猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用。该试纸卡包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳，样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内。样品吸收区包被有纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述的金标探针区包被有胶体金标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体；固化抗体区依次有检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，和对照线C包被有羊抗鼠IgG。本发明的试纸卡操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、工艺简单可大量制备，成本低廉，适合基层大批量现场检测并可用于猪群PRRSV感染的早期诊断。
【专利说明】猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种检测试纸卡及其制备方法，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003]猪繁殖与呼吸综合征又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以高热、成年猪繁殖障碍、仔猪呼吸障碍为特征的一种烈性传染病，由于其具有高致病性和高死亡率，近年来病毒又不断变异，严重危害着世界养猪业发展。
[0004]本病的检测方法较多，血清学检测方法主要有ELISA和血清中和试验等，但这些方法存在操作复杂、需要专门仪器和人员、检测时间长等缺点，而且，这些方法多检测PRRSV抗原和IgG抗体，很少检测IgM抗体，国外已有的检测猪IgM抗体试剂盒不能检测特定PRRSV的IgM抗体。
[0005]胶体金免疫层析方法是在免疫渗滤的基础上发展起来的快速检测方法，该方法操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、并可大量制备，工艺简单、成本低廉，适合基层大批量现场检测。猪繁殖与呼吸综合征抗原和抗体的胶体金免疫层析检测试纸已较多见，但仍没有特异性检测猪繁殖与呼吸综合征IgM抗体的胶体金免疫层析检测试纸。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于弥补现有检测技术的缺点与不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。该检测试纸卡将样品吸收区纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒作为检测抗原，特异性结合待检血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒的IgM抗体，再结合胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，固化抗体区检测线处包被的鼠抗猪IgM单克隆抗体进行捕获，利用夹心法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体的检测。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法。
[0008]本发明的再一目的在于提供上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡在 猪群PRRSV早期感染诊断中的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种猪繁殖与呼吸综合征IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳，样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，其包被量优选为10?50 μ g，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒优选为PRRSVNVDC-JXA1株；所述的金标探针区包被有金标探针,所述的金标探针为胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，其标记量优选为每毫升胶体金标记I?30 μ g单抗，包被量优选为10?50 μ L/cm ;固化抗体区依次有检测线T和对照线C，检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量优选为0.1?10 μ g/cm,对照线C包被有羊抗鼠IgG，包被量优选为0.1?10 μ g/cm。
[0010]所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。
[0011]上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤:将纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；将鼠抗猪IgM单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜检测线T处，将羊抗小鼠IgG包被于硝酸纤维素膜对照线C处；将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到聚乙烯板上，装入卡壳内，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
[0012]优选的，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤:
(I)纯化的PRRSV抗原的制备:将PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145细胞上扩增培养，收获的全毒经冻融、超声破碎，离心取上清；上清经超滤浓缩，蔗糖梯度离心纯化后-40°C保存，作为样品吸收区包被用抗原。
[0013](2)胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体:取半径为20?40nm浓度为0.01%的胶体金20mL调pH值为8.2?9.5，加入鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体20?600 μ g，在搅拌条件下使其结合，加BSA作为稳定剂，且使得BSA终浓度为0.1?10%，离心除去未结合的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.0lM pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物。
[0014](3)聚酯纤维膜的制备:将上述纯化的PRRSV抗原10?50 μ g用0.0lM pH值为
7.4的PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，烘干。
[0015](4)玻璃纤维膜的制备:将上述胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，10?50 μ L/cm,冻干。
[0016](5)硝酸纤维素膜的制备:检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1?10 μ g/cm,对照线C包被羊抗鼠IgG,包被量为0.1?10 μ g/cm。
[0017](6)试纸卡制备:将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
