一种新的Gus染色液及其配制方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种新的Gus染色液配制方法，包括以下步骤：1)K3[Fe(CN)6]溶液和K4[Fe(CN)6]溶液的配制；2)PBS磷酸缓冲液的配制：3)染色液的配制方法：将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按顺序依次加入：K3[Fe(CN)6]溶液、K4[Fe(CN)6]溶液、甲醇、10％的Triton-100(曲拉通)、PBS磷酸缓冲液。本发明配制过程相对简单，操作容易。所用试剂都为无毒无害试剂，不会对人体造成伤害，不会污染环境。配制得到的染色液染色效果好，通常染色1小时就能够显色，不需要像其他染色液过夜染色，节省试验时间。
【专利说明】一种新的Gus染色液及其配制方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种在转基因植物中使用的一种新的Gus染色液及其配制方法和应用。
【背景技术】
[0002]gus基因(β_葡萄糖苷酸酶基因)是目前转基因植物中应用最为广泛的报告基因。β -葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可以用多种方法检测出来。绝大多数植物没有葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此gus基因作为报告基因广泛应用在植物基因工程中。以X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞被转入了 gus基因，并表达出Gus，适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
[0003]植物基因工程中常用Gus染色液浸染转基因材料来确定基因转化是否成功或者基因的表达。因此Gus染色液的配制方法是这个过程中非常重要的内容。Gus染色液配制的是否成功，或者染色液效率的高低直接决定整个转基因过程能否顺利进行。目前Gus染色液的配制方法比较多，常用的有两种配制方法。
[0004]第一种配制Gus染色液的方法:
[0005](I)配制X - Gluc母液:X-Gluc，用DMF (N_N_ 二甲基酰胺)配成20mM的贮存液，分装成每管100 μ L，保存于-20°c ；
[0006](2)配制 X - Gluc 基液:
[0007]配制方法:(50mMPBS (磷酸缓冲液)，pH7.0):50mM NaH2P04,0.78g 和 50mMNa2HP04,1.79g共同溶解于100ml无菌去离子水中；Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)(10mM，372mg)，Triton-100 (曲拉通)(0.1%, 100 μ L)，K3[Fe (CN)6](铁氰化钾)(0.5mM, 16.5mg)；K4 [Fe (CN) 6](亚铁氰化钾)(0.5mM,21.lmg)；
[0008](3)配制 Gus 染色液:50 μ L X-Gluc 母液 +450 μ L 基液
[0009]所有过程需要试剂:X - Gluc(5_溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)；DMF(N-N-二甲基甲酰胺)；NaH2P04(磷酸二氢钠)；Na2HP04 (磷酸氢二钠)；Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠);Triton-100 (曲拉通);K3 [Fe (CN) 6](铁氰化钾);K4 [Fe (CN) 6](亚铁氰化钾)。
[0010]这种配制Gus染色液的方法过程繁杂，容易出错，而且在实际配制的过程中容易产生沉淀，有时需要加热溶解，加热的过程会导致N-N-二甲基甲酰胺(DMF)挥发，人体吸入后造成对人体器官的损伤。这种方法配制的Gus染色液，染色效率不高，一般都需要37°C过夜染色，需要等的时间长。这种方法配制的Gus染色液不能够重复使用，在需要检测大批量的材料时，很浪费Gus染色液。这种方法配制的Gus染色液染有些组织比较致密或者是组织比较大的材料比如有些果实或者有的植物的根茎时就不容易上色。经常需要通过切片的方法或者真空渗入法来染色。
[0011]第二种配制Gus染色液的方法:
[0012]第一步先用DMSO (二甲基亚砜)溶解X —Gluc，溶解后的浓度为50mg/mL(毫克每毫升);
[0013]第二步按照所需的浓度依次加入以下试剂配制成ImL的Gus染色液:
[0014]0.5M, Na2EDTA(乙二胺二乙酸二钠)，20 μ L ；TritonX-100,1 μ L ;1Μ，磷酸钠缓冲液(ΡΗ7.0)，100 μ L ；0.1Μ，K3Fe (CN) 6 (铁氰化钾),5 μ L ;0.1Μ，K4Fe (CN) 6 (亚铁氰化钾)，
5μ L ； 10mg/ml, X-Gulc, 200 μ L ;无菌去离子水，669 μ L ；
