一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法
【专利摘要】本发明采用优化样品处理方法及优化检测条件的UPLC-MS/MS建立了离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性检测方法，同时此方法又可以对8种类固醇类性激素进行定量分析，可以实现一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析，可以比较全面地反映离体鱼性腺内类固醇类性激素的化学组成成分，并且定量分析结果中八种类固醇类性激素的回归方程的相关系数R2均大于0.99，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面地反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
【专利说明】一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学分析检测【技术领域】，具体涉及一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]虽然近年来鳗鲡的人工繁殖初见成果，但对于在其性腺发育过程中性腺组织中的性腺激素含量会在不同阶段，并且随着不同激素的注射而有所改变，尤其是雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、17 α -轻孕酮、17 α , 20 β - 二轻~4~孕烯_3_酮(DHP)、睾酮、表睾酮对鳗鲡的成熟和产卵有着重要的影响。
[0003]在过去30年中，有大量的研究证实，睾酮和DHP 二者相互协调，共同激发着鳗鲡精子的形成；鱼类中，脑垂体分泌GtH，GtH含两种糖蛋白促性性腺激素(即LH和FSH)，进而促进雄鱼血液中DHP和睾酮的分泌来调控性腺的发育与成熟；而在雌鱼中，这两种激素会促进分泌形成雌二醇，雌二醇会进而刺激肝脏合成与分泌卵黄蛋白原；另一方面同样会刺激滤泡颗粒细胞分泌DHP，DHP是诱导卵巢最后成熟与排卵的重要激素。Katsumi Tsukamoto等对捕获的日本鳗鲡通过RIA和TLC法对它们进行血清类固醇激素的检测，发现在日本鳗鱼排卵期间，DHP约lng/ml，而在人工催熟的日本鳗鱼的同一期间没有检测这种类固醇激素，同时在人工繁殖的日本鳗鱼的卵黄发生的中后期检测血清中雌二醇(雌留体类激素)含量为2-3ng/ml，睾酮(精子发生诱导类固醇)在捕获的雄性鳗鱼体内的含量是很高的(2-5ng/ml)，含量类似与人工繁殖的成熟雄鳗中。因此，准确掌握鳗鲡性腺组织中性激素周期性的浓度变化是决定人工繁殖鳗鲡成功与否的关键。
[0004]由于类固醇类激素在离体鱼类性腺中的浓度通常很低，而离体鱼类性腺作为鱼类组织中结构最为复杂的器官，不仅蛋白质含量高，而且油脂含量高，干扰物质多，类固醇类激素作为脂溶性的激素，在提取的过程中很容易损耗。因此，本发明的目的在于建立可靠、稳定的定性定量分析方法，并通过有效的富集、分离和纯化过程实现高灵敏度、高专属性分析，为进一步研究类固醇类激素在鱼类性腺内的代谢及消耗过程奠定基础，为人工繁殖鱼类提供科学方法。
【发明内容】
[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素的方法。所述方法能够对离体鱼类性腺内八种类固醇类性激素:雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17 α -羟孕酮、雌酮、17 α , 20 β - 二羟基_4_孕烯-3-酮(DHP)进行同时分析检测。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面地反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
[0006]为实现上述及其他目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]—种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法，为采用UPLC-MS/MS定性或定量检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素，包括以下步骤:
[0008](I)供试品溶液的制备:称取离体鱼类性腺组织，经前处理，得供试品溶液；
[0009](2)对照品溶液的制备:称取未成熟离体鱼类性腺组织样品，加入类固醇类性激素标准品溶液，经和步骤(I)相同的前处理，得对照品溶液；
[0010](3)测定:采用UPLC-MS/MS分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
[0011]较佳的，所述鱼类为花鳗鲡鱼或河鳗(日本鳗鲡)。
[0012]较佳的，所述类固醇类性激素选自雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17 α-羟孕酮、雌酮或17 α，20 β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)中的一种或多种。
[0013]较佳的，步骤(I)中，所述前处理，包括如下步骤:
[0014]I)将离体鱼类性腺组织样品，加入匀浆介质，匀浆，得匀浆液；
[0015]2)将所得匀浆液超声，离心，冷冻；
[0016]3)将所得冷冻后的样品，离心，取上清液进行过滤，将所得过滤液旋转蒸发浓缩，加步骤I)中所用匀浆介质溶解，静置；
[0017]4)离心，取上清液进行过滤，得续滤液作为供试品溶液。
[0018]较佳的，步骤I)中，所述匀浆介质为乙腈、甲醇中的任一种。
[0019]较佳的，步骤I)中，每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质8_15ml。更佳的，每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质10-15ml。
[0020]所述离体鱼类性腺组织样品称取时，应当精密称取。
[0021]所述甲醇为100%甲醇。
