一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，采用纸片扩散法，抑菌测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及杀螟杆菌均有抑制作用，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用，具有广谱抑菌作用，用于消炎药、含片、饮料、食品添加剂、湿纸巾等的制作。
【专利说明】一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于临床医学【技术领域】，尤其涉及一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法。
【背景技术】
[0002]细叶黄皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.),芸香科植物，俗称鸡皮果，又名细叶黄皮，为柑桔亚科黄皮属多年生常绿大灌木或小乔木，主要分布于南亚热带地区，主产我国广西西南部、云南南部、广东新会及越南北部和菲律宾。细叶黄皮为珍稀佳果，果皮、果肉、果仁均可食用，含有多种氨基酸、维生素及矿物质。在药用方面，果实可助食消暑、消积去滞、祛痰化气、疏通肠胃；枝叶可人药，有引气、健胃、止痛、跌打刀伤、消风肿、去疳积等功能。
[0003]细叶黄皮果实含17种氨基酸、多种维生素以及丰富的铁、钙等营养元素，营养价值高。此外，细叶黄皮枝叶、果实、根茎还具有祛痰化气、消积消滞等药效，有很好的保健功效。
[0004]广西有丰富的细叶黄皮果资源，主要分布在龙州、大新、宁明、扶绥等县。广西西南部群众常将其作调配香料，加工成果皮干、果酱，用于肉类、糕点制作的增香调料。副产品开发种类有限，产品附加值低，为促进当地农民增收，加快少数民族地区脱贫的步伐，对细叶黄皮进行综合利用、提高资源利用率、深层次的开发研究迫在眉睫。
[0005]目前，有关细叶黄皮的化学成分研究已有报道，(汪云松，沈月毛，何红平.河口细叶黄皮化学成分研究[J].有机化学，2003，23(增刊):144.)等从细叶黄皮中提取分离了 5 个化合物，分别为 4_ (3-methoxyphenyl_4-0—D-glucopyanoside) _2_butanone,3- (4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_ (3-methoxypheny1-4-hydroxy)-2-propenoic acid,3_(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic methyl ester,3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid。Wang Yun-song[ffangY S, Huang R, LI N Z al.Coumarins from Clausum-olens Merr[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(7):100143-1-2.]等从细叶黄皮中提取到 7 个化合物，分别为 anisumarin、isoscopoletin、umbelliferone、anisocoumarin H、capnolactone、aurapten 及 7_[ (E)-7' -hydroxy-3' , I' -dimethylocta-2' ，5-dienyloxy]-coumar。(苏秀芳.GC-MS法分析鸡皮果叶挥发油的化学成分[J].安徽农业科学，2008，36 (25):10956-10957.[5]苏秀芳，梁振益.GC-MS法分析山黄皮茎根挥发油的化学成分[J].时珍国医国药2010，21 (6):1540-1542.)等研究表明，细叶黄皮各个部分都含有丰富的挥发油，其主要成分为:芳香类、烯类及酸类。有关细叶黄皮的抑菌活性研究鲜见有报道。
【发明内容】
[0006]本发明实施例的目的在于提供一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，旨在解决缺少有关细叶黄皮对抑菌活性方法的问题。[0007]本发明实施例是这样实现的，一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，该测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括:
[0008]采用纸片扩散法，抑菌测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实、叶、根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、杀螟杆菌及枯草杆菌均有抑制作用。
[0009]进一步，采用倾注平板法测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括以下步骤:
[0010]步骤一，细叶黄皮根提取物的提取，把细叶黄皮根自然晾干，粉碎，用30%的乙醇浸泡10天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存备用；
[0011]步骤二，受试液的制备，分别取细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶剂和经灭菌处理的含5% Tween-80的蒸馏水混合，配制成系列浓度受试液，供最低抑菌浓度测定用；
[0012]步骤三，菌液的制备，分别用无菌棉签蘸取金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化；稀释活化后的菌悬液，进行活菌计数，取得最佳菌悬液浓度约为IO6Cfu.mL-1浓度的细胞悬浮液；
[0013]步骤四，倾注平板法测定最低抑菌浓度，用移液枪吸取不同浓度的受试液各2mL，分别放于无菌空培养皿内，加入融化后并冷却的琼脂培养基13mL，最终体积为15ml，立即混勻，使4种受试液在培养基中的终浓度依次为40mg / mL、20mg/mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、1.25mg / mL、0.63mg/mL、0.31mg / mL、0.16mg/mL ;