[0015]所有过程需要试剂:Χ — Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)；DMS0(二甲基亚砜)；NaH2P04(磷酸二氢钠)；Na2HP04(磷酸氢二钠)；Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠);Triton-100 (曲拉通)；K3 [Fe (CN) 6](铁氰化钾)；K4 [Fe (CN) 6](亚铁氰化钾)。
[0016]这种配制方法过程相对简单一些，但是在实际配制的过程中容易产生沉淀，尤其是最后加入无菌去离子水以后会有部分沉淀析出，需要加热溶解，加热的过程会导致二甲基亚砜(DMSO)挥发，人体吸入后造成对人体器官的损伤。这种方法配制的染色液，染色效率不高，一般都需要37°C过夜染色，需要等的时间长。这种方法配制的染色液不能够重复使用，在需要检测大批量的材料时，很浪费染色液。这种方法配制的染色液染有些组织比较致密或者是组织比较大的材料比如有些果实或者有的植物的根茎时就不容易上色。经常需要通过切片的方法或者真空渗入法来染色。操作比较麻烦。
[0017]综上所述的两种配制方法是目前最常用的染色液配制方法。但是这两种方法都有其缺陷，不管是从试验的过程结果还是从试剂的选用上都是有缺陷的。因此我们需要寻求一种新的配制方法，这种新的方法应该具备有操作简单，染色效率高，无毒无害的特点。
【发明内容】
[0018]发明目的:本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种新的Gus染色液配制方法。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述配制方法得到的新的Gus染色液。本发明所要解决的第三个技术问题是提供了上述新的Gus染色液在转基因植物染色中的应用。
[0019]技术方案:为解决上述技术问题，一种新的Gus染色液配制方法，包括以下步骤:
[0020]I) K3 [Fe (CN) 6]溶液和 K4 [Fe (CN) 6]溶液的配制；
[0021]2) PBS磷酸缓冲液的配制:
[0022]3)染色液的配制方法:将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按顺序依次加入:K3[Fe(CN)6]溶液、K4 [Fe (CN)6]溶液、甲醇、10%的Triton-100 (曲拉通)、PBS磷酸缓冲液。
[0023]其中，上述步骤I)中的K3[Fe (CN) 6]溶液的浓度为50mM，所述K4[Fe (CN) 6]溶液浓度为50mM。
[0024]其中，上述步骤2) PBS磷酸缓冲液的配制方法如下:配制A液:A液的组成是浓度为20mM，NaH2PO4.2Η20溶液；配制B液:Β液的组成是浓度为44.8mM, NaH2PO4.Η20溶液；PBS磷酸缓冲液的配制方法是将配置好的38ml的A液和62ml的B液混合均匀配制而成。
[0025]其中，上述步骤3)中KJFe(CN)6]溶液加入量为1ml，K4 [Fe (CN)6]溶液加入量为lml，10%WTriton-100(曲拉通)加入量为lml，PBS磷酸缓冲液加入量为77ml。
[0026]上述的一种新的Gus染色液配制方法配制得到的新的Gus染色液。
[0027]上述的新的Gus染色液在转基因植物染色中的应用。
[0028]上述的应用，将转基因材料的需要检测的组织浸泡于Gus染色液中，置于37°C的温度下放置1-2小时，使染液充分渗入到组织的内部，然后脱色，倒出Gus染色液，用无水乙醇冲洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脱色24小时，期间更换乙醇2-3次；脱色完成以后拍照即可。
[0029]有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0030]1、配制过程相对简单，操作容易。
[0031]2、所用试剂都为无毒无害试剂，不会对人体造成伤害，不会污染环境。
[0032]3、配制得到的染色液染色效果好，通常染色I小时就能够显色，不需要想其他染色液过夜染色，节省试验时间。
[0033]4、染色时所用染色液较少，一般情况下能够浸没植物就能够完全染色。
[0034]5、染色液可以回收利用3-4次，而且不影响染色效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1转基因烟草和转基因番茄叶片的新的Gus染色液染色图；左边的是转基因烟草植株整株染色后的图，染色后为天蓝色；右边的为转基因番茄叶片染色后的图，染色后为深蓝色；
[0036]图2不同配方的转基因番茄Gus染色液染色效果；左上为本发明【背景技术】中的配方一染色后的，基本没有染上色；左下为本发明【背景技术】中的配方二染色后的，基本没有染上色；中上、中下、右上、右下为本发明的新的Gus染色液染色后，染色为深蓝色；效果明显。
【具体实施方式】
[0037]实施例:以配制100毫升x-gluc为例
[0038]配制过程中定容所用容器为10mL毫升容量瓶。保存溶液用的容器均为10mL毫升的三角瓶，所有溶液配制好以后都要用封口膜封住三角瓶瓶口。
[0039]第一步:准备工作
