快速定量检测l-fabp的免疫荧光试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片1和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其另一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2或者偶合物垫片5仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，其特征在于：所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记L-FABP抗体偶合物。
【专利说明】快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种快速定量检测L-FABP (肝型脂肪酸结合蛋白)的免疫荧光试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]L-FABP(肝型脂肪酸结合蛋白)属于脂肪酸结合蛋白(FABP)家族的成员之一，是一组低分子量的可以结合长链脂肪酸的高保守性胞质蛋白。根据其组织特异性分布，已经分离出9种不同的FABP，分别为肝型(L-FABP)、小肠型(1-FABP)、心肌型(H-FABP)、脂肪细胞型(A-FABP)、表皮型(E-FABP)、回肠型(I1-FABP)、脑型(B-FABP)、髓鞘型(M-FABP)、睾丸型(T-FABP)，主要在肝脏、小肠及肾脏表达。在肾脏中，L-FABP主要表达在近曲小管，在肾脏疾病出现大量蛋白尿、缺血和毒性等损害时，推测L-FABP参与尿夜游离脂肪酸的重吸收，促进β氧化供能，从而减轻氧应激损伤，从而保护肾脏。Yamamoto等人在研究肾脏缺血/再灌注与急性缺血性肾损伤的联系，用缺氧指示剂派莫硝唑显示组织缺氧损伤的范围，结果发现，在缺血/再灌注后2h时，在人L-FABP转基因小鼠和野生小鼠的肾组织中在肾脏外髓质和皮质部均出现派莫硝唑阳性区域，但转基因小鼠的损伤范围明显较小。进一步在缺氧状态下，通过检测转基因小鼠近端小管细胞和非转染细胞中ROS水平，发现转基因小鼠近端小管细胞ROS水平较非转染细胞显著下降，此研究结果提示高表达肾脏可能起到预防近端小管细胞发生缺血/再灌注损伤的作用。L-FABP分子质量较小，只有14.4KD，在肝细胞、肾小管细胞受到损伤时，细胞膜通透性变化可使其快速溢出，因此L-FABP可作为一个敏感、特异的组织损伤标志物，能很好的反应肾小管的损伤。
[0003]在肾脏中，L-FABP最引人注目的临床应用是作为AKI (急性肾损伤)诊断生物标志物。在一项研究尿L-FABP与AKI的关系中，对92例AKI患者与62例无AKI患者进行横断面研究，采用ROC曲线评价L-FABP诊断AKI的能力，ROC曲线下面积为0.93，是一个很好的AKI诊断分子标志物，并且研究指出，尿L-FABP含量越高，病人预后越差。
[0004]另外,近期的研究表明，尿L-FABP可以很好地预测AKI的发生。Portila等人的研究发现，在CBP手术后4h，尿L-FABP的含量在AKI患者中的含量显著高于非AKI患者的L-FABP含量。根据ROC曲线分析，AUC为0.810，可以作为手术后独立预测AKI风险的生物标志物；在一项临床研究中，在感染性休克ICU病人中，约30%左右的ICU病人，被检测出患有AKI，并且结果显示L-FABP作为标志物在判断感染性休克病人并发AKI时，ROC曲线上的AUC高达0.99，除此之外，研究结果还显示，病死患者中尿L-FABP的含量显著高于存活者的尿L-FABP的含量，尿L-FABP的含量与死亡率成显著性正相关，可以说明L-FABP在预测I⑶患者的死亡率方面有着非常好的效果；而在一项造影剂与AKI关系的研究中证实，66患者中有13人在非急诊血管造影前就出现尿L-FABP显著升高；随后，13人都出现了造影剂引发的肾病，尿L-FABP可以作为预测和诊断患者使用造影剂而导致的造影剂急性肾损伤(C1-AKI)。
[0005]随着其它的研究逐步深入，尿L-FABP显示在检测局灶性肾小球坏死、糖尿病肾病、冠脉造影剂所致肾病、心脏转流术后急性肾损伤以及肾脏移植缺血再灌注造成的肾损伤方面，均显示了非常好的预测作用。所以，尿L-FABP可以作为非常好的诊断AKI以及预测AKI的生物标志物。
[0006]免疫突光技术(FluorescenceImmunoassay technique)是以突光分子作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。生物素一亲合素系统(Biotin-Avidin — System，BAS)是一种非常有效的生物反应放大系统。生物素一亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素一亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面:
[0007](I)生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
[0008](2)亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
[0009](3)亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，提高测定的精确度。
[0010](4)生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素一受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。
[0011]目前，检测L-FABP的方法目前主要是酶联免疫技术(ELISA)，ELISA技术存在以下缺点:检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好；检测时间长。因此酶联免疫技术检测L-FABP不适合临床快速诊断。如何能够制作出快速的定量检测设备成为需要迫切解决的问题。
【发明内容】
[0012]本发明的一个目的是提供一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，所述免疫荧光试纸条具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。
[0013]本发明的技术方案是:
[0014]一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片I和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5 —端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其另一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2或者偶合物垫片5仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，其特征在于:所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记L-FABP抗体偶合物。
[0015]进一步地，所述免疫荧光试纸条外包括一外壳10，所述外壳包裹所述胶体金试纸夕卜，露出样本垫片1、硝酸纤维素膜4上检测线7、控制线8、以及吸水垫3。
[0016]进一步地，本发明所述的偶尔物垫片5中荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备包括如下步骤:
[0017](I) Biotin-L-FABP 抗体的制备
[0018]L-FABP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的L-FABP抗体加入准备好的活化的生物素(Biotin)溶液中，搅拌反应，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次冲洗，形成Biotin-L-FABP抗体原液,并计算每个L-FABP抗体可能结合的生物素(Biotin)平均个数。
[0019](2)荧光分子-SAV的制备
