重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及聚乙二醇化重组人促红素（PEG-EPO）的生产【技术领域】，尤其涉及一种PEG-EPO反应液的光谱检测法以及多个反应液合并前的快速鉴定方法。检测体系为磷酸盐缓冲液和纳米金溶胶显色剂，以及经稀释的PEG-EPO反应液；测定260nm处的吸光度后将吸光度与稀释倍数进行线性拟合并计算吸光度下降系数（k260）。通过比较各反应液的k260值可快速判断各反应液的PEG化反应率是否相同或接近。再结合高效液相色谱的检测结果，可快速得出具有相同k260值的反应液的PEG化反应率。因此，本发明极大地缩短了PEG-EPO反应液合并前的检测分析时间，提高了PEG-EPO药物生产工艺的效率，节省了人力成本和时间成本。且本发明的检测方法具有很好的灵敏度、可靠性和重现性，可应用于PEG-EPO药物的实际生产工艺过程中。
【专利说明】重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及聚乙二醇化重组人促红素的生产【技术领域】，尤其涉及一种重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法及其应用。
【背景技术】
[0002]促红细胞生成刺激剂(Erythropoiesis-stimulatingAgents, ESAs)是对肾性贫血疾病十分有效的治疗药物。ESAs能够从根本上纠正贫血症状，明显地恢复患者的体能，提高患者的生活质量。此外，消除贫血症状可以显著地减少其它相关疾病的发病率和死亡率。不过，由于ESAs的体内半衰期相对较短，因此患者通常需要每周一至三次给药。为了克服这个缺点，近年来，研究人员对重组人促红素(recombinant human Erythropoietin,EP0)的蛋白质结构进行了化学修饰研究，以改善其药代动力学和药效学，从而允许给药频率的减少。与此同时，能够与蛋白质分子发生共价键合的水溶性聚乙二醇化合物(PolyethyleneGlycol, PEG)，已经被成功地应用于改善一些蛋白质药物的药代动力学和降低其免疫原性。经过PEG化修饰的EPO药物(PEG-EPO)，被称为新一代长效ΕΡ0，也已经被成功制备(其化学反应式如图1所示)，并在欧洲等地区成为处方药物。相关的动物研究数据和临床研究结果表明，PEG-EPO具有延长的体内半衰期，与常规EPO相比，能够允许较低的给药频率，可以是两个星期给药一次，甚至是四个星期给药一次。这种不太频繁的给药方式，给予了患者和医疗服务提供者一个很大的便利。特别地，PEG-EPO药物可以在整个治疗周期内，维持患者血红蛋白水平的稳定性，减少了治疗副作用的产生。
[0003]选择合适的PEG试剂和PEG化反应条件，PEG化虽不会对生物分子的活性位点或者生物功能产生明显的影响，但它通常至少会有一定的影响，尤其是当形成多取代PEG化产物时，很有可能对蛋白质的活性位点产生位阻效应，降低其体外活性乃至体内活性。而降低PEG化反应的多取代率，同时提高其单取代率，并从所得反应液中纯化得到单取代产物，则一直都是PEG化蛋白质药物研究过程中的重点和难点。中国专利《聚合物/重组人促红素偶联物》(200710123683.X)，公开了一种PEG-EPO药物的制备方法，其最终产物中不含多取代PEG-EPO产物(mult1-PEG-EPO)。在该专利的实施例中，对所得最终产物进行了动物实验，所得数据证实了其具有长效性。相关的专利《一种单取代PEG-EPO的纯化及制备方法》(201010516922.X)，公开了一种单取代PEG-EPO产物(mono-PEG-EPO)的纯化工艺。在该纯化工艺中，需要采用疏水层析方法，分离mult1-PEG-EPO和mono-PEG-EPO。因此，所得PEG-EPO 反应液中 mult1-PEG-EPO 的含量，以及 mono-PEG-EPO 与 mult1-PEG-EPO 之间的比例，对纯化工艺的整体难度和成本有很大的影响。在保持mono-PEG-EPO产量的较高水平的同时，减少mult1-PEG-EPO的产量，可以显著地节省纯化工艺的处理时间和物料成本。另一个专利《回收促红细胞生成素的方法》(201210313863.5)，公开了一种从PEG-EPO反应液中回收未反应的EPO蛋白质的方法。在该专利的实施例中，对回收得到的EPO进行了 PEG化反应测试，所得单取代率为35.5 %，多取代率为4.4%，说明了回收的EPO仍然具有较强的PEG化反应活性。在此反应结果中，虽然mono-PEG-EPO的产量较低，但是mono-PEG-EPO与mult1-PEG-EPO之间的比例很高，对后续的纯化工艺具有明显的好处。进一步研究结果表明，采用专利《重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法》(201210257542.8)所公开的EPO的PEG化方法，可以有效地将所得回收EPO的单取代率提高到40%以上，总反应率大于60%。这说明了，EPO的PEG化反应液中的游离EPO仍然具有一定的PEG化反应活性。