[0040]1.配制K3 [Fe (CN)6]铁氰化钾溶液:要求浓度50mM ；
[0041]具体方法:称取1.647g (克)定容至10mL毫升无菌去离子水中。
[0042]2.配制K4 [Fe (CN)6]亚铁氰化钾:要求浓度50mM。
[0043]具体方法:称取2.112g (克)定容至10mL (毫升)无菌去离子水。
[0044]3.配制PBS磷酸缓冲液:
[0045]首先配制A液:A液的组成是NaH2PO4.2H20 二水合磷酸二氢钠，称取3.12g (克)定容至10mL毫升无菌去离子水。
[0046]其次配制B液:B液的组成是NaH2PO4 -H2O 一水合磷酸氢二钠，称取7.17g (克)定容至10mL毫升无菌去离子水。
[0047]最后配制PBS磷酸缓冲液:PBS磷酸缓冲液的配制方法是将以上配置好的A液38mL (毫升)和B液62mL (毫升)混合均匀配制成10mL (毫升)PBS (磷酸缓冲液)。
[0048]以上过程中所有的溶液都需要现配现用，为了不造成溶液和药品的浪费，配制时可以根据自己的需要缩小或者扩大溶液配制量。
[0049]染色液的配制方法:
[0050]首先将100毫克X — Gluc (5-溴_4_氯_3_吲哚-β -葡萄糖苷酸酯)溶于1mL (毫升)甲醇，完全溶解以后，按顺序依次加入:
[0051 ] (I)K3 [Fe (CN) 6]铁氰化钾 ImL 毫升；
[0052](2) K4 [Fe (CN) 6]亚铁氰化钾 ImL 毫升；
[0053](3)甲醇 1mL 毫升；
[0054](4) 10% 的 Tri ton-100 (曲拉通)ImL 毫升；
[0055](5) PBS磷酸缓冲液77mL毫升；
[0056]最后,染色液配制完成。
[0057]配制完成的染色液如果短时间内用不完，可以分装成1mL毫升的小管，储存于-20°C冰箱中，这样染色液可以保存2-3年不变质。下次用之前可在30°C _37°C的温浴条件下解冻备用，反复冻融也不会影响染色效果。
[0058]染色过程:将转基因材料的需要检测的组织浸泡于Gus染色液中，置于37°C的温度下放置1-2小时，使染液充分渗入到组织的内部，此时可以看到植物材料上有蓝色显示，为了蓝色看的更加清晰，需要脱除植物材料原有的颜色。接下来的步骤是脱色。倒出Gus染色液，用无水乙醇冲洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脱色大约24小时，期间更换乙醇
2-3次。脱色完成以后拍照。参见图1或图2。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种新的Gus染色液配制方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)K3 [Fe (CN)6]溶液和 K4 [Fe (CN)6]溶液的配制； 2)PBS磷酸缓冲液的配制: 3)染色液的配制方法:将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按顺序依次加入=K3 [Fe (CN)6]溶液、K4 [Fe (CN)6]溶液、甲醇、10 %的Triton-1OO (曲拉通)、PBS磷酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步骤I)中的KJFe(CN)6]溶液的浓度为50禮，所述1(4%妳)6]溶液浓度为50mM。
3.根据权利要求1所述的一种新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步骤2)PBS磷酸缓冲液的配制方法如下:配制A液:A液的组成是浓度为20mM，NaH2PO4.2H20溶液；配制B液:B液的组成是浓度为44.8mM, NaH2PO4 -H2O溶液；PBS磷酸缓冲液的配制方法是将配置好的38ml的A液和62ml的B液混合均匀配制而成。
4.根据权利要求1所述的一种新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步骤3)中K3[Fe (CN)6]溶液加入量为1ml，K4[Fe (CN)6]溶液加入量为1ml，10%的Triton-100 (曲拉通)加入量为1ml，PBS磷酸缓冲液加入量为77ml。
5.权利要求1所述的一种新的Gus染色液配制方法配制得到的新的Gus染色液。
6.权利要求5所述的新的Gus染色液在转基因植物染色中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，将转基因材料的需要检测的组织浸泡于Gus染色液中，置于37°C的温度下放置1-2小时，使染液充分渗入到组织的内部，然后脱色，倒出Gus染色液，用无水乙醇冲洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脱色24小时，期间更换乙醇2-3次；脱色完成以后拍照即可。
【文档编号】G01N1/30GK104075927SQ201410243265
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】王媛花, 颜志明 申请人:江苏农林职业技术学院