[0020]抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)加入荧光分子粉末中反应,反应完成后,将溶液超滤离心浓缩，并多次冲洗，形成荧光分子-SAV原液，并计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的平均个数。
[0021](3)荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备
[0022]将Biotin-L-FABP抗体原液稀释，按照计算的比例加入荧光分子-SAV反应，形成荧光标记的L-FABP抗体偶合物。
[0023]本发明另一目的时还提供一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤:
[0024]步骤一:制备检测线；检测膜2在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线7是将抗L-FABP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥后即得；
[0025]步骤二:制备控制线；所述控制线8是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥后即得；
[0026]步骤三:制备偶合物垫；所述偶合物垫片5的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片5的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将荧光标记的-L-FABP抗体偶合物涂布在偶合物垫片5上，充分干燥即得；
[0027]步骤四:制备样本垫片；所述样本垫片I可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
[0028]步骤五:试纸条的组装；
[0029]在试纸条支撑片4由下而上依次粘附检测膜2、吸水垫片3和偶合物垫片5，在偶合物垫片5上设有第一层玻璃纤维垫片6-1、第二层玻璃纤维垫片6-2或者仅设第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片I ;将上述材料组装后，切成小条，即制的所述定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条。
[0030]或者，在所述免疫荧光试纸条外还包括一外壳，制备成定量检测L-FABP的免疫荧光试纸盒。所述外壳包裹所述胶体金试纸外，露出样本垫片1、硝酸纤维素膜4上检测线7、控制线8、以及吸水垫3。[0031]本发明所述的快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条的工作原理是:采用免疫侧流反应原理，通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的L-FABP抗原首先分别与偶合垫上的L-FABP抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着样本在硝基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区(L-FABP检测线)时，与预先包被在硝基纤维素膜上的抗L-FABP抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测线上。样本中的L-FABP越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检测过程中，未结合的荧光标记的L-FABP抗体偶合物也会随样本在检测膜上层析，当层析至检测膜的控制线时，荧光标记的L-FABP会与预先包被在检测膜上的抗SAV抗体发生反应从而被固定在控制线上。样本中L-FABP浓度与检测线中的荧光光密度值成正比关系O
[0032]当反应结束后，利用检测仪将控制线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值(RI)。然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对L-FABP的浓度进行计算并显示结果，以ng/mL为单位表示。
[0033]本发明所 述快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是本发明快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条的结构示意图。
[0035]其中，1:样品垫片、2:检测膜、3:吸水垫片、4:支撑片、5:偶合物垫片、6_1:第一层玻璃纤维垫片、6-2:第二层玻璃纤维垫片、7:检测线、8:控制线。
[0036]图2是本发明快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸盒的外部结构示意图。
[0037]其中，10:外壳、1:样品塾片、7:检测线、8:控制线、3:吸水塾片。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，不能理解为是对本发明的限制；
[0039]【实施例1】一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条的制备
[0040]如图1所示的一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片
4以及试纸条支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片I和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5 —端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2或者偶合物垫片5仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记的L-FABP抗体偶合物。
[0041]其中，所述偶尔物垫片5中荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备包括如下步骤:
[0042](I) Biotin-L-FABP 抗体的制备:
[0043]L-FABP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的L-FABP抗体加入准备好的活化的生物素(Biotin)溶液中，搅拌反应，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次冲洗，形成Biotin-L-FABP抗体原液,并计算每个L-FABP抗体可能结合的生物素(Biotin)平均个数；
[0044](2)荧光分子-SAV的制备:
[0045]抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)加入荧光分子粉末中反应,反应完成后,将溶液超滤离心浓缩，并多次冲洗，形成荧光分子-SAV原液，并计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的平均个数；
[0046](3)荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备: [0047]将Biotin-L-FABP抗体原液稀释，按照计算的比例加入荧光分子-SAV反应，形成荧光标记的L-FABP抗体偶合物；
[0048]其中，检测膜2在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线7是将抗L-FABP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上；然后将检测膜2充分干燥后即得；
[0049]其中，所述控制线8是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥后即得；
[0050]其中，制备偶合物垫；所述偶合物垫片5的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片5的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将荧光标记的L-FABP抗体偶合物涂布在偶合物垫片5上，充分干燥即得；