[0004]而如果要尽可能地充分利用EPO的反应活性，那么就需要建立一种对EPO的PEG化反应液的快速检测方法，以对反应条件作出适当的调整，进而把反应液中的游离EPO进一步PEG化。目前，对EPO的PEG化反应液的检测方法主要是色谱方法和电泳方法。例如，郝素娟等人(高等学校化学学报，2010，31 (11)，2239?2245)在进行EPO的PEG化反应时，首先加入过量甘氨酸终止反应，然后取样进行高效凝胶过滤色谱分析，最后由各产物峰面积经软件计算所得反应液的单取代率和多取代率。A.阿布乔夫斯基等人(中国专利200780037291.X)在进行EPO的PEG化反应时，用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对所得反应液进行检测，确定最终产物是比例大致相等的mono-PEG-EPO和mult1-PEG-EPO。此外，ApollonPapadimitriou (美国专利US7169754B2)在进行EPO的PEG化反应时，对所得反应液用离子交换色谱等工艺进行纯化后，用色谱和电泳鉴定所得产物，得出纯化前的PEG-EPO反应液的单取代率为40%，多取代率为38%，游离EPO含量为20%。黎雄辉等人(中国专利，201010516922.X)在进行EPO的PEG化反应时，在反应后马上取样作HPLC检测，结果表明所得PEG-EPO反应液的单取代率为50%，多取代率为18%，游离EPO含量为32%。以上检测方法，虽然可以对所得PEG-EPO反应液进行定性检测和定量检测，但是都存在步骤复杂、耗时长、只能在反应结束后再进行检测等问题。
[0005]同时，在进行PEG-EPO药物的大规模生产，比如制备1800mg EPO反应量的PEG-EPO反应液时，可以采用“少量多次反应，再合并得到一个批次反应液”的合成方案，即首先进行一个5mg EPO反应量的预反应，然后再进行一个200mg与四个400mg EPO反应量的PEG化反应，最后把所得EPO的PEG化反应液进行合并得到一个批次的1800mg EPO的PEG化反应液。也就是说，在整个PEG-EPO的药物生产工艺过程中，将连续进行6个EPO的PEG化反应液；而这些制备得到的EPO的PEG化反应液在进行合并前，都必需进行检测，以保证合并后得到的1800mg EPO的PEG化反应液符合生产要求，其中最重要的指标之一就是PEG化反应率。通常采用HPLC方法对各EPO的PEG化反应液的PEG化反应率进行检测，每次检测时间接近lh，鉴于需要检测的EPO的PEG化反应液的数量较大，因此产生了一个检测分析耗时较长的问题，并增加了 PEG-EPO反应液在存放过程中发生质量变化的风险。所以，我们需要开发一种可以对EPO的PEG化反应液的PEG化反应率进行快速检测的分析技术。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是通过紫外光谱检测由纳米金溶胶、磷酸盐缓冲液及EPO的PEG化反应液构成的检测体系，从而提供一种重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，以及应用该光谱检测法对多个重组人促红素聚乙二醇化反应液合并前进行快速鉴定的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]一种重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，包括以下步骤:
[0009]SI稀释:取η份反应液样品，将反应液样品按不同的稀释倍数进行稀释，得到η种不同浓度的稀释液，且n ^ 3。
[0010]优选的，所述水为注射用水，所述η = 3，所述稀释倍数分别为4倍、8倍和10倍。
[0011]S2配置检测体系:将各稀释液与磷酸盐缓冲液和纳米金溶胶于不同的比色管中混合，并用水定容至刻度得到具有不同浓度的检测液，然后将检测液显色5min以上；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10-60mM，pH为5.0-8.0 ;所述纳米金溶胶的浓度为1.0X10_n-6.0X10_9mOl/L;所述磷酸盐缓冲液、纳米金溶胶和稀释反应液的体积比为2:1:1。所述水为注射用水。
[0012]优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为40mM，pH为7.0 ;纳米金溶胶的浓度为
