一种蛇床子中主要成分含量测定的hplc方法
【专利摘要】本发明涉及一种蛇床子药材中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素含量测定方法，包括：分别制备花椒毒素对照品溶液、异虎耳草素对照品溶液、欧前胡素对照品溶液、蛇床子素对照品溶液和制备蛇床子提取物供试品溶液。色谱柱：Agilent-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈—磷酸缓冲盐溶液（pH=3.5），梯度洗脱；检测温度：40℃；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；分别在250nm和324nm波长下测定对照品溶液和供试品溶液并记录色谱图。该方法具有检测灵敏度高，准确可靠，分离效果好，分析简便快捷等技术特点。
【专利说明】一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药药材领域，具体涉及一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法。
[0002]蛇床子为伞形科植物蛇床(Cnidium monnieri L.Cuss.)的干燥成熟果实，具有温肾壮阳、祛风、散寒、燥湿、杀虫、止痒功效，用于湿痹腰痛，带下，阴痒，阴道滴虫病，皮肤瘙痒，湿疫，宫冷不孕。蛇床子果实中主要含花椒毒素(xanthotoxin)、异虎耳草素(isopimpinellin)、欧前胡素(imperatorin)和蛇床子素(osthole)等具有生物活性的香豆素类化合物，结构式见附图1-4。现代药理学研究表明，蛇床子中香豆素类成分具有抗骨质疏松，抗心律失常，扩张血管、降低血压的作用，免疫抑制作用和抗肿瘤等方面均有作用。临床上蛇床子素软膏治疗婴儿湿疹，起效快、不良反应少。此外，蛇床子素还具有镇痛、局部麻醉和免疫调节等作用。有关蛇床子素含量测定的相关报道很多，《中国药典》2000版一部采用薄层色谱荧光扫描法测定蛇床子药材中蛇床子素的含量；孟凡浩，李遇伯，杨正毅等人，HPLC法同时测定蛇床子中蛇床子素和欧前胡素含量测定-沈阳药科大学学报，2004,21，(5);罗维早，谭瑶，阳勇在专利申请号201010527673.4专利中研究一种从中药蛇床子中提取蛇床子素的方法；连其深发表的蛇床子的化学成分及药理作用研究进展-中药材，2003，26 (2);翁德新，李天傲等关于蛇床子中5种成分的HPLC测定法-中国中药杂志，2007,32 (18)中对蛇床子中花椒毒素、异虎耳草素、香柑内酯、欧前胡素和蛇床子素这5种成分进行同时测定，但该文献中采用乙腈-0.1%的醋酸水溶液作为系统检测的流动相，进行梯度洗脱时，检测灵敏度低，分离效果差，存在一定的缺陷。而本发明中，采用HPLC法同时对蛇床子中的花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素这4种香豆素类成分进行测定，采用乙腈-磷酸盐缓冲液(pH=3.5)作为系统检测的流动相，进行梯度洗脱，检测灵敏度高，4种香豆素类成分分离效果好，分析方法简便快捷，易于操作，重现性好。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种蛇床子中主要成分含量测定的HPLC方法，所述测定方法采用HPLC法在双波长下对蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素4种香豆素类成分进行同时测定，方法操作简便快捷、分离效果好、灵敏度高。为达上述目的，本发明采用了如下技术方案:
一种蛇床子提取物中主要成分含量测定的HPLC方法，其特征在于包括下述步骤:
1)本发明以60-75%的乙醇作为溶剂，优选75%的乙醇为提取溶剂，从中药材蛇床子中提取主要成分；
2)分别制备花椒毒素对照品(四川维克奇生物科技有限公司购买)溶液、异虎耳草素对照品(上海一基生物技术有限公司购买)溶液、欧前胡素对照品(中国药检所，批号110826-201214)溶液、蛇床子素对照品(中国药检所，批号110822-200407)溶液和制备蛇床子提取物供试品溶液；
3)利用HPLC法在双波长下同时检测蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量；
色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相A，磷酸缓冲盐溶液(pH=3.5)为流动相B，梯度洗脱程序为:时间O — 5min — 20min — 40min — 55min ;溶液A:95% — 95% — 65% — 0% — 95% ;溶液 B:5% — 5% — 35% — 100% — 5% ;柱温 25°C "40°C ;体积流量0.8^1.5ml/min ;检测波长为250nm和324nm，进样量Ιμ1~ 15μ1 ;理论塔板数按蛇床子素峰计算不得低于3000 ；
4)根据高效液相色谱分析结果计算蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量。
[0004]进一步地，本发明HPLC方法的色谱条件为:色谱柱为Agilent_C18 (250mmX 4.6mm，5Mm)，流动相为乙腈(A) —磷酸缓冲盐溶液(ρΗ=3.5) (B)，梯度洗脱程序为:时间 O — 5min — 20min — 40min — 55min ;溶液 A:95% — 95% — 65% — 0% — 95% ;溶液 B:5% — 5% — 35% — 100% — 5% ;柱温 40°C ;体积流量 1.0ml/min ;检测波长为 250nm 和324nm ;进样量 10μ1。
[0005]进一步地，本发明HPLC分析方法中，花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品溶液制备方法包括:分别取花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇适量，分别配置成浓度为50、50、800和200(^g/ml的对照品溶液。
[0006]进一步地，本发明HPLC分析方法中，蛇床子提取物供试品溶液制备方法包括:取蛇床子药材粉末约10g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，称重，摇匀，超声波提取3(T40min，放冷，滤过，收集滤液，同法操作2次，合并滤液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，摇匀，微孔滤膜(0.45Mm)滤过，即得。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为花椒毒素 图2异虎耳草素 图3欧前胡素 图4蛇床子素的结构式
图5为本发明蛇床子提取物中主要成分含量测定的HPLC检测图谱(1-花椒毒素，2-异虎耳草素，3-欧前胡素，4-蛇床子素)。
【具体实施方式】
[0008]在下面的实施例中进一步说明本发明的详细分析方法，但本发明并不局限于下述详细分析方法。
