一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用单层磷脂膜组装形成α-溶血素七聚体生物纳米孔的方法，本发明将重组有野生型αHL基因的pT7质粒转入到BL21(DE3)pLys中，进行IPTG诱导后，用超滤离心管分子截留法纯化单体蛋白，并在DPhPC单层膜上实现αHL单体蛋白的组装，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了蛋白表达，纯化及组装结果。αHL七聚体生物纳米孔单通道电流记录特征良好。当制备的七聚体纳米孔用于单分子分析时，能够实现无机离子，小分子，DNA，RNA等检测。本发明制备纯化蛋白方法简单、经济、快速，并且可以适用于αHL的各种突变型蛋白，同源以及异源七聚体纳米孔制备。
【专利说明】一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔(proteinnanopore)的方法,属于生物纳米材料领域。
【背景技术】
[0002]纳米孔单分子检测是纳米、生物、化学、电子信息等多学科交叉融汇而成的一种新兴检测技术。α -溶血素(a-Hemolysin, a HL)是金黄色葡萄球菌
aureus)分泌的一种分子量为33.2kD的水溶性蛋白质单体，在磷脂双分子层上可组装成分子量为232.4kD的蘑菇型七聚体蛋白质纳米孔，孔道总长约10nm，该纳米孔结构稳定，能够完整的装载在双层脂膜中不漏电，是理想化的纳米孔检测器件。a HL纳米孔从几何结构上分为cap、cis, stem三大区域，根据其分子结构或原子图谱，在不同部位进行蛋白修饰，可设计并制造出各种性能的蛋白质纳米管，从而研究空间效应、电荷效应等对通道与不同检测物作用的影响，实现单分子水平上的不同分析物的实时检测。分析物可包括:无机离子、有机分子、单链DNA/RNA、蛋白质等。
[0003]目前用于制备a HL纳米孔单体蛋白主要采用体外表达(In Vitro transcriptionand translation, IVTT)方法制备，七聚体纳米孔的组装也基本是在双分子层膜上实现，如:兔血红细胞膜(rabbit red blood cell membrane, rRBCM)、蛋黄卵磷脂、人工脂双层。这些方法步骤繁琐、耗时、所需花费较高，且产量有限，限制了 a HL纳米孔的进一步应用和研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种简单易行、在磷脂单层膜上组装制备aHL蛋白质纳米孔的方法。
[0005]本发明实现过程如下:
1、一种利用单层磷脂膜组装a -溶血素(a -Hemolysin, a HL)蛋白质纳米孔的方法，其特征在于:将a HL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，a HL单体在单层磷脂膜上形成七聚体a HL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到a HL蛋白质纳米孔。
[0006]2、根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)a HL单体蛋白的表达
将a HL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21 (DE3) pLys, IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解；
(2)a HL单体蛋白的纯化
将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管(Millpore)，5000r/min离心IOmin,取下层液体加入截留分子量为30kD (Millpore)的超滤管,5000r/min离心IOmin,取上层液体，即为a HL单体蛋白溶液；(3)aHL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体a HL蛋白质纳米孔
用十六烧配制 DPhPC (憐脂，I, 2-diphytanoyl-sn-glycero_3-phosp- hocholine),即油脂混合液，用细针在DPhPC液体中释放a HL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，a HL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE 电泳；
(4)SDS-PAGE切胶法纯化a HL蛋白质纳米孔
SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶的1/5切下，放入考马斯亮蓝G250染色液中染色，另外4/5胶存于4°C ;将染好的凝胶放入脱色液中脱色，直至蛋白条带清晰可见；将此胶与未染色的凝胶对比，切下aHL蛋白质纳米孔所在区域，加入超纯水，-80°C反复冻融，低温离心收集上清液体，真空冷冻干燥，残留物用超纯水溶解，用SDS-PAGE凝胶分析并进行蛋白定量;
(5)a -溶血素蛋白质纳米孔的检测方法
将预先打好小孔的Teflon膜装在电解槽中央，隔电解槽为两个小槽，用毛细管在孔周围滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在两槽中各添加1400μL的IOmM Tris-HCl (含IM KC1)，并用毛细管滴加磷脂，使液面缓慢没过小孔，用Ag/AgCl电极检测跨膜电势，使膜电流值在120pA，将a HL蛋白质纳米孔加入，采集和分析a HL蛋白质纳米孔单孔电流信号。
[0007]传统方法制备a HL蛋白质纳米孔是利用兔血红细胞膜聚合a HL七聚体，聚合混合物中有过多杂蛋白，不利于后续蛋白孔的纯化。发明人发现在DPhPC单层膜上能够对a HL进行七聚体组装，且易于分离纯化，有利于大量制备a HL七聚体。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为a HL单体蛋白表达及纯化结果在12%的SDS-PAGE电泳结果图；
图2为a HL单体蛋白溶液在油脂混合液中形成单层膜的示意图；
图3为a HL单体蛋白分别在兔血红细胞膜(双层膜)以及单层磷脂膜上形成的七聚体在7% SDS-PAGE的电泳结果图；
图4为切胶纯化后的a HL七聚体蛋白SDS-PAGE结果图；
图5为两种七聚体的单通道记录结果:B C分别为七聚体蛋白在+40mV和+120mV的单通道记录图，其中左边为a HL在rRBCM中形成的七聚体的单通道记录，右边为a HL在油脂混合液中形成的七聚体的单通道记录图。
【具体实施方式】
[0009]以下实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验涉及的仪器为垂直电泳仪，凝胶成像系统以及单分子电子检测系统(主要包括Axon 200B放大器，数-模转化器和函数发生器)。
