快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法
【专利摘要】本发明公开一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法。该方法的步骤如下：制备胶体金，将拉曼信号分子4,4'-联吡啶和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，做成金纳米探针；经过硅烷化和醛基化将玻片活化，使其表面充满-CHO，将ZEN-BSA结合到活化了的玻片表面；制备一系列浓度梯度的样品液；将金纳米探针和样品液同时滴到含ZEN-BSA的玻片上；获得拉曼光谱图，绘制校正曲线；根据绘制的校正曲线，求待测样品中ZEN的含量。本发明所述的方法具有操作简单、灵敏度高、检测区间宽和特意性强的突出优点，人员不需要经过专业的培训就可以在最短的时间内实现检测，在食品安全、兴奋剂检测以及环境监控等领域具有广泛的应用前景。
【专利说明】快速定量检测玉米赤霉稀酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone),简称ZEN,又叫作F-2毒素,是一种酹的二轻基苯酸的内酯结构，分子式为c18h22 05。它首先从有赤霉病的玉米中分离得到，是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌侏，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45 %，最高含毒量可达到2909mg/kg ；小麦的检出率为20 %，含毒量为0.364?11.05mg/kg ο玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110°C下处理Ih才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有显著的植物生物学作用，如对植物生长的调控作用和在植物育种方面的作用，可以提高玉米幼苗的抗旱和抗寒的能力。玉米赤霉烯酮作为一种雌激素，具有雌激素的作用，但当其含量超标时，可引起急性和慢性中毒。在急性中毒的条件下，对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用，造成神经系统的亢奋，在脏器当中造成很多出血点，使动物突然死亡。在慢性中毒时，会导致母畜外生殖器肿大，充血，死胎，畸胎和延期流产，并且伴有木乃伊胎的现象，还会引起睾丸生殖细胞凋亡和睾丸萎缩。最近几年由于极端天气或者不恰当的储藏，农产品被玉米赤霉烯酮污染的现象普遍存在，加上贸易的全球化导致玉米赤霉烯酮在食物，饲料以及饲料原料中广泛存在。因此，进出口检疫和监督部门迫切需要一种快速高效的检测玉米赤霉烯酮的方法。
[0003]表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRaman scattering, SERS)标记技术是一种新颖的光谱标记方法，它利用金，银等贵金属的纳米粒子来增强吸附在其表面的标记分子的拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。SERS标记技术有如下优点:①拉曼光谱具有高度的分子特征性，且谱峰窄，能够避免不同分子间的谱峰重叠；②拉曼散射几乎不受水的影响，能够广泛应用于水溶液中物质的检测SERS信号具有高强度、低背景的特点，很少受到光漂白的影响，为了获得较好的信号可在一定程度上延长检测时间SERS信号不易发生淬灭现象。SERS技术以其独特的优点在分析化学和生命科学领域日益受到重视。
[0004]早前关于SERS的研究主要集中在蛋白质、DNA、微生物检测等方面。韩晓霞《基于表面增强拉曼散射的蛋白质检测方法研究》一文利用蛋白质和金属纳米粒子的相互作用形成SERS基底用于蛋白质检测；此外还结合SERS和ELISA的基本理论，设计了一种基于表面增强共振拉曼散射(Surface-enhanced resonant Raman spectroscopy, SERRS)利用突光分子代替酶促反应、以SERS检测取代吸光度的免疫吸附试验。郭红燕《SERS标记的金纳米探针用于免疫检测》一文中以对巯基苯甲酸为拉曼活性分子制备出SERS标记的金纳米棒探针和蛋白质抗体结合形成SERS标记抗体。通过SERS标记抗体、待测抗原和俘获抗体之间的免疫应答反应，将金纳米棒探针组装到固相基底上。这种SERS标记方法主要基于类似三明治结构的构建，基底上的俘获抗体和纳米粒子上的标记抗体通过与抗原的结合形式“俘获抗体-抗原-标记抗体”三明治夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的检测进行免疫分析。蛋白质等大分子物质一般具有多个结合位点，能够很好的适用于传统的三明治结构。但是玉米赤霉烯酮是一种典型的小分子物质，由于其缺少多个结合位点，目前还没有专门的利用SERS对这类小分子物质，尤其是玉米赤霉烯酮的检测。基于SERS技术的优点，因此，发展一种利用SERS简单快速检测玉米赤霉烯酮的方法显得尤为重要。