[0014]步骤五，待凝固后，用移液枪从5种配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相应的培养皿中，然后进行均匀涂布，于35°C恒温培养，24h后观察结果；如果培养皿无菌落形成则说明有抑菌作用，开始明显长菌则说明该浓度接近MIC值。
[0015]进一步，细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌都具有较强的抑制作用，三个部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌剂量分别为1.25,5.0及2.5mg / mL ;三个部位中石油醚部位对5种供试菌的最低抑菌剂量均为1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0016]进一步，采用纸片扩散法测定测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括以下步骤:
[0017]步骤一，细叶黄皮提取物的提取，细叶黄皮果实及叶洗净，阴干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏；
[0018]步骤二，细菌悬液的制备，分别用无菌棉签蘸取供试菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化；稀释活化后的菌悬液，并进行活菌计数；用无菌水将细菌分别配制成约IO6Cfu.mL—1浓度的细胞悬浮液。
[0019]步骤三，抑菌圈的测定，把小滤纸片放入干燥培养皿中，在120°C下灭菌15min ;将培养基倒入培养皿中，待培养基自然冷却凝固后，用移液枪从每种菌种吸取lOOuL，放入到相应的培养皿中，涂布均匀；将试药浸泡过的滤纸片置于平板内，于35°C培养，18?24h后观察结果；有明显抑菌的测抑菌圈的直径。
[0020]进一步，细叶黄皮果实及叶的乙醇提取物，浓度为1.32mg /片对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌具有较强的抑制作用，果实乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，浓度为1.32mg /片对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌有抑制作用；叶乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同浓度下对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌均有抑制作用。
[0021]进一步，细叶黄皮果实乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位剂量为0.103mg/片以上时对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、杀螟杆菌、枯草杆菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌最敏感，最小抑菌剂量分别为0.006及0.013mg /片；细叶黄皮叶石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇部位对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、杀螟杆菌、枯草杆菌5种供试菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，最小抑菌剂量为0.026mg /片。
[0022]进一步，该细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用，具有广谱的抑菌作用，基于此，细叶黄皮果实、叶、根用于消炎药、含片、饮料、果汁、食品添加剂、营养粉、功能食品、饲料、饲料添加剂、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗发水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加剂、酒类、农药、杀虫剂、消毒剂、湿纸巾的制作。
[0023]本发明提供的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，采用纸片扩散法，抑菌测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、杀螟杆菌及枯草杆菌均有抑制作用，为绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及杀螟杆菌类疾病的临床治疗提供了参考依据。本发明的方法简单，为利用细叶黄皮资源有着非常重要的理论意义和实际应用价值，也可为今后更好地应用于临床提供科学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例提供的采用倾注平板法测定测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法的流程图；
[0025]图2是本发明实施例提供的采用纸片扩散法测定测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0028]本发明提供的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，采用纸片扩散法，抑菌测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯杀螟杆菌及枯草杆菌均有抑制作用；得出了细叶黄皮叶的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯杀螟杆菌及枯草杆菌均有抑制作用；
[0029]通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；
[0030]如图1所示，本发明实施例的采用倾注平板法测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括以下步骤:
[0031]SlOl:把细叶黄皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存备用；
