剂，压碎成粉末，取1/4? 1片量；丸剂、颗粒剂、散剂，取每次服用量的1/8 ; 口服液，取0. 1?0. 5mL。
[0034] 胶体金免疫反应需要在水溶液中进行，因此需通过前处理方法从待检样品中提取 出待测化学成分，然后在适当的溶液介质中进行反应。发明人发现，由于待检样品中非法添 加的磺胺类化学成分往往浓度较高，因此只需要选择适当的溶剂将样品中常量至微量的磺 胺物质提取并稀释成微量至痕量的浓度即可。本发明优选〇. 05?0. 2mol/L的盐酸或1%? 5%的氢氧化钠溶液作为提取剂。更优选的，以0. 05?0. 2mol/L稀盐酸溶液作为提取剂。
[0035] 优选的，步骤2)，将待检样品加入1. 0?2. OmL提取剂中。
[0036] 优选的，步骤3)，滴加2?3滴至5?10mL PBS溶液中。
[0037] 优选的，步骤4)，滴加2?3滴于加样孔中。
[0038] 磺胺类药物胶体金检测卡筛查结果判读方法如下(参见图2): ①阴性（-):T线和C线都显色，表示样品中不含磺胺类化学成分（即磺胺类药物浓度 低于检出限)。
[0039] ②阳性（+ ) :Τ线无显色、C线显色，表示样品中含磺胺类化学成分（即磺胺类药物 浓度高于检出限)。
[0040] ③无效：未出现C线，表明检测卡失效或样品基质过载，可将样品溶液再稀释10倍 后更换检测卡测定。
[0041] 注意事项： (1)胶体金检测卡的贮存和使用条件为4?30°C。
[0042] (2)结果判断时，若滴加样品溶液于检测卡的加样孔中后马上出现C线和T线，即 可判断结果为阴性；若只出现C线，则要等3分钟后再读取结果。
[0043] (3)胶体金快筛方法灵敏度非常高，在操作过程中要避免样品交叉污染，涉及的检 测卡及吸管等辅助工具均为一次性使用。
[0044] 实施例1提取溶剂的选择 磺胺类化学成分一般易溶于稀盐酸或氢氧化钠溶液，难溶于水。磺胺类胶体金免疫分 析方法的检测限低于〇. 1 μ g/mL( 100ng/L)，故分别选择水、稀盐酸溶液、稀氢氧化钠溶液作 为提取剂，不同pH值的PB (磷酸盐缓冲液)、roS (磷酸盐缓冲生理盐水）和PBST (磷酸盐 缓冲生理盐水中加吐温)缓冲液进行试验。经试验得出采用0.05?0.2 mol/L稀盐酸溶液 作为提取剂，〇. 01m〇l/L、pH7. 2的PBS作为缓冲液介质，胶体金免疫反应的显色结果较其 他介质重现性较好，且稳定，结果见表1。
[0045] 表1提取剂的选择对T线显色深度的对比结果表
【权利要求】
1. 磺胺类药物的快速筛查方法，包括如下步骤： 1) 取样； 2) 将待检样品加入提取剂中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 3) 吸取上层溶液，滴加至PBS溶液中，振摇混匀，静置至上层溶液澄清； 4) 吸取步骤3)获得的上层溶液，滴加于磺胺类药物胶体金检测卡的加样孔中； 5) 加样3?5分钟后，根据检测卡的C线和T线显色情况判读结果。
2. 根据权利要求1所述的快速筛查方法，其特征在于：取样方法如下： ① 化妆品：固体、半固体剂型，取〇. 1?〇. 5g ;水剂，取0. 1?0. 5mL ; ② 中成药或保健食品：胶囊剂，取1/4?1粒内容物；片剂，压碎成粉末，取1/4?1片 量；丸剂、颗粒剂、散剂，取每次服用量的1/8 ; 口服液，取0. 1?0. 5mL。
3. 根据权利要求1所述的快速筛查方法，其特征在于：所述提取剂为0. 05?0. 2mol/ L的盐酸或1%?5%的氢氧化钠溶液。
4. 根据权利要求3所述的快速筛查方法，其特征在于：所述提取剂为0. 05?0. 2mol/ L的盐酸。
5. 根据权利要求1?4任意一项所述的快速筛查方法，其特征在于：步骤2)，将待检样 品加入1. 0?2. OmL提取剂中。
6. 根据权利要求1所述的快速筛查方法，其特征在于：步骤3)，滴加2?3滴至5? 10mL PBS溶液中。
7. 根据权利要求1所述的快速筛查方法，其特征在于：步骤4)，滴加2?3滴于加样孔 中。
8. 根据权利要求1所述的快速筛查方法，其特征在于：步骤5)，检测结果判读方法如 下： ① 阴性：T线和C线都显色； ② 阳性：Τ线无显色、C线显色； ③ 无效：C线未显色，将待检样品稀释后重新检测。
9. 根据权利要求1?8任意一项所述的快速筛查方法，其特征在于：磺胺类药物胶体 金检测卡的制备方法，包括以下步骤： 1) 分别将磺胺类抗原、羊抗鼠 IgG喷在硝酸纤维素膜上，作为T线和C线，烘干，得包被 膜； 2) 制备胶体金标记的磺胺单克隆抗体复合物，将其包被在聚酯膜或玻璃纤维上，得到 金标结合垫； 3) 制备样品塾； 4) 检测卡的组装：磺胺类药物胶体金检测卡由PVC模板和PVC背板组成，在PVC背板 上按顺序粘上样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫。
【文档编号】G01N33/577GK104090107SQ201410261028
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】雷毅, 蔡霞, 黄艳婷 申请人:广东省食品药品检验所