[0005]近几年，在霉菌毒素分析方面的进步促使一系列的分析方法应用于检测玉米赤霉烯酮。激光荧光分析-高效液相色谱法(LF-HPLC)，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，酶联免疫(ELISA);然而，这些方法样品前处理耗时，所用仪器庞大昂贵，还需要专业的操作人员，因此不利于现场实时检测。现在市售的酶联免疫试剂盒虽然选择性好，操作方便，但是价格昂贵，储存条件苛刻，假阳性表较高。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法。本发明的方法具有灵敏度高、特异性强、检测区间宽的特点；且本发明检测对象单一且针对性强，所需时间短，不需要经过培训的专业人员就可以使用本发明方法来检测，便于本发明方法的推广和运用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤:
[0008](I)将拉曼信号分子和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，用牛血清白蛋白(BSA)封闭剩余活性位点，做成金纳米探针；
[0009](2)将玻片进行清洗,再用水虎鱼溶液浸泡,然后依次用硅烷和醛处理,使其硅烷化和醛基化，使表面充满醛基(-CH0)，和抗原ZEN-BSA偶联，最后用BSA进行封闭，得到固定抗原偶联物的基底；其中，玻片每经过一个处理都要用超纯水清洗和氮气吹干；
[0010](3)往空白饲料中添加ZEN标准溶液，混匀，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，最终用PBS缓冲液溶解ZEN，制成一系列浓度梯度的样品液；
[0011](4)将步骤(I)的金纳米探针分别和步骤(3)制成的一系列浓度梯度的样品液同时滴到步骤(2)得到的固定抗原偶联物的基底上，则样品液中的ZEN和基底表面的ZEN-BSA竞争性的和胶体金表面的ZEN单克隆抗体结合；
[0012](5)根据ZEN浓度和拉曼信号强度的对应关系，绘制校正曲线；
[0013](6)取待测样品，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，并用PBS缓冲液稀释，根据该待测样品获得的拉曼信号强度，通过步骤(5)的校正曲线快速得到该待测样品中的ZEN浓度。
[0014]步骤(I)中所述的拉曼信号分子优选为4，4’ -联吡啶，该分子一边连接在胶体金表面，另一边和抗体相连，是双官能团标记分子；
[0015]步骤(I)中所述的胶体金的平均粒径优选为30nm ；
[0016]步骤(I)中所述的胶体金的制备过程包括如下步骤:在不断搅拌下将IOOmLlmM的HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠溶液，等到溶液变成深红色继续沸腾15?20min ;最后冷却至常温,得到30nm的胶体金溶液；[0017]步骤(1)中所述的ZEN单克隆抗体在结合到胶体金表面以前，拉曼信号分子首先标记到胶体金的表面；
[0018]步骤(1)中所述的金纳米探针的制备过程包括如下步骤:往制备好的胶体金溶液中加入拉曼信号分子，使其终浓度为3Xl(T4mM，常温反应10min后，12000rpm离心5min，去除上清液，用0.002mol/L硼酸盐缓冲液(BB) (pH = 8.2)分散；加入ZEN单克隆抗体，使其终浓度为2.5Xl(r3mg/mL，反应2h后，在4°C环境下12000rpm离心10min，去上清液，然后沉淀用0.002mol/L硼酸盐缓冲液(BB) (pH = 8.2)分散；最后加入质量百分数2.5% BSA,反应Ih后，在4°C环境下12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS) (pH=7.4)分散，即得到金纳米探针；
[0019]所述的常温优选为25~30°C ；
[0020]所述的质量百分数2.5% BSA,与0.002mol/L硼酸盐缓冲液(BB) (pH = 8.2)缓冲液的体积比优选为1:50 ;