[0010]具体地说，本发明在单层磷脂膜上组装a HL蛋白质纳米孔包括以下步骤:
(I)a HL单体蛋白的表达
将a HL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21 (DE3) pLys, IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。
[0011](2) aHL单体蛋白的纯化将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管(Mi I Ipore )，5000r/min离心IOmin,取下层液体加入截留分子量为30kD (Millpore)的超滤管,5000r/min离心10min,取上层液体，即为aHL单体蛋白溶液(如图1结果所示)。
[0012](3) aHL单体蛋白在单层磷脂膜上进行七聚体组装
用十六烷配制DPhPC (5-10mM)，用细针在DPhPC液体中释放a HL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成具有单层膜，a HL单体即在单层膜上组装。37°C放置若干时间，11000r/min离心，去上清油层，收集下层液体，进行SDS-PAGE电泳；
图2为a HL单体蛋白溶液在油脂混合液中形成单层膜的示意图。
[0013](4) SDS-PAGE切胶法纯化a HL七聚体蛋白。
[0014]SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶的1/5切下，放入考马斯亮蓝G250染色液中染色，另外4/5胶用保鲜膜封好存于4°C。将染好的凝胶放入脱色液中脱色，直至蛋白条带清晰可见。将此胶与未染色的凝胶对比，用锋利刀片切下aHL七聚体目的蛋白所在区域，加入少量超纯水，_80°C反复 冻融，低温高速离心收集上清液体，真空冷冻干燥，残留物用一定量超纯水溶解，用SDS-PAGE凝胶分析并进行蛋白定量；
图3为a HL单体蛋白分别在兔血红细胞膜(双层膜)以及单层磷脂膜上形成的七聚体在7% SDS-PAGE的电泳结果图，2为a HL在单层膜上的组装，3为a HL在双层膜上的组装。图4为切胶纯化后的a HL七聚体蛋白SDS-PAGE结果图。
[0015](5)单通道电流记录
将预先打好小孔的Teflon膜装在电解槽中央，隔电解槽为两个小槽，用毛细管在孔周围滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合物，在两槽中添加1400μL的IOmM Tris-HCl (含IM KC1)，并用毛细管滴加少量磷脂，使液面缓慢没过小孔，用Ag/AgCl电极检测跨膜电势，使膜电流值约在120pA，将a HL七聚体蛋白加入，采集和分析a HL纳米孔电流信号。
[0016]具体地说，为了测定七聚体的实用性，本发明进行了单通道电流分析，七聚体蛋白质加于电解池顺式端(零电位接地端)，如图5所示，在pH 8.0的IOmM Tris-HCl (含IM KCl)缓冲液中，当所加七聚体蛋白浓度较大时，出现了图5-A所示的电流跳跃式图，此时得到的为多通道。稀释七聚体蛋白浓度直到出现单通道电流，将电压加到+40mV，
5-B分别为双层膜和单层膜上聚合的七聚体的单通道电流值，分别为33.4±1.6pA (n=10)和32.3±2.1pA (n=10),当将电压加到+120mV时，两种蛋白的单通道电流值分别为119±1.8pA (n=10)和120±1.3pA (n=10)。该通道可以稳定数小时，并且两种膜上组装的七聚体在单通道电流以及稳定性方面并没有表现出太大的差异，基本保持一致。据此可以实现对所需检测物的单分子分析。
【权利要求】
1.一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于:将aHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，a HL单体在单层磷脂膜上形成七聚体aHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到a HL蛋白质纳米孔。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤: (1)a HL单体蛋白的表达 (2)a HL单体蛋白的纯化 (3)a HL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体a HL蛋白质纳米孔 用十六烷配制DPhPC，用细针在DPhPC液体中释放a HL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，a HL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE电泳； (4)SDS-PAGE切胶法纯化a HL蛋白质纳米孔。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，将aHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21 (DE3) pLys, IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管(Millpore), 5000r/min离心10min,取下层液体加入截留分子量为30kD (Millpore)的超滤管 ,5000r/min离心10min,取上层液体，即为a HL单体蛋白溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶的1/5切下，放入考马斯亮蓝G250染色液中染色，另外4/5胶存于4°C ;将染好的凝胶放入脱色液中脱色，直至蛋白条带清晰可见；将此胶与未染色的凝胶对比，切下aHL蛋白质纳米孔所在区域，加入超纯水，-80°C反复冻融，低温离心收集上清液体，真空冷冻干燥，残留物用超纯水溶解，用SDS-PAGE凝胶分析并进行蛋白定量。
6.—种检测权利要求1所述方法制备得到的a -溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于:将预先打好小孔的Teflon膜装在电解槽中央，隔电解槽为两个小槽，用毛细管在孔周围滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在两槽中各添加1400μL的IOmM Tris-HCl(含IM KC1)，并用毛细管滴加磷脂，使液面缓慢没过小孔，用Ag/AgCl电极检测跨膜电势，使膜电流值在120pA，将a HL蛋白质纳米孔加入，采集和分析a HL蛋白质纳米孔单孔电流信号。
【文档编号】G01N27/447GK103983487SQ201410142198
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】张亚妮, 张春萍, 王莹, 段静, 亢晓峰 申请人:西北大学