3.0X l(T9mol/L ;纳米金溶胶的粒径为15_25nm ;检测液显色5_20min。
[0013]S3、检测:用紫外光谱仪测各检测液在260nm处的吸光度A26(l。
[0014]S4、数据处理:将各检测液的吸光度A26tl及稀释倍数进行线性拟合，得拟合曲线A260 = ax+b, X为反应液的稀释倍数；取a的绝对值得吸光度下降系数K26(l。也可以将a的绝对值乘以10000后所得数值设为吸光度下降系数κ26(ι。
[0015]一种应用以上光谱检测法的多个重组人促红素聚乙二醇化反应液合并前的快速鉴定方法，包括以下步骤:
[0016]SI紫外检测:对每个反应液分别依次进行如权利要求1所述的稀释、配置检测体系、检测和数据处理四个 步骤，得到每个反应液的吸光度下降系数κ26(ι。
[0017]S2高效液相色谱检测:用高效液相色谱仪检测其中一个反应液的聚乙二醇化反应率；该反应液为基准反应液。
[0018]S3、比较:将其它反应液的吸光度下降系数K26tl与基准反应液的吸光度下降系数1(26(|比较，具有相同吸光度下降系数k26(l的反应液的聚乙二醇化反应率相等或相差±1.5%。
[0019]S4合并-验证:根据各反应液的吸光度下降系数K26tl的比较情况，将可混合到一起的各反应液合并得到合并液，然后用高效液相色谱仪检测合并液的聚乙二醇化反应率。
[0020]以上所述高效液相色谱检测的检测条件为:流动相是浓度为50mM，pH为6.8的磷酸盐缓冲液；检测波长为280nm ;流速为0.5mL/min。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明通过使用纳米金溶胶为显色剂，可显著地提高反应液的紫外吸光度，明显提高了检测的灵敏度。并将反应液进行多级稀释，可降低反应液中PEG对紫外检测的影响，从而提高检测结果的准确性。根据检测结果计算吸光度下降系数，可快速比较各反应液的PEG化反应率；再结合其中一个反应液的HPLC的检测结果进行比较，可快速鉴定各反应液的PEG化反应率，从而可快速判断是否可合并相应的反应液。通过本发明的检测方法可减少PEG-EPO药物生产过程中的HPLC检测次数，因此可极大缩短反应液合并前的检测分析时间，提高了 PEG-EPO药物生产工艺的效率，节省了人力成本和时间成本。且本发明的检测方法具有很好的灵敏度、可靠性和重现性，可应用于PEG-EPO药物的生产中。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为EPO的PEG化反应式(使用带有甲基端基的PEG试剂)；
[0023]图2为实验一所得EPO的PEG化反应液的HPLC检测结果；[0024]图3为由实验一的EPO的PEG化反应液分离出的EPO的MS检测结果；
[0025]图4为由实验一的EPO的PEG化反应液分离出的单取代PEG-EP0产物的MS检测
结果;
[0026]图5为实验一的EPO的PEG化反应液的电泳检测结果；
[0027]图6为实验一的EPO的PEG化反应液的圆二色谱检测结果；
[0028]图7为实验一的EPO的PEG化反应液的UV-Vis检测结果；
[0029]图8为NGP的UV-Vis检测结果；
[0030]图9为NGP的TEM检测结果(标尺为IOOnm)；
[0031]图10为NGP的TEM检测结果(标尺为20nm)；
[0032]图11为NGP在pH7.0PBS中的TEM检测结果；
[0033]图12为NGP与EPO的PEG化反应液的混合物在pH7.0PBS中的TEM检测结果；
[0034]图13为NGP与EPO的PEG化反应液在pH7.0PBS中的UV-Vis检测结果；
[0035]图14为NGP与EPO的PEG化反应液在pH7.0PBS中的⑶检测结果；
[0036]图15为NGP与EPO原液在pH7.0PBS中的CD检测结果；
[0037]图16为NGP与PEG在pH7.0PBS中的UV-Vis检测结果；
[0038]图17为以NGP为显色剂定量检测PEG溶液浓度的UV-Vis检测结果；
[0039]图18为NGP与EPO在pH7.0PBS中的UV-Vis检测结果；
[0040]图19为以NGP为显色剂定量检测EPO溶液浓度的UV-Vis检测结果；
[0041 ]图 20 为 NGP 与 mono-PEG-EPO 在 pH7.0PBS 中的 UV-Vis 检测结果；
[0042]图21为外加EPO溶液对PEG检测的干扰效应的UV-Vis检测结果；
[0043]图22为EPO与PEG相互之间的干扰效应的UV-Vis检测结果；
[0044]图23为EPO的PEG化反应液多级稀释实验的UV-Vis检测结果。
【具体实施方式】
[0045]为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