[0021]步骤(2)中所述的水虎鱼溶液优选为浓硫酸和30%的过氧化氢，按体积比为7:3进行混合得到，所述百分数为体积百分数；
[0022]步骤(2)中所述的硅烷优选为3-氨丙基-三甲氧基硅烷，优选用浓度为5%~10%的3-氨丙基-三甲氧基硅烷的甲醇溶液，所述百分数为体积百分数；
[0023]步骤(2)中所述的醛优选为戊二醛，优选用浓度为2%~4%的戊二醛水溶液，所述百分数是体积百分数；
[0024]步骤(1)和⑵中所述的牛血清白蛋白(BSA)优选为2%~3%的BSA，所述百分数是质量百分数；
[0025]步骤⑵中所述的清洗的条件优选用20~50KHz超声清洗处理20~40min ；
[0026]步骤(2)所述的用水虎鱼溶液浸泡的时间优选为25~35min ;使玻片表面含有丰富的-OH;
[0027]步骤⑵所述的用硅烷处理的时间优选为12~36h ;通过-OH和-CH3O的结合使玻片表面充满-NH2 ；
[0028]步骤(2)所述的用醛处理的时间优选为4~8h ;通过-NH2和-CHO反应使载玻片表面富含-CHO ；
[0029]步骤⑵所述的和抗原ZEN-BSA偶联的时间优选为2~4h ;
[0030]步骤(1)和⑵中所述的封闭的时间优选为I~2h ;
[0031]步骤(3)中所述的空白饲料是对于要检测的玉米赤霉烯酮呈现阴性的饲料；
[0032]步骤(3)中所述的ZEN标准溶液的浓度优选为0.05~lmg/mL ；
[0033]步骤(3)和(6)中所述的PBS缓冲液优选为pH = 7.4，浓度0.01mol/L的PBS缓冲液；
[0034]步骤(3)中所述的一系列浓度梯度优选为O、1、10、100和1000pg/mL，其中，Opg/mL为对照；
[0035] 步骤(3)和(6)中所述的用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，具体步骤如下:取饲料样品，加入无水甲醇与50g/L NaCl溶液后，充分混匀，然后超声(20~50KHz)提取20~40min;抽滤，加入三氯甲烷萃取；分液后，三氯甲烷(下层)经无水硫酸钠脱水并收集，62~72°C将其蒸干，用无水甲醇溶解，然后用PBS (pH = 7.4)缓冲液将其释成一定浓度的饲料样品稀释液；
[0036]所述的饲料样品、无水甲醇和50g/L NaCl溶液的质量体积比优选为Ig:6mL:4mL ；
[0037]所述的抽滤优选为用布氏漏斗进行抽滤；
[0038]所述的加入三氯甲烷萃取，优选是分3次进行萃取，每次萃取用的三氯甲烷与饲料样品的体积质量比优选为4mL:lg ；
[0039]所述的用无水甲醇溶解，无水甲醇与饲料样品的体积质量比优选为ImL:5g ；
[0040]步骤⑷中所述的金纳米探针和样品液的体积比优选为1:1;
[0041]步骤(5)中所述的拉曼信号强度是通过显微拉曼光谱仪测得；所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为632.Snm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为lmW，信号收集时间为10?60s。
[0042]本发明的机理是:在收集时间一定的情况下，对于同一种拉曼信号分子，信号强度和信号分子的浓度成正相关；正是在此基础上实现了定量检测。
[0043]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0044](I)本发明将拉曼信号分子4，4’ -联吡啶用于ZEN毒素的定量检测，并首次将4，4'-联吡啶的信号强度和物质的浓度联系起来，类似于朗伯比尔定律，从而实现定量检测。
[0045](2)本发明对于玻片的处理，经过水虎鱼溶液，醛基化和硅烷化。本发明是在现有技术的基础上进行了改进，如现有的方法要采用四步，而本方法只需要三步，这样更加简单。此外，改进后的方法处理时间和条件更容易实现，以前的方法需要48小时左右，且需要在高温下进行硅烷化，而目前的方法则只需要28小时，且都是在常温下进行的。
[0046](3)传统的表面增强拉曼散射只能检测含有多个结合位点的分子，即形成典型的三明治结构，对于像玉米赤霉烯酮这种小分子半抗原却检测不了，本发明可以弥补这种方法的不足，实现小分子检测，因此本发明对食品安全和兴奋剂的控制将会有重要作用。
[0047](4)待测样品中若有ZEN毒素，则该ZEN毒素就会与基底表面的ZEN-BSA竞争性的结合金纳米探针上的ZEN单克隆抗体，检测到的拉曼信号就会减弱；待测样品中ZEN毒素含量越高，检测到的拉曼信号就越弱。通过校正曲线就可以将样品中准确的ZEN含量求出来。