[0051]制备样本垫片；所述样本垫片I可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
[0052]试纸条的组装；将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片4上，获得快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条。
[0053]【实施例2】用本发明所述免疫荧光试纸条快速定量检测L-FABP
[0054]取本发明所述快速定量检测L-FABP的免疫突光试纸条,具体如图1所示，包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片I和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5 —端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其另一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2或者偶合物垫片5仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，其特征在于:所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记L-FABP抗体偶合物。按以下步骤进行检测:1)采集的尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片I上，反应。3)判读，将所述免疫荧光试纸条置于(瑞莱)免疫荧光检测仪以及其相关仪器中判定结果。
[0055]【实施例3】用本发明所述免疫荧光试纸盒快速定量检测L-FABP
[0056]取本发明所述快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，具体如图1和图2所示，包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片I和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5 —端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其另一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2或者偶合物垫片5仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，其特征在于:所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记L-FABP抗体偶合物。其中，所述免疫荧光试纸条外包括一外壳10，所述外壳包裹所述胶体金试纸外，露出样本垫片1、硝酸纤维素膜4上检测线7、控制线8、以及吸水垫3。按以下步骤进行检测:1)采集的尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片I上，反应。3)判读，将所述免疫荧光试纸条置于(瑞莱)免疫荧光检测仪以及其相关仪器中判定结果。
【权利要求】
1.一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片(4)以及试纸条支撑片(4)上顺次搭接粘贴的样品垫片(I)、检测膜(2)和吸水垫片(3)，所述样品垫片(I)和检测膜(2)之间设有偶合物垫片(5)，偶合物垫片(5)—端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6-1),其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者偶合物垫片(5)仅一端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，其特征在于:所述检测膜(2)上设有检测线(7)，所述检测线(7)包被有抗L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线(7)另一边设有控制线(8 )，控制线(8 )包被有抗链霉亲和素抗体，所述偶合物垫片(5 )上涂布有荧光标记L-FABP抗体偶合物。
2.根据权利要求1所述的快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，其特征在于，所述免疫突光试纸条外包括一外壳(10),所述外壳包裹所述胶体金试纸外,露出样本垫片(I)、硝酸纤维素膜(4)上的检测线(7) 和控制线(8)、以及吸水垫(3)。
3.根据权利要求1或2所述的快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条，其特征在于:所述偶尔物垫片(5)中荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备包括如下步骤: (1)Biotin-L-FABP 抗体的制备: L-FABP抗体溶于磷酸盐缓冲液中，活化的生物素溶解于二甲基亚砜中保证其活化度，然后把溶于磷酸盐缓冲液中的L-FABP抗体加入准备好的活化的生物素溶液中，搅拌反应，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次冲洗，形成Biotin-L-FABP抗体原液，并计算每个L-FABP抗体可能结合的生物素平均个数； (2)荧光分子-SAV的制备: 抗链霉亲和素粉末溶于磷酸盐缓冲液中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液中的抗链霉亲和素加入荧光分子粉末中反应，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩、冲洗，形成荧光分子-SAV原液，计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素的平均个数； (3)荧光标记的L-FABP抗体偶合物的制备: 将Biotin-L-FABP抗体原液稀释，按照计算的比例加入荧光分子-SAV反应，形成荧光标记的L-FABP抗体偶合物。
4.一种快速定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条的制备方法，其特征在于: 包括如下步骤: 步骤一:制备检测线；检测膜(2)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线(7)是将抗L-FABP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥，即得； 步骤二:制备控制线；所述控制线(8)是将抗链霉亲和素抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥，即得； 步骤三:制备偶合物垫；所述偶合物垫片(5)的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片(5)的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将荧光标记的-L-FABP抗体偶合物涂布在偶合物垫片(5)上，充分干燥即得； 步骤四:制备样本垫片；所述样本垫片(I)可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得； 步骤五:试纸条的组装； 在试纸条支撑片(4)由下而上依次粘附检测膜(2)、吸水垫片(3)和偶合物垫片(5)，在偶合物垫片(5)上设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)、第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者仅设第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片(I);将上述材料组装后，切成小条，即制的所述定量检测L-FABP的免疫荧光试纸条。
【文档编号】G01N33/68GK103941019SQ201410141715
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】赵俊平, 刘红剑, 何晓红, 杨柳 申请人:瑞莱生物工程（深圳）有限公司