[0032]S102:受试液的制备，分别取细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶剂和经灭菌处理的含5% Tween-80的蒸馏水混合，配制成系列浓度受试液，供最低抑菌浓度测定用；
[0033]S103:菌液的制备，分别用无菌棉签蘸取金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化。稀释活化后的菌悬液，进行活菌计数，取得最佳菌悬液浓度约为IO6Cfu.mL-1浓度的细胞悬浮液；
[0034]S104:倾注平板法测定最低抑菌浓度，用移液枪吸取不同浓度的受试液各2mL，分别放于无菌空培养皿内，加入融化后冷却琼脂培养基13mL，其最终体积为15ml，立即混匀，使4种受试液在培养基中的终浓度依次为40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、
2.5mg / mL、L 25mg/mL、0.63mg / mL、0.31mg / mL、0.16mg / mL ；
[0035]S105:待凝固后，用无菌移液枪分别吸取5种新鲜培养的菌液lOOuL。待培养基凝固后，即成含不同浓度受试品的琼脂平板。用移液枪从5种配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相应的培养皿中，然后进行均匀涂布，于35°C左右恒温培养，24h后观察结果。如果培养皿无菌落形成则说明有抑菌作用，开始明显长菌则说明该浓度接近MIC值。
[0036]本发明的采用倾注平板法测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法具体包括以下步骤:
[0037]1、材料:
[0038]SPH-210A恒温培养振荡器；LDZX_50KBS型立式电热压力蒸汽灭菌器；ZHJH-Cl214B型垂直流超净工作台；GNP_9270型隔水式恒温培养箱；
[0039]氯化钠、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氢氧化钠、丙酮、5% Tween-80的蒸馏水；供试菌种:绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，杀螟杆菌；细叶黄皮根于2010年5月采自于崇左市，自然晾干，粉碎备用；
[0040]2、方法:[0041 ] 2.1细叶黄皮根提取物的提取:
[0042]把细叶黄皮根自然晾干，粉碎，用乙醇浸泡3天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存备用；
[0043]2.2受试液的制备:
[0044]分别取细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶剂和经灭菌处理的含5% Tween-80的蒸懼水混合,配制成系列浓度受试液,供最低抑菌浓度(MIC)测定用；
[0045]2.3菌液的制备:
[0046]分别用无菌棉签蘸取供试菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化。稀释活化后的菌悬液，进行活菌计数，取得最佳菌悬液浓度约为IO6Cfu.mL—1浓度的细胞悬浮液；
[0047]2.4倾注平板法测定最低抑菌浓度:
[0048]用移液枪吸取不同浓度的受试液各2mL，分别放于无菌空培养皿内，加入融化后冷却的琼脂培养基13mL，其最终体积为15ml，立即混匀，使4种受试液在培养基中的终浓度依次为 40mg / mL、20mg / mL、10mg / mL、5mg / mL、2.5mg / mL> 1.25mg / mL、0.63mg / mL、
0.3Img / mL、0.16mg / mL ;待凝固后，用无菌移液枪分别吸取5种新鲜培养的菌液lOOuL。待培养基凝固后，即成含不同浓度受试品的琼脂平板。用移液枪从5种配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相应的培养皿中，然后进行均匀涂布，于35°C左右恒温培养，24h后观察结果。如果培养皿无菌落形成则说明有抑菌作用，开始明显长菌则说明该浓度接近MIC值。
[0049]3、结果与分析:
[0050]按照上述试验方法，用溶剂与含5% Tween-80的蒸馏水混合，将细叶黄皮乙醇提取物及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位依次对半稀释，形成8个系列的浓度，做MIC试验研究。
[0051]实验结果表明，细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌都具有较强的抑制作用。三个部位中石油醚部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌剂量分别为1.25、5.0及2.5mg / mL ;三个部位中石油醚部位对5种供试菌的低抑菌剂量均为1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
[0052]本发明实施例的采用纸片扩散法测定测试细叶黄皮果实、叶提取物抑菌活性的方法包括以下步骤:
[0053]S201:细叶黄皮提取物的提取，细叶黄皮果实及叶洗净，阴干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏。
[0054]S202:细菌悬液的制备，分别用无菌棉签蘸取供试菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化。稀释活化后的菌悬液，并进行活菌计数。用无菌水将细菌分别配制成约IO6Cfu.mL—1浓度的细胞悬浮液。
[0055]S203:抑菌圈的测定,把小滤纸片放入干燥培养皿中，在120°C下灭菌15min。将培养基倒入培养皿中，待培养基自然冷却凝固后，用移液枪从每种菌种吸取lOOuL，放入到相应的培养皿中，涂布均匀。将试药浸泡过的滤纸片置于平板内，于35°C左右培养，18~24h后观察结果。有明显抑菌的测其抑菌圈的直径。
[0056]本发明的具体步骤为:
[0057]1、仪器与材料:
[0058]1.1 仪器:
[0059]ZHJH-C1214B型垂直流超净工作台；LDZX_50KBS型立式电热压力蒸汽灭菌器；GNP-9270型隔水式恒温培养箱；SPH-211B摇床培养箱。
[0060]1.2 菌种:
[0061]绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，杀螟杆菌
[0062]1.3细叶黄皮果实材料的来源:
[0063]细叶黄皮果实及叶摘自广西龙州县响水镇。[0064]2、方法:
[0065]2.1细叶黄皮果实乙醇提取物及各部位提取物的提取:
[0066]细叶黄皮果实及叶洗净，阴干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，减压蒸馏至浸膏状，乙醇浸膏一部分留做抑菌实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到各部位浸膏。
[0067]2.2抑菌实验:
[0068]2.2.1细菌悬液的制备:
[0069]分别用无菌棉签蘸取供试菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化。稀释活化后的菌悬液，并进行活菌计数。用无菌水将细菌分别配制成约IO6Cfu.mL—1浓度的细胞悬浮液。
[0070]2.2.2抑菌圈的测定:
[0071]把小滤纸片^mm)放入干燥培养皿中，在120°C下灭菌15min。将培养基倒入培养皿中，待培养基自然冷却凝固后，用移液枪从每种菌种吸取IOOuL，放入到相应的培养皿中，涂布均匀。将试药浸泡过的滤纸片置于平板内，于35°C培养，18~24h后观察结果。有明显抑菌的测其抑菌圈的直径。
[0072]3、结果与讨论:
[0073]3.1抑菌活性初筛:
[0074]按照上述试验方法，发现细叶黄皮果实及叶的乙醇提取物对5种供试菌具有较强的抑制作用，为了了解抑菌物质所存在的部位，特做了乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位初步抑菌实验，结果表明，果实的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对5种供试菌有抑制作用；叶的乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位在相同浓度下对5种供试菌均有抑制作用。
[0075]3.2提取物的最低抑菌剂量研究:
[0076]为了了解乙醇提取物及其各个部位的抑菌活性强弱，用溶剂溶解乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，稀释，浸泡滤纸片，按照2.2.2进行抑菌活性检测，同时算出滤纸片所含的药液量。
[0077]实验结果表明，细叶黄皮果实乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位剂量为0.103mg/片以上时对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、杀螟杆菌、枯草杆菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位抑菌活性最强，其对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌最敏感，最小抑菌剂量分别为0.006及0.013mg/片；细叶黄皮叶乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对5种供试菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，最小抑菌剂量为0.026mg /片。
[0078]4、结果:
[0079]细叶黄皮果实的乙醇提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用，抑菌成分主要在石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、杀螟杆菌及枯草杆菌作用较强，最小抑菌剂量为0.006mg /片；细叶黄皮叶乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对5种供试菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，最小抑菌剂量为0.026mg /片。
[0080]绿脓杆菌为革兰氏阴性菌，其耐药性强，难以寻找治疗药物，实验结果表明，细叶黄皮果实乙醇提取物的氯仿部位、乙酸乙酯部位及细叶黄皮叶乙醇提取物的乙酸乙酯部位对其抑制作用较大。该细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用，具有广谱的抑菌作用，基于此，细叶黄皮果实、叶、根用于消炎药、含片、饮料、果汁、食品添加剂、营养粉、功能食品、饲料、饲料添加剂、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗发水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加剂、酒类、农药、杀虫剂、消毒剂、湿纸巾的制作。例如:如只要含有细叶黄皮(Clausena anisum-olens (Blanco)Merr.)果实、叶、根所制作的消炎药、含片、饮料、果汁、食品添加剂、营养粉、功能食品、饲料、饲料添加剂、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗发水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加剂、酒类、农药、杀虫剂、消毒剂、湿纸巾的制作及其抑菌方法；细叶黄皮为广西崇左市近几年大力推广种植的经济树种，市内加工厂有十余家。研究表明，细叶黄皮果实、叶提取物具有广谱的抑菌作用，其作为一种植物药，具有安全、无毒的特点，值得深入研究。
[0081]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，该测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法包括: 采用纸片扩散法，测试细叶黄皮果实、叶的乙醇提取物及石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；通过倾注平板法测定细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌的抑制作用；得出了细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌及杀螟杆菌均有抑制作用。