[0048](5)本发明得到了一个更宽的检测区间(I?1000pg/mL)和更低的检测限(lpg/mL)，而现有的最低的检测限为12.5pg/mL，是本发明的最低的检测限的12.5倍，因此，本发明具有更高的灵敏度及特异性。
[0049](6)本发明的方法首次用于检测饲料中的玉米赤霉烯酮，且在实际饲料中有很好的回收率及特异性，实用性很强。
[0050](7)本发明操作简单，SERS纳米探针与抗原偶联物的固定都可以提前准备好，操作时只需将待测样品与SERS纳米探针一次滴加到基底表面反应，反应结束后可以马上进行检测；收集时间30s，然后立刻从校正曲线读出浓度，从而实现快速检测。这可以满足食品和进出口检测监督部门的要求，具有广泛的实用性。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1为本发明所述快速定量检测饲料中玉米赤霉烯酮的方法流程示意图。[0052]图2为实施例1中使用不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液得到的检测图；其中，a为SERS光谱图，b为1612CHT1处的信号强度柱状图。
[0053]图3为饲料中玉米赤霉烯酮检测的校正曲线图；其中，横坐标代表玉米赤霉烯酮浓度的对数，纵坐标代表饲料溶液中不同浓度的玉米赤霉烯酮的SERS强度和Opg/mL玉米赤霉烯酮的SERS强度比。
[0054]图4为玉米赤霉烯酮抗原抗体的特异性检测图。
【具体实施方式】
[0055]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0056]下面实施例中，未注明具体条件和环境的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。本发明中DP为拉曼标记分子4，4’-联吡啶；BSA为牛血清白蛋白；ZEN为玉米赤霉烯酮；ZEN-BSA表示ZEN、BSA的偶联物；BB表示硼酸盐缓冲液；PBS表示磷酸盐缓冲液。
[0057]实施例1
[0058]1、胶体金的制备
[0059]在不断搅拌下将IOOmLlmM的氯金酸(HAuCl4)溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠 水溶液。此时溶液的颜色变化是:淡黄-无色-黑色-紫色-深红色，等溶液变成深红色继续加热回流15~20min。最后冷却至常温，制备得到30nm的胶体金溶液。
[0060]2、金纳米探针的制备
[0061]取ImL步骤I新鲜制得的胶体金溶液(约6.02X IO11个)，放入EP管中，加入30 μ L摩尔浓度为0.01mM的4，4’ -联吡啶(购自Sigma试剂公司)，常温下(25~30°C )反应10min后，12000rpm离心5min,去除上清液,沉淀用2mMBB(pH = 8.2)缓冲液ImL分散，得到分散的胶体金溶液。在分散的胶体金溶液中加入5μ L ZEN单克隆抗体(购自北京华安麦科生物技术有限公司，其浓度为12mg/mL)反应2h。然后，在4°C环境下12000rpm离心lOmin，去上清液，沉淀用2mM BB (pH = 8.2)缓冲液ImL分散。最后加入20 μ L质量百分数2.5% BSA (购自Sigma试剂公司)反应Ih后,在4°C环境下12000rpm离心10min,去除上清液，沉淀用IOmM PBS (pH = 7.4)缓冲液分散，则得到ZEN单克隆抗体的金纳米探针，在4°C环境下保存待用。
[0062]3、固定抗原偶联物的基底的制备
[0063]首先将尺寸为25mmX76mmX Imm的载玻片(购自盐城市信泰医疗器械厂)经过40KHz的超声波清洗30min，取出后用超纯水(由ELGA LabWater公司的PURELAB Option-R纯水系统制备，电阻> I SM?)冲洗，惰性气体氮气(N2)(购自广州英莱气体有限公司，纯度为99.99% )吹干；然后将吹干的载玻片浸泡在沸腾的水虎鱼溶液(30% H2O2与浓H2SO4体积比为3:7，浓H2SO4的质量分数为98% )中30min，使玻片表面含有丰富的-OH，取出后用大量超纯水冲洗，惰性气体氮气(N2)吹干；接着将吹干的载玻片放入体积百分数为5%的3-氨丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)(购自上海晶纯试剂有限公司)甲醇溶液中浸泡24h，通过-OH和-CH3O的结合使玻片表面充满-NH2，取出后先用无水甲醇(分析纯)彻底清洗，再用超纯水淋洗，惰性气体氮气(N2)吹干，即为硅烷化的载玻片；再接着把硅烷化的载玻片浸于体积百分数为2.5%的戊二醛水溶液中浸泡4h，通过-NH2和-CHO反应使载玻片表面富含-CH0，用超纯水冲洗，惰性气体氮气(N2)吹干，进而可以连接抗原偶联物ZEN-BSA ;最后在上述处理好的载玻片上滴加100 μ L、50 μ g/mL抗原偶联物溶液(ZEN-BSA)(购自北京华安麦科生物技术有限公司)，常温下固定2h后用超纯水冲洗，惰性气体氮气(N2)吹干，置于