[0018]上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡可用于猪群PRRSV早期感染诊断中，所述的早期感染包括疫苗接种或自然感染或其组合。其使用方法包括如下步骤:将待检血清样品3?4滴用ImL 0.0lM pH值为7.4的PBS稀释后滴于样品孔中4?5滴，10?15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品IgM抗体为阴性。
[0019]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
(I)检测准确率和特异性高:本发明试纸卡与其他猪易感病原抗体没有交叉反应，检测敏感性与ELISA相当。
[0020](2)检测快速:检测时间只需10?15分钟，满足基层以及现场检测的需要。
[0021](3)携带方便，操作简便，结果直观易辨:本发明不需要其它仪器设备和专业技术人员，适合各级兽医院、大小猪场及个人使用。
[0022](4)试纸卡在常温下即可保存，保存期可达I年，且重复性良好。
[0023](5)本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡采用胶体金标记猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体作为探针，鼠抗猪IgM单克隆抗体包被硝酸纤维素膜，蔗糖梯度离心纯化的PRRSVNVDC-JXA1株作为检测抗原，夹心法特异性捕获血清中PRRSV IgM抗体，建立了 PRRSV IgM抗体胶体金免疫层析检测方法。除具有试纸卡检测本身优点外，又克服了抗原纯化过程以及纯度问题等导致的灵敏度低的缺点，显著提高了检测的特异性(特异性100%)和敏感性(灵敏度1:800)，可用于猪群PRRSV感染的早期快速诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的结构示意图；其中，I为吸水区，2为固化抗体区,3为金标探针区,4为样品吸收区,5为底板,6为卡壳，7为检测线T，8为对照线C。
[0025]图2是试纸卡特异性试验结果图；其中，从左至右为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫7日血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒感染7日血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫60天血清、猪伪狂犬病IgM抗体阳性血清、猪乙型脑炎IgM抗体阳性血清、猪瘟IgM抗体阳性血清、猪细小病毒IgM抗体阳性血清、猪圆环病毒病IgM抗体阳性血清。
[0026]图3是试纸卡敏感性试验结果图；其中，I?7:已知阳性样品从1:50倍比稀释至1:3200。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做详细描述和具体说明，但并不限制本发明实质。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]实施例1
猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的结构示意图如图1所示，试纸卡内试纸条水平面从左到右依次为吸水区1、固化抗体区2、金标探针区3、样品吸收区4，依次相互部分重叠组装于底板5上切成4mm宽试纸条后装入卡壳6内即为猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡；吸水区1、固化抗体区2、金标探针区
3、样品吸收区4、底板5的材料分别为吸水滤纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、聚酯纤维膜和聚乙烯板，卡壳6为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。固化抗体区2检测线T 7处包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为3 μ g/cm,对照线C 8处包被有羊抗鼠IgG，包被量为5 μ g/cm ο金标探针区3包被有胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体,标记量为10 μ g单抗/mL胶体金,包被量为25 μ L金标探针/cm ;样品吸收区4包被有鹿糖梯度离心纯化的PRRSVNVDC-JXA1株抗原，包被量为50 μ g。
[0029]上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法如下:
(I)纯化的PRRSV抗原的制备:将PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145细胞上扩增培养，收获的全毒经冻融、超声破碎，离心取上清；上清经超滤浓缩，蔗糖梯度离心纯化后-40°C保存，作为样品吸收区包被用抗原。
[0030](2)胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的方法:取半径为25nmpH值为9.0浓度为0.01%的胶体金25mL，加入鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体250 μ g，在搅拌条件下使其结合，加BSA至终浓度为10%，离心除去未结合的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.0lM pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物。
[0031](3)聚酯纤维膜的制备:将上述纯化的PRRSV抗原50 μ g用0.0lM pH值为7.4的PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，烘干。
[0032](4)玻璃纤维膜的制备:将上述胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物按25 μ L金标探针/cm喷涂于玻璃纤维膜上，冻干。
[0033](5)硝酸纤维素膜的制备:检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为3 μ g/cm,对照线C包被羊抗鼠IgG,包被量为5 μ g/cm。
[0034](6)试纸卡制备:将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸条，装入卡壳内，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
[0035]实施例2
除检测线T 7包被抗猪IgM单克隆抗体的量为5 μ g/cm ;对照线C 8包被羊抗小鼠IgG的量为6 μ g/cm ;金标探针区3包被的胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的标记量为8 μ g/mL,包被量为20 μ L金标探针/cm,胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的方法:取半径为40nm pH值为8.2浓度为0.01%的胶体金20mL，加入鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体160 μ g，在搅拌条件下使其结合，加BSA至终浓度为8%，离心除去未结合的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.0lM pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物外，其余与实施例1相同。