[0022]较佳的，步骤I)中，匀浆时可采用两步匀浆法，亦即，第一步:每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质4-6ml，以5000-10000RPM速度匀浆3_8min，得一次匀浆液；第二步:分离所得一次匀浆液，得一次匀浆液上清液和剩余沉淀，向每Ig剩余沉淀中加入4-6ml的匀浆介质，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min得二次匀浆液，用匀浆介质清洗匀浆机刀头得匀浆机刀头清洗液，最后合并一次匀浆液上清液、二次匀浆液和匀浆机刀头清洗液。
[0023]较佳的，所述两步匀浆法中，第一步中，每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质 4-5ml，以 5000-10000RPM 速度匀浆 3_5min。
[0024]较佳的，所述两步匀浆法中，第二步中，每Ig的剩余沉淀中加入4_5ml的匀浆介质，以 5000-10000RPM 速度匀浆 3_5min。
[0025]较佳的，步骤2)中，超声时间为5-10min。更佳的，超声时间为5min。
[0026]较佳的，步骤2)中，所述离心为:在0-4°C下，3000-5000RMP离心3-8min ;更佳的，所述离心为:在CTC下,4000RMP离心5min。
[0027]较佳的，步骤2)中，所述冷冻为:-20°C?_40°C下冷却2_8h ;更佳的，所述冷冻为在-40°C下冷冻4—6h。
[0028]较佳的，步骤3)中，离心为:在0-4°C的下，以3000-5000RMP离心3-5min ;更佳的，所述离心为:在0°C下，以4000RMP离心4min。
[0029]较佳的，步骤3)中，过滤是指通过脱脂棉进行过滤。
[0030]较佳的，步骤3)中，所述旋转蒸发浓缩的温度为35_50°C ;更佳为40°C。[0031]较佳的，步骤4)中，所述过滤是指:取上清液过滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液。
[0032]较佳的，步骤I)、2)中，采用D-SPE试管⑵；产品信息为:Supertech Q R1A，cat.#55250-1Αο
[0033]较佳的，步骤3)中，加匀浆介质后转移至D-SPE试管(3);产品信息为=SupertechQMl, cat.#55260-1Βο
[0034]较佳的，步骤⑵中，类固醇类性激素标准品溶液的配制方法为:分别精密称取类固醇类性激素标准品适量，加与步骤(I)相同的匀浆介质溶解，得标准品溶液，使标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均相同。更佳的，标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均为 lOOppm。
[0035]较佳的，步骤⑵中，17 α-羟孕酮购自TRC公司，雌三醇购自Fluka公司，其余标准品均购自sigma-aldrich公司。
[0036]较佳的，雌二醇的CAS号为50-28-2 ;雌三醇的CAS号为50_27_1 ;睾酮的CAS号为58-22-0 ;表睾酮的CAS号为481-30-1 ;孕酮的CAS号为57-83-0 ; 17 α -羟孕酮的CAS号为68-96-2 ;雌酮的 CAS 号为 53-16-7 ;17 α，20 β - 二羟基 ~4~ 孕烯-3-酮(DHP)的 CAS 号为1662-06-2。
[0037]较佳的，步骤(3)中，所述定性方法为:采用UPLC-MS/MS在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图，与对照品溶液的色谱图进行比较，根据相对保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z，确认供试品溶液中类固醇类性激素的特征峰，从而对供试品溶液中类固醇类性激素成分进行定性。
[0038]较佳的，所述步骤(3)中，所述定量方法为:采用UPLC-MS/MS在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液和对照品溶液的类固醇类性激素色谱图及其峰面积，按照内标法计算供试品溶液中种类固醇类性激素的含量。
[0039]较佳的，所述内标法是指:分别移取一系列不同体积的类固醇类性激素标准品溶液分别加入到未成熟离体鱼类性腺组织样品中，经与制备供试品溶液时相同的前处理，得一系列不同浓度的对照品溶液。采用UPLC进样分析，获得对照品溶液中类固醇类性激素含量与峰面积的线性关系，以每一种类固醇类性激素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用UPLC检测，将获得的供试品溶液中类固醇类性激素的色谱峰面积，分别代入相应的标准工作曲线的回归方程中，计算可得到相应类固醇类性激素的含量。
[0040]较佳的，类固醇类性激素标准品溶液的配置方法为:分别精密称取类固醇类性激素标准品适量，加与步骤(I)相同的匀浆介质溶解，得标准品溶液，使标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均相同。更佳的，标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均为lOOppm。
[0041]较佳的，步骤(3)中，UPLC所用色谱柱为 xBridge_C18 (IOOmmX 2.1mm, 5 μ m)。
[0042]较佳的，柱温为30?50°C，优选40V。
[0043]较佳的，流速为0.25 ?0.4ml/min,优选 0.30mL/min。
[0044]较佳的，流动相中，A相为0.1%甲酸水溶液(体积百分含量)，B相为0.25mol/L的乙酸铵水溶液，A相与B相的体积比为95:5-0:100。
[0045]较佳的，分析时间为12min，梯度洗脱。
[0046]进一步的，所述梯度洗脱以流动相A相与B相体积比为95:5_0:100梯度变化洗脱。
[0047]优选的，所述梯度洗脱的具体程序为:
[0048]O ?IOmin, A 相:B 相体积比为 95:5_0:100 ；
[0049]10 ?12min, A 相:B 相体积比为 O:100-95:5。
[0050]较佳的，步骤(3)中，MS/MS的色谱条件为:睾酮、表睾酮、孕酮、17α -羟孕酮、DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇、雌三醇均采用负离子模式扫描。
