一种动态实时测量细胞膜电位的装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种动态实时测量细胞膜电位的装置，包括：用于作为生物传感器的氮化镓（GaN）高电子迁移率晶体管（HEMT）器件、微流室、微注射泵和储液瓶。微流室、微注射泵和储液瓶依次连接，构成一个封闭的循环系统。微流室作为液体流动和细胞注入之用，微流室内的液体通过微注射泵传输给储液瓶。作为生物传感器的HEMT器件与微流室耦合，用于检测所述微流室内细胞在动态条件下的实时细胞膜电位。
【专利说明】—种动态实时测量细胞膜电位的装置
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种动态实时测量细胞膜电位的装置。
【背景技术】
[0002]人体体液流动会对细胞会产生剪应力，进而引起细胞电位的变化。剪切力能影响人体内皮细胞生物学特性的许多方面，与多种心血管疾病相关。因此，检测细胞膜电位是否变化具有重要的生理学和病理学研究意义。
[0003]目前，测量剪切力下的细胞膜电位的方法主要包括荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法。
[0004]荧光染料法是利用荧光强度在剪切力作用下会发生改变，并且与膜片钳得到的细胞膜电位变化趋势相同的性质，来测量细胞膜电位的一种方法。但这种方法反应时间和精度都有较大差距，且目前无法证明荧光强度能够代替细胞膜电位表征细胞的电生理现象。
[0005]微电极阵列法采用集成电路硅工艺，通过微电极阵列能够表征大体积的单个肌细胞或神经细胞的动作电位。但这种方法存在测量准备时间长、测量准确度和灵敏度低的缺点。
[0006]膜片钳方法是目前最常用的方法，它是通过玻璃微电极测量单细胞的膜内外的电压或电流差，并通过一定的放大和转换，得到细胞膜电位。但是这种技术具有以下先天性不足:生物组织是由大量细胞紧密排列形成的，而膜片钳只能测量单细胞，并不能表征实际的多细胞膜电位对剪切力的响应情况；测量时会破坏细胞膜，改变细胞的特性，短时间内细胞将死亡，这样就限制了对细胞膜动作电位以及离子通道早期发生现象的研究；在流体环境下测试时，由于剪切力的存在，细胞容易从膜片钳脱落；膜片钳技术每次只能记录一个细胞(或一对细胞)，每天只能获得的数据量仅为几到几十个，耗时耗力。
[0007]综上所述，荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法均无法解决活体多细胞膜电位的测量问题，来准确表征剪切力对细胞膜电位的影响。
[0008]因此，需要一种具有检测快速、灵敏度高、实时测量、结果准确、生物兼容性高、多细胞活体测量等多重优点的装置及方法，来进行细胞膜电位的测量。
【发明内容】
[0009]因此，为解决现有技术中存在的上述问题而完成了本发明，本发明的目的在于提供一种实时的准确测量剪切力影响的活体多细胞膜电位的装置，该装置使用了氮化镓(GaN)高电子迁移率晶体管(HEMT )器件技术，并与一定的高弹性、表面张力小且高透光率的高分子材料制成的剪切力微流室、微注射泵和储液瓶相连接，能够动态模拟多细胞环境并实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。
[0010]本发明的特点在于用微注射泵来提供动态流体环境，以实现实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。
[0011]本发明装置的基本结构为:将作为生物传感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、储液瓶相连，在微注射泵提供动态流体环境的前提下，通过HEMT器件实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。
[0012]本发明中装置的使用方法为:采用微注射泵与细胞膜电位检测装置连接形成血液动力系统，该系统架设在37°C恒温箱中维持温度稳定，实验中使用PBS作为流体，并且实验全程通入含5%C02的空气以保持流体环境的酸碱度。
[0013]本发明中应用于生物传感器的HEMT器件的结构为:底层为蓝宝石材料，底层向上依次为1.6 μ m左右的GaN缓冲层，1.2nm AlN插入层，8?15nm左右的AlGaN势垒层和