[0046]本发明使用的主要化学试剂包括:磷酸二氢钠(NaH2PO4.2Η20,药用级)；磷酸氢二钠(Na2HPO4.2Η20，药用级)；氢氧化钠(NaOH，药用级)；盐酸(HC1，分析纯)；氯金酸(HAuCl4, CAS 号为:16903-35-8，分子量为:339.79g/mol,);柠檬酸三钠(C6H5Na3O7.2H20，分析纯)。
[0047]EPO原液来自深圳赛保尔生物药业有限公司；PEG试剂(GLUC-PEG-NHS，平均分子量为36097Da)，来自北京键凯科技有限公司。
[0048]实验一:ΕΡ0的PEG化反应
[0049]用50mL塑料离心管，加入4.89mLEP0原液(蛋白质含量为3.07mg/mL,共15mg),以及10.llmLpH7.0的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为lmg/mL。准确称量300mgGLUC-PEG-NHS,加入3.0mL2mM且pH3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，迅速混匀。所得混合液被放置于振荡器上，室温振荡反应I小时。由此，得到无色、透明、澄清的PEG-EPO反应液。备用。
[0050]实验二:ΕΡ0的PEG化反应液的HPLC检测[0051]以实验一所得的EPO的PEG化反应液为样品，取样作HPLC检测。检测条件为:GEsuperpose6分析柱；岛津HPLC, PDA检测器，LC Solution工作站；PBS缓冲液作流动相,浓度为50mM，pH为6.8 ;检测波长为280nm ;上样量为20 μ L ;流速为0.5mL/min。检测结果如图2所示。从图2可以发现，在所得的PEG-EPO反应液中，除了游离EPO(保留时间为:34.043min)以外，还有至少三种不同的PEG-EPO产物(保留时间分别为:25.318min(单取代)、21.416min (二取代)和14.876min (三取代))，而且其分子极性比较接近。以图2的峰面积进行积分计算，结果表明，所得EPO的PEG化反应液中的游离EPO含量约为25%，单取代率约为50%，多取代率约为25%。也就是说，在该反应中，EPO的PEG化反应率约为75%。
[0052]实验三:游离EPO和单取代PEG-EPO产物的质谱检测
[0053]依照实验二的检测结果(图2)，将实验一所得的EPO的PEG化反应液进行纯化处理，得到纯净的游离EPO (HPLC保留时间为:34.043min)和单取代PEG-EPO产物(HPLC保留时间为:25.318min)，然后分别取样作质谱(MS)检测。检测标准是中国药典(2010版)二部附录IX J质谱法，检测仪器是MALD1-T0F-MS。检测结果如图3和图4所示。从图3、图4可以发现，纯化得到的游离EPO和单取代PEG-EPO产物的质谱检测结果分别是:29673和65131。同时，考虑到实验一中的PEG试剂的平均分子量为36097，因此证明了 EPO的PEG化反应是成功的，并且单取代PEG-EPO产物是反应的主要产物。
[0054]实验四:ΕΡ0的PEG化反应液的电泳检测
[0055]以实验一所得的EPO的PEG化反应液为样品，取样作电泳检测。按中国药典方法进行检测，检测结果如图5所示。图5的结果表明，在EPO的PEG化反应液中，除了游离EPO (分子量为30KD?45KD)以外，还有至少两种不同的PEG-EPO产物(分子量为66KD?106KD (单取代)、大于106KD ( 二取代))。由于PEG在溶液中会发生膨胀，从而导致PEG-EPO分子在电泳图上的分子量会比实际上的分子量要大，因此图5的电泳结果与图2的HPLC检测结果基本一致。
[0056]实验五:ΕΡ0的PEG化反应液的圆二色谱检测
[0057]以实验一的EPO原液，以及所得的EPO的PEG化反应液为样品，取样作圆二色谱(CD)检测。按常规方法进行检测，检测仪器是Chirascan型圆二色谱仪，检测结果如图6所示。从图6可以发现，PEG-EPO反应液与EPO原液的圆二色谱非常相似，即两个样品的蛋白质二级结构很接近。这说明了 EPO的PEG化反应，并没有明显地改变EPO的蛋白质二级结构。
[0058]实验六:ΕΡ0的PEG化反应液的紫外_可见光吸收光谱检测
[0059]以实验一所得的EPO的PEG化反应液为样品，取样作紫外-可见光吸收光谱(UV)检测。按照中国药典方法检测，扫描范围为200?700nm，检测结果如图7所示。从图7可以发现，EPO的PEG化反应液在可见光区内没有明显的吸收峰，同时在紫外光区260 土 Inm处有一显著的吸收峰。参考文献(杨瑞娥等，聚乙二醇化学修饰重组人粒细胞集落刺激因子技术研究)，这一紫外吸收峰是由PEG基团产生的，包括未与EPO结合的PEG分子以及PEG-EPO产物中的PEG部分。