2.5% BSA中封闭剩余活性位点lh，取出后再次用超纯水冲洗，惰性气体氮气(N2)吹干，备用。此时抗原偶联物已经成功固定于载玻片表面，得到固定抗原偶联物的基底。
[0064]4、饲料样品的处理:称取5g研磨的饲料样品于三角瓶中，加入30mL无水甲醇，50g/L NaCl溶液20mL后于摇床(180r/min)充分混匀5min，然后超声(40KHz)提取30min。将其用布氏漏斗进行抽滤，滤液储存到分液漏斗中，加入三氯甲烷(加3次，每次20mL)萃取。分液后，三氯甲烷(下层)经无水硫酸钠脱水并收集于磨口三角瓶中，65°C将其蒸干，用ImL无水甲醇溶解残渣，然后用PBS(pH = 7.4)缓冲液将其释成一定浓度的饲料样品稀释液。
[0065]5、待测样品中ZEN或ZEN标准溶液与抗原偶联物竞争性的结合金纳米探针上的ZEN单克隆抗体
[0066]①选择5个浓度的玉米赤霉烯酮(购自北京华安麦科生物技术有限公司)标准溶液，分别为0、1、10、100和1000pg/mL，其中Opg/mL为对照实验，将ZEN标准溶液(50 μ L)和结合ZEN单克隆抗体的SERS纳米探针(50 μ L)依次滴在固定了 ZEN-BSA偶联物的载玻片表面。ZEN标准溶液与固定在基底表面的ZEN-BSA偶联物竞争性地结合SERS纳米探针表面的ZEN单克隆抗体。在常温(25?30°C )下反应2h后用超纯水冲洗载玻片。
[0067]用日本Nippon Optical System公司的显微拉曼光谱仪,对基底表面上结合的SERS纳米探针进行信号采集，激发光源是波长为632.Snm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为lmW，信号收集时间为30s。信号采集完毕后通过Origin软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的SERS光谱图(如图2a所示)及强度柱形图(如图2b所示)。根据SERS光谱图，以4，4’-联吡啶面内环呼吸振动特征谱峰为参考，选择拉曼位移为1612cm—1。从图2a中可以明显地看到，随着样品中ZEN浓度的提高，采集的SERS信号逐渐降低。从图2b可以看出，相比于Opg/mL处的信号强度，I?1000pg/mL的强度有一个明显的降低趋势，表明在这一区间内能够进行有效的定量分析。
[0068]②利用标准添加的方法，向空白饲料(所述的空白饲料是对于要检测的玉米赤霉烯酮呈现阴性的饲料，这里选择的是不含玉米赤霉烯酮的兔的维持配合饲料；购于广东省医学实验动物中心)中添加一定量的ZEN标准溶液，用pH = 7.4、IOmM的PBS缓冲液稀释30倍，使最终样品液中ZEN的浓度为5?5000pg/mL。参照实施步骤①，2h后进行拉曼检测。以样品液中ZEN浓度的对数为横坐标，以百分SERS信号强度值(饲料溶液中不同浓度的玉米赤霉烯酮的SERS强度B和Opg/mL玉米赤霉烯酮的SERS强度Btl的比值，B/BJ为纵坐标，得到ZEN浓度与百分SERS信号强度值的校正曲线:Y = 67.31-15.441og10X, R2 =0.9969，其中，Y表示B/BQ，X表示ZEN浓度；如图3所示。
[0069]利用日本Nippon Optical System公司的显微拉曼光谱仪获得拉曼信号强度,进而求得百分SERS信号强度值，从校正曲线读出稀释的ZEN样品液的浓度，乘以相应的稀释倍数即为饲料样品中ZEN的实际浓度。从表I可以看出，玉米赤霉烯酮的平均回收率为97.69%，平均相对标准偏差(RSD)为8.1 %，说明本发明具有很高的准确性和灵敏度。
[0070]表1竞争性表面增强拉曼散射(SERS)方法检测饲料样品中ZEN的回收率
[0071]
【权利要求】