1.5nm GaN帽层，势垒层铝组分在25%?40%之间。帽层以上为Si3N4钝化层，钝化层中间被蚀刻出一块长方形槽状的裸栅区域，裸栅区域无电极弓I出，尺寸在10 μ m?IOmm范围内。
[0014]本发明中HEMT器件的制造工艺为:
[0015](I)台面刻蚀，采用ICP方法刻蚀异质结材料形成器件的台面隔离；
[0016](2)淀积源漏极欧姆金属，采用电子束蒸发的方法获得欧姆金属层，欧姆金属采用Ti/Al/Ni/Au四层结构，并在830°C下退火形成合金，获得良好的源漏极欧姆接触；
[0017](3)采用PECVD方法淀积Si3N4材料作为钝化层；
[0018](4)光刻并采用ICP方法刻蚀Si3N4，露出裸栅区域。
[0019]本发明中微流室的结构为:在HEMT器件上方覆盖了用高分子聚合材料制造的与裸栅相同的槽状图形，槽内安装微流室。微流室材料选用聚二甲基硅氧烷(polydimethyl si loxane, PDMS)材料，除此以外,还可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚酰亚胺(polyimide)等材料。微流室反应室尺寸设计与器件栅极图形保持一致。微流室两侧有封接口，作为液体流动和细胞注入之用。微流室用于培养细胞，培养完成后连接微注射泵，以提供精确的流量控制。微流室两端有两个直径在0.1mm?0.5mm左右的小孔，能够与外部相连。微流室部件与HEMT器件封接，得到一个密闭的通道，溶液能够在通道中流动，形成流体动力学下的细胞膜电位检测装置。
[0020]本发明中微流室的制作工艺为:先采用光刻的方法或反应离子刻蚀(RIE)的方法制造出微流室凸突的阳模，然后在阳模上浇铸PDMS，在约50 V温度下固化后使PDMS从阳模上剥离，即可制得微流室部件。微流室两端的小孔采用钻孔法或其他方法得到。微流室部件与HEMT芯片封接工艺采用热压法或粘合法等方法。
[0021]本发明中活体细胞的分离方法为:在无菌条件下，向以获取的新鲜的人体脐带静脉血中加入lg/L胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置于37°C水浴箱中孵育8min，将消化液收集入离心管，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000r/min离心lOmin，取上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1mL细胞悬液用4g/L台盼蓝染色后作活细胞计数。将2X 104/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液lmL，置于37°C、950mL/L 02、50mL/L CO2培养箱内静置培养，并采用台盼蓝排斥法，将0.1mL混匀的内皮细胞悬液与4g/L台盼蓝0.9mL混匀后，取I滴在显微镜下计数100个细胞。当细胞悬液中细胞存活率大于95%时，可用于进行原代细胞培养。
[0022]本发明中活体细胞的培养方法为:用酒精对HEMT器件消毒后，使用纤连蛋白溶液(fibronectin)进行处理30min,以增强细胞的附着度。并使用PBS冲洗,并接种细胞,使细胞密度达到5000?12000cells/mm2，并保证细胞全程置于含5%C02的37°C恒温箱中。
[0023]本发明中器件裸栅上培养的细胞受到的剪切力由以下公式推导:
【权利要求】
1.一种动态实时测量细胞膜电位的装置，包括:用于作为生物传感器的氮化镓(GaN)高电子迁移率晶体管(HEMT)器件、微流室、微注射泵和储液瓶，其特征在于，将所述微流室、微注射泵和储液瓶依次连接，构成一个封闭的循环系统；所述微流室作为液体流动和细胞注入之用，所述微流室内的液体通过所述微注射泵传输给所述储液瓶，所述作为生物传感器的HEMT器件与所述微流室耦合，用于检测所述微流室内细胞在动态条件下的实时细胞膜电位。