2.如权利要求1所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用倾注平板法测试细叶黄皮根提取物抑菌活性的方法包括以下步骤: 步骤一，细叶黄皮根提取物的提取:把细叶黄皮根自然晾干，粉碎，用30%乙醇浸泡10天，减压蒸馏至浸膏状，得到乙醇提取物，一部分留作实验，一部分依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏，置4°C冰箱保存备用； 步骤二，受试液的制备，分别取细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位，用溶剂和经灭菌处理的含5% Tween-80的蒸馏水混合，配制成系列浓度受试液，供最低抑菌浓度测定用； 步骤三，菌液的制备，分别用无菌棉签蘸取绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养18h，进行菌种活化；稀释活化后的菌悬液，进行活菌计数，取得最佳菌悬液浓度约为IO6Cfi^mr1浓度的细胞悬浮液； 步骤四，倾注平板法测定最低抑菌浓度，用移液枪吸取不同浓度的受试液各2mL，分别放于无菌空培养皿内，加入融化后的琼脂培养基13mL，最终体积为15mL，立即混匀，使受试液在培养基中的终浓度依次为40mg / mL、20mg / mL>IOmg / mL、5mg / mL、2.5mg/mL、1.25mg / mL、0.63mg / mL、0.3Img / mL、0.16mg / mL ； 步骤五，待凝固后，用移液枪从5种配置好的菌液中吸取IOOuL,放入到相应的培养皿中，然后进行均匀涂布，于35°C恒温培养，24h后观察结果；如果培养皿无菌落形成则说明有抑菌作用，开始明显长菌则说明该浓度接近MIC值。
3.如权利要求2所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，细叶黄皮根乙醇提取物及其石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌都具有较强的抑制作用，三个部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌剂量分别为1.25mg / mL、5.0mg / mL及2.5mg / mL ;三个部位中石油醚部位对四种供试菌的最低抑菌剂量均为1.25mg / mL，其次是乙酸乙酯部位。
4.如权利要求1所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，采用纸片扩散法测试细叶黄皮果实、叶提取物抑菌活性的方法包括以下步骤: 步骤一，细叶黄皮果实、叶提取物的提取:细叶黄皮果实及叶洗净，阴干，粉碎，用30%的乙醇浸泡15天，减压蒸馏至浸膏状，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到各部位浸膏； 步骤二，细菌悬液的制备，分别用无菌棉签蘸取供试菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于35°C下摇床培养25h，进行菌种活化，稀释，并进行活菌计数；用无菌水将细菌分别配制成约IO6Cfu.mL-1浓度的细胞悬浮液； 步骤三，抑菌圈的测定，把小滤纸片放入干燥培养皿中，在120°C下灭菌15min ;将培养基倒入培养皿中，待培养基自然冷却凝固后，用移液枪从每种菌种吸取lOOuL，放入到相应的培养皿中，涂布均匀；将试药浸泡过的滤纸片置于平板内，于35°C中培养，24h后观察结果；有明显抑菌的测抑菌圈的直径。
5.如权利要求4所述的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，细叶黄皮果实及叶的乙醇提取物，浓度为1.32mg/片对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌具有抑制作用；果实乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位，浓度为1.32mg/片对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌有抑制作用；叶乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位在相同浓度下对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌5种供试菌均有抑制作用。
6.如权利要求4所述的测试细叶黄皮果实提取物抑菌活性的方法，其特征在于，细叶黄皮果实乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位及乙酸乙酯部位剂量为0.103mg/片以上时对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、杀螟杆菌、枯草杆菌均有抑制作用，乙酸乙酯部位抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌最敏感，最小抑菌剂量分别为0.006及0.013mg/片；细叶黄皮叶乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、杀螟杆菌、枯草杆菌5种供试菌均有抑制作用，其中乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，最小抑菌剂量为0.026mg/片。
7.如权利要求1所述 的测试细叶黄皮提取物抑菌活性的方法，其特征在于，该细叶黄皮果实、叶、根的乙醇提取物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用，细叶黄皮果实、叶、根用于消炎药、含片、饮料、果汁、食品添加剂、营养粉、功能食品、饲料、饲料添加剂、茶、洗面奶、早霜、晚霜、乳液、祛痘水、消炎水、面膜、洗发水(露)、洗衣液(乳)、洗衣粉、肥皂、洗手液(乳)、淋浴液(乳)、牙膏、牙膏添加剂、酒类、农药、杀虫剂、消毒剂、湿纸巾的制作。
【文档编号】G01N33/50GK103913564SQ201410142509
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】苏秀芳 申请人:苏秀芳