[0060]实验七:制备及检测不同PEG化反应率的EPO的PEG化反应液
[0061]为了研究应用紫外-可见光吸收光谱(UV-Vis)检测EPO的PEG化反应率的可行性，首先制备了 5种经HPLC检测证明具有不同的PEG化反应率的EPO的PEG化反应液，然后取样作UV-Vis检测。
[0062]制备具有不同的PEG化反应率的EPO的PEG化反应液的方法如下:与实验一基本一致，不同之处在于分别往反应前的lmg/mLEPO溶液中加入0.00,0.05,0.10,0.15和
0.20mL的40mM碳酸氢铵溶液，混匀。反应完毕后，分别取样作HPLC测试(按实验二的方法)和UV-Vis测试(按实验六的方法)，结果列于表1。
[0063]表1不同PEG化反应率的EPO的PEG化反应液的HPLC和UV-Vis检测结果
[0064]
【权利要求】
1.一种重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，包括以下步骤: SI稀释:取η份反应液样品，用水将反应液样品按不同的稀释倍数进行稀释，得到η种不同浓度的稀释液，n ^ 3 ； S2配置检测体系:将各稀释液与磷酸盐缓冲液和纳米金溶胶于不同的比色管中混合，并用水定容至刻度得到具有不同浓度的检测液，然后将检测液显色5min以上；所述磷酸盐缓冲液的浓度为10-60mM，pH为5.0 — 8.0 ;所述纳米金溶胶的浓度为1.0X 10—11 —6.0X 10_9mol/L ;所述磷酸盐缓冲液、纳米金溶胶和稀释反应液的体积比为2:1:1; 53、检测:用紫外光谱仪测各检测液在260nm处的吸光度A26tl； 54、数据处理:将各检测液的吸光度A26tl及稀释倍数进行线性拟合，得拟合曲线A260=ax+b, X为稀释倍数；取a的绝对值得吸光度下降系数k26(l。
2.根据权利要求1所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，步骤SI和步骤S2中所述水为注射用水。
3.根据权利要求2所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，步骤SI中所述稀释倍数分别为4倍、8倍和10倍。
4.根据权利要求3所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，步骤S2中所述磷酸盐缓冲液的浓度为40mM，pH为7.0。
5.根据权利要求4所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，步骤S2中所述纳米金溶胶的浓度为3.0X 10_9mol/L。
6.根据权利要求5所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，骤S2中所述纳米金溶胶的粒径为15-25nm。
7.根据权利要求6所述重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法，其特征在于，步骤S2中所述检测液显色5-20min。
8.—种多个重组人促红素聚乙二醇化反应液合并前的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: SI紫外检测:对每个反应液分别依次进行如权利要求1所述的稀释、配置检测体系、检测和数据处理四个步骤，得到每个反应液的吸光度下降系数k26(l ； S2高效液相色谱检测:用高效液相色谱仪检测其中一个反应液的聚乙二醇化反应率；该反应液为基准反应液； S3、比较:将其它反应液的吸光度下降系数k26(l与基准反应液的吸光度下降系数k26(l比较，具有相同吸光度下降系数k26(l的反应液的聚乙二醇化反应率相等或相差±1.5%。
9.根据权利要求8所述一种多个重组人促红素聚乙二醇化反应液合并前的快速鉴定方法，其特征在于，还包括合并-验证步骤，即将不同的反应液合并得到合并液，然后用高效液相色谱仪检测合并液的聚乙二醇化反应率。
10.根据权利要求9所述一种多个重组人促红素聚乙二醇化反应液合并前的快速鉴定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件为:流动相是浓度为50mM，pH为6.8的磷酸盐缓冲液；检测波长为280nm ;流速为0.5mL/min。
【文档编号】G01N21/33GK104007079SQ201410159182
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】张涤平, 陈贤光, 张向荣, 吴园园, 王康, 黄俊龙, 黄健, 盛光阳 申请人:深圳赛保尔生物药业有限公司