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述的HEMT器件由底层到上层的累积层依次为蓝宝石衬底层、GaN缓冲层、AlN插入层、AlGaN势垒层、GaN帽层和Si3N4钝化层；其中所述GaN缓冲层厚度为1.6 μ m左右；所述的AlN插入层厚度为1.2nm ;所述的AlGaN势垒层厚度为.8~15nm左右；所述的GaN帽层厚度为1.5nm ;所述的HEMT器件的势垒层铝组分在25%~.40%之间；所述的HEMT器件的钝化层中间有一块长方形槽状的裸栅区域；所述的HEMT器件的裸栅区域无电极引出，尺寸在10 μ m~IOmm范围内；所述的HEMT器件的上方的覆盖物的材质为高分子聚合材料，形状为与裸栅相同的槽状图形。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述的微流室安装在HEMT器件与高分子聚合材料形成的槽形空间内，微流室反应室尺寸设计与器件栅极图形保持一致。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述的微流室的制造材料选用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS),除此以外，还可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚酰亚胺(polyimide)等材料。；微流室包括其两侧的封接口，微流室与微注射泵连接。
5.一种用于如权利要求1所述的装置的HEMT器件，其制造方法包括步骤: .1)台面刻蚀，即采用ICP方法刻蚀异质结材料形成器件的台面隔离；. 2)淀积源漏极欧姆金属，采用电子束蒸发的方法获得欧姆金属层，欧姆金属采用Ti/Al/Ni/Au四层结构，并在830°C下退火形成合金，获得良好的源漏极欧姆接触； . 3)采用PECVD方法淀积Si3N4材料作为钝化层； . 4)光刻并采用ICP方法刻蚀Si3N4,露出裸栅区域。
6.一种用于如权利要求1所述的装置的微流室，其制造方法包括步骤: 1)采用光刻的方法或反应离子刻蚀(RIE)的方法制造出微流室凸突的阳模，然后在阳模.上浇铸PDMS，在约50°C温度下固化后使PDMS从阳模上剥离，即制得微流室部件； . 2)微流室两端的小孔采用钻孔法得到； .3)微流室部件与HEMT芯片封接工艺采用热压法或粘合法。
7.根据权利要求1所述的装置测量细胞膜电位的方法，所述方法包括步骤: . 1)在无菌条件下，将获取的新鲜的人体脐带静脉血加入lg/L胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置于37°C水浴箱中孵育8min ； .2)将步骤I)得到的液体收集入离心管，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗脐静脉2次，将冲洗后的液体一同收集入离心管，1000r/min离心10min，取上清液，加入完全培养液重悬细胞； .3)取0.1mL细胞悬液用4g/L台盼蓝染色后作活细胞计数； .4)将2X104/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液lmL，置于37°C、950mL/L.02、50mL/L CO2培养箱内静置培养，并采用台盼蓝排斥法，将0.1mL混匀的内皮细胞悬液与.4g/L台盼蓝0.9mL混匀后，取I滴在显微镜下计数100个细胞； .5)用酒精对HEMT器件消毒后，使用纤连蛋白溶液(fibronectin)进行处理30min，并使用PBS冲洗，然后接种细胞，使细胞密度达到5000~12000cells/mm2，并保证细胞全程置于含5%C02的37 °C恒温箱中； 6)采用微注射泵与细胞膜电位检测装置连接形成血液动力系统，该系统架设在37°C恒温箱中维持温度稳定，实验中使用PBS作为流体，并且实验全程通入含5%C02的空气以保持流体环境的酸碱度； 7)器件裸栅上培养的细胞受到的剪切力由以下公式推导:
8.根据权利要求7所述的测量细胞膜电位的方法，所述预先测量为:对在同一晶圆上、且采用相同版图的常规三端HEMT器件，加相同漏源电压VDS，测试其转移曲线(Ve-1D)，得到栅电压在_70mV~OV处对应的器件跨导值。
【文档编号】G01N27/26GK103954658SQ201410133539
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】张鹏, 黄辰, 张毅奕, 马晓华, 郝跃 申请人:西安电子科技大学