1.一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将拉曼信号分子和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，用BSA封闭剩余活性位点，做成金纳米探针； (2)将玻片进行清洗，再用水虎鱼溶液浸泡，然后依次用硅烷和醛处理，使其硅烷化和醛基化，使表面充满醛基，和抗原ZEN-BSA偶联，最后用BSA进行封闭，得到固定抗原偶联物的基底；其中，玻片每经过一个处理都要用超纯水清洗和氮气吹干； (3)往空白饲料中添加ZEN标准溶液，混匀，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，最终用PBS缓冲液溶解ZEN，制成一系列浓度梯度的样品液； (4)将步骤(1)的金纳米探针分别和步骤(3)制成的一系列浓度梯度的样品液同时滴到步骤(2)得到的固定抗原偶联物的基底上，则样品液中的ZEN和基底表面的ZEN-BSA竞争性的和胶体金表面的ZEN单克隆抗体结合； (5)根据ZEN浓度和拉曼信号强度的对应关系，绘制校正曲线； (6)取待测样品，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，并用PBS缓冲液稀释，根据该待测样品获得的拉曼信号强度，通过步骤(5)的校正曲线快速得到该待测样品中的ZEN浓度。
2.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的拉曼信号分子为4，4’ -联吡啶。
3.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的胶体金的平均粒径为30nm ； 步骤(1)中所述的胶体金的制备过程包括如下步骤:在不断搅拌下将IOOmLlmM的HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠溶液，等到溶液变成深红色继续沸腾15~20min ;最后冷却至常温,得到30nm的胶体金溶液。
4.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的ZEN单克隆抗体在结合到胶体金表面以前，拉曼信号分子首先标记到胶体金的表面。
5.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的水虎鱼溶液为浓硫酸和30%的过氧化氢，按体积比为7:3进行混合得到，所述百分数为体积百分数； 步骤(2)中所述的硅烷为3-氨丙基-三甲氧基硅烷，用浓度为5%~10%的3-氨丙基-三甲氧基硅烷的甲醇溶液，所述百分数为体积百分数； 步骤(2)中所述的醛为戊二醛，用浓度为2%~4%的戊二醛水溶液，所述百分数是体积百分数。
6.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于: 步骤(2)所述的用水虎鱼溶液浸泡的时间为25~35min ； 步骤(2)所述的用硅烷处理的时间为12~36h ; 步骤(2)所述的用醛处理的时间为4~8h ; 步骤(2)所述的和抗原ZEN-BSA偶联的时间为2~4h。
7.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的ZEN标准溶液的浓度为0.05~lmg/mL ；步骤⑶中所述的一系列浓度梯度为O、1、10、100和1000pg/mL，其中，Opg/mL为对照； 步骤(4)中所述的金纳米探针和样品液的体积比为1:1。
8.根据权利要求1所述 的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于: 步骤(3)和(6)中所述的用无水甲醇提取，经过分离和纯化，具体步骤如下:取饲料样品，加入无水甲醇与50g/L NaCl溶液后，充分混匀，然后超声提取；抽滤，加入三氯甲烷萃取；分液后，下层的三氯甲烷经无水硫酸钠脱水并收集，将其蒸干，用无水甲醇溶解，然后用PBS缓冲液将其释成一定浓度的饲料样品稀释液。
9.根据权利要求8所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于: 所述的饲料样品、无水甲醇和50g/L NaCl溶液的质量体积比为Ig:6mL:4mL ； 所述的加入三氯甲烷萃取，是分3次进行萃取，每次萃取用的三氯甲烷与饲料样品的体积质量比为4mL:lg ; 所述的用无水甲醇溶解，无水甲醇与饲料样品的体积质量比为ImL:5g。
10.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于:步骤(5)中所述的拉曼信号强度是通过显微拉曼光谱仪测得；所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为lmW，信号收集时间为10 ~60s。
【文档编号】G01N21/65GK103954764SQ201410209776
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】胡勇军, 刘建芝, 董宁, 陶艳敏 申请人:华南师范大学