[0051]本发明的有益效果为:
[0052](I)如上所述，本发明采用优化样品处理方法及优化检测条件的UPLC-MS/MS建立了离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性检测方法，同时此方法又可以对8种类固醇类性激素进行定量分析，可以实现一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析。
[0053](2)由于类固醇类激素在离体鱼类性腺中的浓度通常很低，而离体鱼类性腺作为鱼类组织中结构最为复杂的器官，不仅蛋白质含量高，而且油脂含量高，干扰物质多，类固醇类激素作为脂溶性的激素，在提取的过程中很容易损耗。本发明的特殊设计的前处理过程实现了对离体鱼性腺组织内的类固醇类激素的有效富集、分离和纯化，为实现高灵敏度、高专属性分析奠定基础。
[0054](3)为了简化流动相的配制和保护色谱柱，在不影响分离的前提下，我们试验得到了理想的流动相系统:0.lv/v%甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液系统，这种流动相系统在梯度洗脱条件下能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形。
[0055](4)本发明通过对类固醇类性激素的定性和定量分析，可以比较全面的反映离体鱼性腺内类固醇类性激素的化学组成成分，并且定量分析结果中种类固醇类性激素的回归方程的相关系数R2均大于0.99，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面的反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1:图中I列、2列、3列所示分别为空白对照品组溶液的离子流色谱图、对照品组溶液的离子流色谱图、供试品组溶液的离子流色谱图；具体的:A行代表可的松(一种应激反应激素)定性离子流色谱图，B行代表可的松定量离子流色谱图；(:行代表雌三醇定性离子流色谱图；D行代表雌三醇定量离子流色谱图；E行代表雌二醇定性离子流色谱图，F行代表雌二醇定量离子流色谱图；G行代表雌酮定性离子流色谱图，H行代表雌酮定量离子流色谱图；1行代表DHP定性离子流色谱图，J行代表DHP定量离子流色谱图；K行代表17 α -羟孕酮定性离子流色谱图，L行代表17 α -羟孕酮定量离子流色谱图；Μ行代表孕酮定性离子流色谱图，N行代表孕酮定量离子流色谱图；0行保留时间靠前的峰代表睾酮定性离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定性离子流色谱图，P行保留时间靠前的峰代表睾酮定量离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定量离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0057]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。[0058]以下实施例中采用的材料、试剂和仪器如下:
[0059]甲醇、甲酸(分析纯，国药集团)；乙腈(色谱纯，美国天地试剂公司)；雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17 α-羟孕酮、雌酮、17 α，20β-二羟基-4-孕甾烯-3-酮(DHP)(供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；具塞锥形瓶、移液管及其相关玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；色谱柱:xBridge-C18 (250mmX 4.6mm，5 μ m)(沃特世科技有限公司)；超声萃取仪(宁波新芝生物有限责任公司)；WaterS超高效液相系统(ACQUITYUPLC)和三重四级杆串联质谱(XEVO-TQ) ；PL2002型电子天平；均质仪(Polytron，PT2000, Switerland);冷冻离心机(Type3K-18, Sigma, Germany) ;Heidolph 旋转蒸发仪(He1-VAP Value HB) ;Heidolph振动器(Multi Reax);三洋_40°C超低温冰箱；水由纯水仪(Millipore,法国)纯化得到。
[0060]实施例1离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性测定
[0061]I实验部分
[0062]1.1样品前处理
[0063](I)供试品溶液的制备:
[0064]精密称定5.0g的离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于50mL D-SPE试管(2) (SupertechQ RlA, cat.#55250-1Α)，精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆2?4min，分离上清液与剩余沉淀；然后再向沉淀中精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆2?4min，合并两次匀浆的上清液与沉淀至试管(2)中；随后用吸管吸取乙腈清洗刀头，用同一试管(2)下方收集，直至液面到达50mL刻度线；将试管(2)充分混匀震荡，并超声5min ；以4000RMP离心5min，再将试管放置于_40°C冰箱的金属试管套中冷冻4_6h ;将冷冻好的样品在0°C下4000RMP离心4min，从离心好的试管中液体立即取40mL，并通过脱脂棉过滤至到鸡心瓶，在40°C下旋转蒸发至近干；取0.75mL, 70 %乙腈洗涤鸡心瓶，并转移至D-SPE试管(3)(Supertech QMl, cat.#55260_1B)，再用0.75mL，70 %乙腈重复洗涤一次，并转移至同一D-SPE试管(3)，充分混匀后，以静止2min，以4000RMP离心3min，取ImL上清液经微孔滤膜(0.22μπι，特富龙)过滤，取续滤液至1.5mL进样瓶中，作为供试品溶液，用于分析测定。
[0065](2)对照品溶液的制备:
[0066]首先，配制类固醇类性激素标准品溶液:分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17 α-羟孕酮、雌酮、17 α，20 β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，力口乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为lppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为lOOppb。
[0067]精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管
(2)(Supertech Q RlA, cat.#55250_1A),分别向六个(2)试管中加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液50ul、IOOul、250ul、500ul、IOOOul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得一系列每种类固醇类性激素浓度分别为1.00,2.00,5.00，10.00,20.00,40.00ng/g的对照品溶液；
[0068](3)空白对照品溶液的制备:
[0069]精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品，经和供试品溶液相同的前处理，得空白对照品溶液。
[0070]1.2色谱条件[0071]UPLC 的色谱条件为:色谱柱:xfcidge-C18 (IOOmmX 2.1mm, 5 μ m);柱温:40°C ;流速:0.30mL/min ;进样量:10 μ I ;流动相:0.lv/v%甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液，其中，A相为0.lv/v%甲酸水溶液，0.25mol/L乙酸铵水溶液；分析时间:12min ;梯度洗脱。梯度洗脱的具体程序为:
【权利要求】
1.一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法，为采用UPLC-MS/MS定性或定量检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素，包括以下步骤: (1)供试品溶液的制备:称取离体鱼类性腺组织，经前处理，得供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:称取未成熟离体鱼类性腺组织样品，加入类固醇类性激素标准品溶液，经和步骤(1)相同的前处理，得对照品溶液； (3)测定:采用UPLC-MS/MS分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述类固醇类性激素选自雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17 α -轻孕酮、雌酮或17 α，20 β - 二羟基_4_孕烯_3_酮中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述前处理，包括如下步骤: 1)将离体鱼类性腺组织样品，加入匀浆介质，匀浆，得匀浆液； 2)将所得匀浆液超声，离心，冷冻； 3)将所得冷冻后的样品，离心，取上清液进行过滤，将所得过滤液旋转蒸发浓缩，加步骤I)中所用匀浆介质溶解，静置； 4)离心，取上清液进行过滤，得续滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤I)中，所述匀浆介质为乙腈、甲醇中的任一种。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤I)中，每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀衆介质8-15ml。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤I)中，匀浆时可采用两步匀浆法，亦即，第一步:每Ig的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质4-6ml，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min，得一次匀浆液；第二步:分离所得一次匀浆液，得一次匀浆液上清液和剩余沉淀，向每Ig剩余沉淀中加入4-6ml的匀浆介质，以5000-10000RPM速度匀浆3_8min得二次匀浆液，用匀浆介质清洗匀浆机刀头得匀浆机刀头清洗液，最后合并一次匀浆液上清液、二次匀浆液和匀浆机刀头清洗液。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，超声时间为5-10min;所述离心为:在0-4°C下，3000-5000RMP离心3_8min ;所述冷冻为:_20°C~_40°C下冷却2-8h。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，离心为:在0-4°C的下，以3000-5000RMP离心3_5min ;所述旋转蒸发浓缩的温度为35_50°C。
9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，UPLC所用色谱柱为xBridge-C18 ;UPLC所用流动相中，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.25mol/L的乙酸铵水溶液。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，MS/MS的色谱条件为:睾酮、表睾酮、孕酮、17 α -羟孕酮和DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇和雌三醇均采用负离子模式扫描。
【文档编号】G01N30/88GK104020240SQ201410255297
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】林静, 刘利平, 湛嘉 申请人:上海海洋大学