[0009]实施例1蛇床子提取物的制备
取蛇床子药材粉末约10g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，称重，摇匀，超声波提取3(T40min，放冷，滤过，收集滤液，同法操作2次，合并滤液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，摇匀，微孔滤膜(0.45Mm)滤过，即得。
[0010]实施例2筛选蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素含量测定的条件。[0011]蛇床子提取物的制备:按照实施例1所述的方法制备
色谱条件的筛选:采用美国Agilent-1260高效液相色谱仪，Chemstation Edition色
谱工作站
色谱柱的选择:依次考察 Thermo C18 柱、Kromasil C18 柱、Phenomenex Luna C18 柱、Agilent C18柱,结果经试验比较，Agilent C18 ( 250mmX4.6mm，5Mm)分离效果最佳。
[0012]流动相:分别考察了乙腈一水、乙腈一0.1%醋酸水溶液、甲醇一水、乙腈一磷酸盐缓冲液(pH=3.5)、甲醇一乙腈-磷酸盐溶液等流动相系统，结果经试验比较，优选乙腈一磷酸盐缓冲液(pH=3.5)梯度洗脱完成以上四种成分的含量测定，结果见附图5。
[0013]检测温度:考察了25°〇、351:、401:不同柱温，以及0.8、1.0、1.2、1.51111/1^11不同流速对各成分分离效果的影响，经过试验比较，优选柱温40°C,流速1.0ml/min时分离效果最佳。
[0014]检测器:选用全波长扫描，对花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素对照品溶液全波长紫外扫描(19(T400nm)，结果测得几种成分的最大吸收波长不等，例如，蛇床子素在210和324nm处有最大吸收，异虎耳草素在245nm、330nm处有最大吸收，欧前胡素在220、250、304nm处有最大吸收。为了同时进行几种成分的含量测定，选择最佳检测波长，采用二极管阵列检测器进行多波长检测，分别使其在最大吸收波长附近进行检测。
[0015]真空泵:SHB-m循环水式真空泵
电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司提供，规格为十万分之一提取溶剂的筛选:分别考察了不同浓度的甲醇和乙醇，其中甲醇提取色谱柱峰型不好，不计算含量，无水乙醇、60%乙醇、75%乙醇提取含量比较结果见表1，结果表明75%乙醇最佳。
[0016]表1不同溶剂提取含量比较
【权利要求】
1.一种蛇床子药材中主要成分含量测定的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征在于以60-75%的乙醇作为溶剂，从中药材蛇床子中提取主要成分，分别制备花椒毒素对照品溶液、异虎耳草素对照品溶液、欧前胡素对照品溶液、蛇床子素对照品溶液和制备蛇床子提取物供试品溶液；利用HPLC法在双波长下同时检测蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量； 色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相Α，磷酸缓冲盐溶液(ρΗ=3.5)为流动相B，梯度洗脱程序为:时间O → 5min → 20min → 40min → 55min ;溶液A:95% →95% →65% → 0% → 95% ;溶液 B:5% → 5% → 35% → 100% → 5% ;柱温 25°C "40°C ;体积流量0.8^1.5ml/min ;检测波长为250nm和324nm，进样量1μ1~ 15μ1 ;理论塔板数按蛇床子素峰计算不得低于3000 ； 对照品溶液的制备:分别取花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇适量，分别配置成浓度为50、50、800、200(^g/ml的对照品溶液； 供试品溶液的制备:取蛇床子药材粉末约10g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，称重，摇匀，超声波提取3(T40min，放冷，滤过，收集滤液，同法操作2次，合并滤液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，摇匀，微孔滤膜(0.45Mm)滤过，即得； 测定法:分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于以60-75%的乙醇为溶剂制备蛇床子提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于优选75%的乙醇为溶剂制备蛇床子提取物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述色谱条件:色谱柱为Agilent-ClS(250mmX 4.6mm，5Mm)，流动相为乙腈(A) —磷酸缓冲盐溶液(ρΗ=3.5) (B)，梯度洗脱程序为:时间 O → 5min → 20min → 40min → 55min ;溶液 A:95% → 95% → 65%→ 0% →95% ;溶液 B:5% → 5% → 35% → 100% → 5% ;柱温 25°C "40°C ;体积流量 0.8~1.5ml/min ;检测波长为 250nm 和 324nm，进样量 ?μL~15μ1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品溶液制备方法包括:分别取花椒毒素对照品、异虎耳草素对照品、欧前胡素对照品和蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇适量，分别配置成浓度为50、50、800和200(^g/ml的对照品溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于蛇床子提取物供试品溶液制备方法包括:取蛇床子药材粉末约10g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密量取60-75%的乙醇50ml，密塞，称重，摇匀，超声波提取3(T40min，放冷，滤过，收集滤液，同法操作2次，合并滤液，置100mL容量瓶中，再用60-75%的乙醇定容，摇匀，微孔滤膜(0.45Mm)滤过，即得。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于根据HPLC分析结果计算蛇床子提取物中花椒毒素、异虎耳草素、欧前胡素和蛇床子素的含量。
【文档编号】G01N30/02GK103884791SQ201410116055
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】彭学东, 张梅, 赵金召, 杨艳丽 申请人:张家港威胜生物医药有限公司