[0036]实施例3
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的使用方法:
将待检血清样品3?4滴用0.0lM pH值为7.4的PBS ImL稀释后滴于样品孔中4?5滴，10?15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品IgM抗体为阴性。
[0037]实施例4本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的特异性和敏感性测试:
应用实施例1和2制备的两种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡分别检测已知的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫7日血清和猪繁殖与呼吸综合征病毒感染7日血清各一份，猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体阴性血清一份，猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫60天血清一份，猪伪狂犬病IgM抗体阳性血清、猪乙型脑炎IgM抗体阳性血清、猪瘟IgM抗体阳性血清、猪细小病毒IgM抗体阳性血清、猪圆环病毒病IgM抗体阳性血清各一份。将待检血清样品3~4滴用ImL 0.01M pH值为7.4的PBS稀释后滴于样品孔中4~5滴，10~15min判定结果。结果表明(见图2和表1):猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫7日血清和猪繁殖与呼吸综合征病毒感染7日血清检测结果为阳性，其它血清检测结果为阴性，特异性良好；说明本发明试纸卡可用于包括猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗接种或自然感染或其组合早期感染的诊断。
[0038]表1本发明特异性检测结果
样品号I样品名称I检测结果
【权利要求】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于:包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳；样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述的金标探针区包被有金标探针，所述的金标探针为胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体；所述的固化抗体区依次有检测线T和对照线C，所述的检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，所述的对照线C包被有羊抗鼠IgG0
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于:所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒为PRRSVNVDC-JXA1株，其包被量为10~50 μ g0
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于:所述的金标探针的标记量为I~30 μ g/mL,包被量为10~50 μ L/cm ；所述的鼠抗猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1~10 μ g/cm ;所述的羊抗鼠IgG的包被量为0.1 ~10 μ g/cm。
4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于 :所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。
5.权利要求1-4任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤:将纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；在硝酸纤维素膜检测线T处包被鼠抗猪IgM单克隆抗体、对照线C处包被羊抗鼠IgG;将包被有纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的聚酯纤维膜、包被有胶体金标记的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的玻璃纤维膜、包被有检测线T和对照线C的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次组装聚乙烯板上，装入卡壳内，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
6.根据权利要求5所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)纯化的PRRSV抗原的制备:将PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145细胞上扩增培养，收获的全毒经冻融、超声破碎，离心取上清；上清经超滤浓缩，蔗糖梯度离心纯化后-40°C保存，作为样品吸收区包被用抗原； (2)胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的方法:分别取半径为20~40nm的胶体金20mL调pH值为8.2~9.5，加入鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体20~600 μ g，在搅拌条件下使其结合，加BSA作为稳定剂，且使得BSA终浓度为0.1~10%，离心除去未结合的鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物； (3)聚酯纤维膜的制备:将上述纯化的PRRSV抗原10~50μ g用0.01M pH值为7.4的PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，烘干；(4)玻璃纤维膜的制备:将上述胶体金标记鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，10~50 μ L/cm,冻干； (5)硝酸纤维素膜的制备:检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1~.10 μ g/cm,对照线C包被羊抗鼠IgG,包被量为0.1~10 μ g/cm ; (6)试纸卡制备:将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
7.权利要求1-4任一项所述的所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡在猪群PRRSV早期感染诊断中的应用，其特征在于:所述的早期感染包括疫苗接种或自然感染或其组合。
8.权利要求1-4任一项所述的所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的使用方法，其特征在于包括如下步骤:将待检血清样品3~4滴用ImL.0.01M pH值为7.4的PBS稀释后滴于样品孔中4~5滴，10~15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品IgM抗体为阴性。
【文档编号】G01N33/577GK103969440SQ201410227399
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】牟林琳, 刘洁, 李建, 漆世华, 朱薇, 温文生, 谢红玲, 冯钊 申请人:武汉中博生物股份有限公司