一种用组织培养法生产甾体生物碱的碱含量测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种用组织培养法生产甾体生物碱的碱含量测定方法，包括以下步骤：(1)配置培养基；(2)愈伤组织培养；(3)生根培养；(4)生物碱的提取与制备；(5)精密称取步骤(4)中制备的样品，减压蒸馏浓缩挥发回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱静置一定的时间备用；(6)高效液相色谱分析测定峰面值；(7)标准曲线的建立；(8)甾体生物碱含量的测定：根据步骤(6)中测得的峰面值和步骤(7)中的回归方程计算出样品的甾体生物碱含量。本发明利用超声技术，溶剂使用量相对较少，降低成本，利用旋转蒸发器减压蒸馏溶剂，借助于真空泵降低系统内压力，降低液体的沸点，较低温度下得到生物碱浓缩液。
【专利说明】一种用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定方法。
【背景技术】
[0002]传统提取生物碱的方法有煎煮法、浸溃法、回流法和渗漉法操作简单易行，能够提取较多的有效成分，但提取过程中存在着能耗大、有效成分损耗大、杂质较多、效率较低等问题。随着物理科学的发展，针对传统提取过程中存在的问题，一些新技术应用于生物碱提取工艺中，新技术的强化作用或流体在超临界状态下进行萃取，大大提高了提取效率，降低了过程能耗，因其显著优势而成为研究热点。孙志良等探索出提取白毛藤生物碱比较合适的方法:生物碱及其生物碱盐都能溶于甲醇或乙醇，但甲醇毒性很大，应采用95%乙醇回流提取，然后减压回收溶剂得生物碱粗品，将生物碱粗品溶于酸水，用亲脂性有机溶剂除去不溶于水的脂溶性杂质，再酸水碱化使生物碱游离，用氯仿萃取，回收氯仿得到脂溶性生物碱。剩下的碱性水母液需用极性较大的有机溶剂正丁醇萃取，回收正丁醇得到水溶性生物碱。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定 方法，利用超声技术，溶剂使用量相对较少，降低成本，利用旋转蒸发器减压蒸馏溶剂，借助于真空泵降低系统内压力，降低液体的沸点，较低温度下得到生物碱浓缩液。
[0004]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的:
[0005]一种用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定方法，包括以下步骤:
[0006](I)配置培养基:
[0007]&、愈伤组织培养基？1、？2、？3、？4、？8或卩10，
[0008]13、生根培养基？1、？2、？3、？4或卩10，
[0009]所述的Pl 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L蔗糖，P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 为 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 为MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 为 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖；
[0010]上述各培养基在灭菌前调pH值均为5.8，加入10g/L琼脂，且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ；
[0011](2)愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗，把子叶切成0.3*0.3cm的见方小片或将下胚轴切成Icm长的小段接种于诱导愈伤组织培养基中，在温度22±2摄氏度的培养箱中，进行暗培养，在接种后第30天统计愈伤组织生长情况；
[0012](3)生根培养:把芽从基部切下，接种到生根培养基中，到接种后第30天时，对生根情况进行统计；
[0013](4)生物碱的提取与制备:将步骤(2)和(3)中的待测组织洗净37°C下烘干，并粉碎至40目，准确称取1.0g，置于超声波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超声提取30min，以同样的方法超声提取第二次，经过滤渣弃去，合并二次滤液，利用旋转蒸发器减压蒸馏浓缩，挥发回收乙醇，得浓缩液，浓缩液溶于稀酸溶液至PH值为3，过滤，滤液加氨水至pH值为10，过滤，得清夜，置冰箱中备用；
[0014](5)精密称取步骤(4)中制备的样品，减压蒸馏浓缩挥发回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱静置一定的时间备用；
[0015](6)高效液相色谱分析测定峰面值:所述的液相色谱条件如下:
[0016]色谱柱:Cosmosil5C18AR-1I(250X4.6mm);
[0017]流动相:乙腈一磷酸二氢钾(75:25)；
[0018]检测波长:205nm;流速:1.0mL/min ；
[0019]进样量IOyL,柱温:25°C ; [0020](7)标准曲线的建立:精密吸取对照品0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg用冰乙酸定容至5mL，在20°C静置一定的时间备用，以步骤(6)中的液相条件，高效液相色谱分析法测定各浓度对照品的吸光度，对所测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程:y =1185050.6095x-37397.6623，其中y为峰面值，x为样品碱含量，其中相关系数r = 0.9960，r为样品含量与吸光度二组数据间的相关性，与朗伯.比尔定律相符；
[0021](8)甾体生物碱含量的测定:根据步骤(6)中测得的峰面值和步骤(7)中的回归方程y = 1185050.6095χ-37397.6623，其中y为峰面值，x为样品碱含量，计算出样品的甾体生物碱含量。
[0022]本发明的有益效果如下:
[0023]本发明用组织培养法生产甾体生物碱的碱含量测定方法，利用超声技术缩短提取时间、提闻提取率，并且无需加热，提闻了热敏性生物喊的提取率且对其生理活性基本没有影响，溶剂使用量相对较少，降低成本。利用旋转蒸发器减压蒸馏溶剂，借助于真空泵降低系统内压力，降低液体的沸点，较低温度下得到生物碱浓缩液。高效液相色谱分析法具有高、灵敏度高、分离速度快，适用范围广、重现性好、操作方便等优点。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0025]本发明用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定方法，包括以下步骤:
[0026](I)配置培养基:
[0027]&、愈伤组织培养基？1、？2、？3、？4、？8或卩10，
[0028]13、生根培养基？1、？2、？3、？4或卩10，
[0029]其中Pl 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖，P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 为 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 为MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 为 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖；
[0030]上述各培养基在灭菌前调pH值均为5.8，加入10g/L琼脂，且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ；
[0031](2)愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗，把子叶切成0.3*0.3cm的见方小片或将下胚轴切成Icm长的小段接种于诱导愈伤组织培养基中，在温度22±2摄氏度的培养箱中，进行暗培养，在接种后第30天统计愈伤组织生长情况；
[0032](3)生根培养:把芽从基部切下，接种到生根培养基中，到接种后第30天时，对生根情况进行统计；
[0033](4)生物碱的提取与制备:将待测器官洗净37°C下烘干，并粉碎至40目，准确称取1.0g，置于超声波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超声提取30min，以同样的方法超声提取第二次，经过滤渣弃去，合并二次滤液，利用旋转蒸发器减压蒸馏浓缩，挥发回收乙醇，得浓缩液，浓缩液溶于稀酸溶液至PH值为3，过滤，滤液加氨水至pH值为10，过滤，得清夜，直冰箱中备用；
[0034](5)精密称取步骤⑷中制备的样品，减压蒸馏浓缩挥发回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱静置一定的时间备用；
[0035](6)高效液相色谱分析测定样品的峰面值，见表1:
[0036]表1
【权利要求】
1.一种用组织培养法生产留体生物碱的碱含量测定方法，其特征在于包括以下步骤: (1)配置培养基: a、愈伤组织培养基PUP2、P3、P4、P8或P10， b、生根培养基P1、P2、P3、P4或P10，
所述的 Pl 为 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 为 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖，P3 为 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 为 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 为MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 为 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖； 上述各培养基在灭菌前调PH值均为5.8，加入10g/L琼脂，且在1.1kg/cm2,121°C饱和蒸气下灭菌20min ； (2)愈伤组织培养:超净工作台上取出白英组培种子苗，把子叶切成0.3*0.3cm的见方小片或将下胚轴切成Icm长的小段接种于诱导愈伤组织培养基中，在温度22±2摄氏度的培养箱中，进行暗培养，在接种后第30天统计愈伤组织生长情况； (3)生根培养:把芽从基部切下，接种到生根培养基中，到接种后第30天时，对生根情况进行统计； (4)生物碱的提取与制备:将步骤(2)和(3)中的待测组织洗净37°C下烘干，并粉碎至40目，准确称 取1.0g，置于超声波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超声提取30min，以同样的方法超声提取第二次，经过滤渣弃去，合并二次滤液，利用旋转蒸发器减压蒸馏浓缩，挥发回收乙醇，得浓缩液，浓缩液溶于稀酸溶液至pH值为3，过滤，滤液加氨水至pH值为10，过滤，得清夜，置冰箱中备用； (5)精密称取步骤(4)中制备的样品，减压蒸馏浓缩挥发回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱静置一定的时间备用； (6)高效液相色谱分析测定峰面值:所述的液相色谱条件如下: 色谱柱:Cosmosil5C18AR-1I(250X4.6mm)； 流动相:乙腈一磷酸二氢钾(75:25)； 检测波长:205nm ;流速:1.0mL/min ； 进样量10 μ L，柱温:25°C ; (7)标准曲线的建立:精密吸取对照品0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mg用冰乙酸定容至5mL,在20°C静置一定的时间备用，以步骤(6)中的液相条件，高效液相色谱分析法测定各浓度对照品的吸光度，对所测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程:y =.1185050.6095x-37397.6623，其中y为峰面值，x为样品碱含量，其中相关系数r = 0.9960，r为样品含量与吸光度二组数据间的相关性，与朗伯.比尔定律相符； (8)甾体生物碱含量的测定:根据步骤(6)中测得的峰面值和步骤(7)中的回归方程y=1185050.6095X-37397.6623，其中y为峰面值，x为样品碱含量，计算出样品的留体生物碱含量。
【文档编号】G01N30/02GK104020227SQ201410216205
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】吕洪飞, 姜波, 梁宗锁, 祁哲晨, 杨东风, 陈绍宁, 皮二旭, 李华磊 申请人:浙江理工大学